矽肺的生物標誌物及其應用的製作方法

2024-03-30 14:03:05 1

本發明涉及對於矽肺的生物相關聯的生物標誌物的檢測。進一步的，本發明公開了一種矽肺的生物標誌物及其應用，並已鑑定矽肺與乙醯膽鹼酯酶表達降低之間的聯繫，所述生物標誌物還可用於以下目的，比如：可用於早期診斷矽肺的方法、用於評估矽肺級別的方法。

背景技術：

矽肺是在生產過程中長期吸入游離二氧化矽粉塵而引起的以肺部瀰漫性纖維化為主的全身性疾病，是塵肺中進展最快、危害最嚴重的一種。其臨床病理主要表現矽結節、巨噬細胞性肺泡炎及塵性纖維化，確診往往依靠職業病史結合影像學的方法，確診時病變已發展至中晚期，纖維化進程已無法逆轉。因此對於矽肺患者來說，早發現、早治療具有重要臨床意義。

矽肺診斷尚無特異性的臨床生物標誌物。儘管有諸多研究者深入系統研究過脂質過氧化物丙二醛(mda)、白細胞介素-6(il-6)和腫瘤壞死因子-alpha(tnf-alpha)等因子在矽肺發病時的變化趨勢。但是，必須強調的是，在其它炎症疾病發生時上述因子也會有顯著變化。因此，上述因子尚不足以成為矽肺早期診斷的特異性生物標誌物。

技術實現要素：

本發明的一個目的是解決至少上述問題，並提供至少後面將說明的優點。

本發明還有一個目的是提供一種矽肺的生物標誌物及其應用，並已鑑定矽肺與乙醯膽鹼酯酶表達降低之間的聯繫，所述生物標誌物還可用於以下目的，比如：可用於早期診斷矽肺的方法、用於評估矽肺發病階段的方法。

為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了一種用於檢測生物標誌物的表達水平的用品在製備用於指示對象中的矽肺的試劑中的應用，其中所述生物標誌物是乙醯膽鹼酯酶，並且其中所述試劑用於包括如下步驟的方法：

檢測所述對象中乙醯膽鹼酯酶的表達水平；

將所述對象中乙醯膽鹼酯酶的表達水平與乙醯膽鹼酯酶的參比表達水平相比較；和

基於所述比較來指示所述對象中的矽肺；

其中，所述對象中乙醯膽鹼酯酶的表達水平低於乙醯膽鹼酯酶的參比表達水平以指示所述對象中的矽肺。

優選的是，在獲自所述對象的檢測樣品中檢測所述生物標誌物的表達水平。

優選的是，所述檢測樣品為所述對象的血清樣品。

優選的是，所述對象中乙醯膽鹼酯酶的表達水平低於乙醯膽鹼酯酶的參比表達水平的10％以上時指示所述對象為矽肺。

優選的是，所述矽肺包括i期矽肺和ii期矽肺。

優選的是，用於檢測生物標誌物的表達水平的用品還用於檢測編碼乙醯膽鹼酯酶的基因的表達水平。

優選的是，所述對象中編碼乙醯膽鹼酯酶的基因的表達水平低於編碼乙醯膽鹼酯酶的基因的參比表達水平以指示所述對象中的矽肺。

優選的是，用於檢測生物標誌物的表達水平的用品還用於檢測編碼乙醯膽鹼酯酶的胺基酸的表達水平。

優選的是，所述對象中合成乙醯膽鹼酯酶的多肽或多肽片段的表達水平低於合成乙醯膽鹼酯酶的多肽或多肽片段的參比表達水平以指示所述對象中的矽肺。

本發明至少包括以下有益效果：

在本發明中，與用於矽肺的現有臨床生物標誌物(mda、il-6或tnf-alpha)矽肺i期和矽肺ii期病人血清中ache表達水平的差異相比較，矽肺i期和矽肺ii期病人血清中ache表達水平呈逐漸降低趨勢，且隨著矽肺病人的病情加重，ache表達水平呈明顯的階梯式降低趨勢。因此，本申請對檢測樣品中乙醯膽鹼酯酶的表達水平的檢測可以為矽肺早期輔助診斷提供更可靠和靈敏的檢測依據，有助於醫護人員更好的為患者確診是否為矽肺，以及評估矽肺級別。

本發明的其它優點、目標和特徵將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。

應當理解，本文所使用的諸如「具有」、「包含」以及「包括」術語並不配出一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。

