一種用雷射分選提取液相細胞內物質的技術的製作方法
2024-03-09 09:13:15 2
專利名稱：一種用雷射分選提取液相細胞內物質的技術的製作方法
技術領域：
本發明涉及生命科學領域，特別是一種用雷射分選提取液相細胞內物質的技術。
背景技術：
現有的細胞內物質分離方法主要有三種流式細胞儀(FACS)、玻璃微針法和雷射