本發明提供一種用於檢測生物標誌物的表達水平的用品在製備用於指示對象中的矽肺的試劑中的應用，其中所述生物標誌物是乙醯膽鹼酯酶，並且其中所述試劑用於包括如下步驟的方法：

檢測所述對象中乙醯膽鹼酯酶的表達水平；

將所述對象中乙醯膽鹼酯酶的表達水平與乙醯膽鹼酯酶的參比表達水平相比較；和

基於所述比較來指示所述對象中的矽肺；

其中，所述對象中乙醯膽鹼酯酶的表達水平低於乙醯膽鹼酯酶的參比表達水平以指示所述對象中的矽肺。

一個優選方案中，在獲自所述對象的檢測樣品中檢測所述生物標誌物的表達水平。

一個優選方案中，所述檢測樣品為所述對象的血清樣品。

一個優選方案中，所述對象中乙醯膽鹼酯酶的表達水平低於乙醯膽鹼酯酶的參比表達水平的10％以上時指示所述對象為矽肺。

一個優選方案中，所述矽肺包括i期矽肺和ii期矽肺。

一個優選方案中，用於檢測生物標誌物的表達水平的用品還用於檢測編碼乙醯膽鹼酯酶的基因的表達水平。

一個優選方案中，所述對象中編碼乙醯膽鹼酯酶的基因的表達水平低於編碼乙醯膽鹼酯酶的基因的參比表達水平以指示所述對象中的矽肺。

一個優選方案中，用於檢測生物標誌物的表達水平的用品還用於檢測編碼乙醯膽鹼酯酶的胺基酸的表達水平。

一個優選方案中，所述對象中合成乙醯膽鹼酯酶的多肽或多肽片段的表達水平低於合成乙醯膽鹼酯酶的多肽或多肽片段的參比表達水平以指示所述對象中的矽肺。

下面，本發明人將對已確診的矽肺病人作為實驗組和接塵環境中的工作人員作為對照組進行分別的取樣檢測，用於驗證被檢測對象的血清樣品中乙醯膽鹼酯酶的表達水平的變化確實如本發明所述。

1.對象

隨機選取某煤礦醫院按gbz70—2009《塵肺病診斷標準》確診的男性矽肺觀察對象134例樣本，其中接塵組70人，i期矽肺病人43人，ii期矽肺病人21人，年齡在40歲到50歲之間，工齡在20到30年間。所有的研究對象均有確切的粉塵接觸史、職業史、無重大疾病、無免疫系統疾病，彼此無血緣關係。本研究得到了寧夏醫科大學醫學倫理委員會批准並獲得所有受試者的知情同意。

2.實驗方法

用分離膠/促凝劑真空採血管採集空腹靜脈血5ml，待血清充分分離後，將血清轉移至1.5ml離心管中，立即放入-80℃低溫冰箱。測定前將血清樣品取出並置於冰上緩慢融化，隨後進行各項生化指標的測定。採用比色法測定脂質過氧化物丙二醛(mda)，酶聯免疫吸附法測量白細胞介素-6(il-6)、腫瘤壞死因子-alpha(tnf-alpha)。用ellman方法測定血清中乙醯膽鹼酯酶，用考馬斯亮藍染色法測定血清中的蛋白質。

2.1mda含量測定

使用全自動生化儀(a6，北京松上技術有限公司)直接定標，空白調零，機器上直接讀取結果。mda的測定波長為532nm。

2.2il-6和tnf-alpha含量測定

採用酶聯免疫吸附法(elisa)進行il-6和tnf-alpha含量測定。簡要的操作步驟如下：設置標準品孔和樣本孔，加抗體包被2h後，棄去，用300μl稀釋後洗滌液洗板5次(後續步驟洗板同)，加封閉液200μl，混勻，靜置30min，棄去，洗板，樣本孔中加包被液25μl，待測血清25μl，標準孔中加入6個不同濃度50μl的標準液，加100μl的酶標試劑hrp，靜置1h，棄去，洗板，加顯色液100μl，靜置15min，加終止液100μl後15min內在酶標儀讀取吸光度值。il-6和tnf-alpha的測定波長均為450nm。

2.3ches和ache酶活性的測定

ches和ache的酶活性測定參考ellman等人的實驗方法[6]。簡要的操作步驟如下：6μl血清中加入80μl磷酸氫二鈉(ph＝7.4)，10μl5,5'-二硫雙-2-硝基苯甲酸(12.5mmol·l-1)，ache酶活性測定另加2μl四異丙基焦磷醯胺(10mmol/l)，用雙蒸水補足體積至150μl，室溫避光孵育30min。隨後，加入10μl碘代硫代乙醯膽鹼(12.5mmol·l-1)，40μl雙蒸水。使用全波長酶標儀(multiskango，thermoscientific)測定吸光度，測定波長為412nm。吸光度測定間隔為2min，測定時間持續10min(吸光度在線性範圍之內)。以時間為自變量，吸光度為因變量計算斜率。

2.4考馬斯亮藍染液法測定血清總蛋白

1)繪製標準曲線

將0、2、4、6、8、10μl的牛血清白蛋白(bsa)標準溶液(1mg/l)分別加入到微孔板中，加入雙蒸水補足到20μl，向各微孔加120μl的考馬斯亮藍染液，室溫放置5-10min，多功能微孔板酶標儀測定595nm處的吸光度，記錄讀數，以蛋白濃度為橫軸，相應吸光度值為縱軸，繪製標準曲線。

2)血清中的蛋白濃度的測定

將1μl的血清加入99μl的na2hpo4緩衝液，稀釋100倍，轉移20μl稀釋液到微孔板中，加120μl的考馬斯亮藍染液，混勻室溫放置5-10min，酶標儀測定595nm處的吸光度值，記錄讀數，使用同期標準曲線計算血清蛋白濃度。

3.統計學分析

用spss17.0軟體進行數據統計分析，結果以中位數±四分位數間距的形式表示。服從正態分布的資料，用lsd法做組間兩兩比較。不服從正態分布的數據，用秩和檢驗完全隨機設計多個樣本比較的kruskal-wallish檢驗做組間差異分析，用多個獨立樣本兩兩比較的nemenyi法做組間兩兩比較，以p<0.05為差異具有統計學意義。

結果

1.矽肺患者血清中mda水平的變化

與接塵組相比，矽肺i期和ii期患者的血清中mda水平分別升高36.62％和33.40％，且差異均有統計學意義(p<0.05)，接塵組、矽肺i期和矽肺ii期的mda呈升高趨勢(表1)。

表1接塵組和病例組兩項經典指標比較

*表示與接塵組相比，p<0.05，差異有統計學意義。

2.矽肺患者血清中il-6水平的變化

與接塵組相比，矽肺i期和ii期患者的血清中il-6水平分別升高27.71％和25.25％，且差異均有統計學意義(p<0.05)，接塵組、矽肺i期和矽肺ii期il-6呈升高趨勢(表2)。

3.矽肺患者血清中tnf-alpha水平的變化

與接塵組相比，矽肺i期患者血清中tnf-alpha水平升高12.37％，差異有統計學意義(p0.05)；與接塵組相比，矽肺i期和矽肺ii期tnf-alpha呈升高趨勢(表2)。

表2接塵組和病例組細胞因子指標比較

*表示與接塵組相比，p<0.05,差異有統計學意義。

4.血清ache水平的變化

結果如下表3所示：與接塵組相比，矽肺i期患者血清中ache的水平降低了10.5％，差異有統計學意義(p<0.05)；與接塵組相比，矽肺ii期患者血清中ache的水平降低了20.2％，差異有統計學意義(p<0.05)

表3接塵組和病例組血清中乙醯膽鹼酯酶(ache)活性的變化

*表示與接塵組相比，p<0.05，差異有統計學意義

由上述統計學分析結果的表1-表3可知，在本發明中，一方面，與接塵組相比，矽肺i期和矽肺ii期病人血清中mda水平、il-6水平和tnf-alpha水平有所變化。但是，隨著矽肺病人的病情加重，其表達水平並未呈現顯著的階梯式降低趨勢。另一方面，與接塵組相比，矽肺i期和矽肺ii期病人血清中ache表達水平呈降低趨勢，而且隨著矽肺病人的病情加重，ache表達水平呈顯著的階梯式降低趨勢。這一結果顯示，乙醯膽鹼酯酶作為矽肺早期輔助診斷中提供更可靠和靈敏的檢測結果，檢測乙醯膽鹼酯酶的表達水平有助於更好的確診是否為矽肺，以及評估矽肺級別，膽鹼酯酶可以成為矽肺早期輔助診斷綜合評價體系的重要分子之一。

儘管本發明的實施方案已公開如上，但其並不僅僅限於說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用於各種適合本發明的領域，對於熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離說明書及等同範圍所限定的一般概念下，本發明並不限於特定的細節和這裡示出與描述的實施例。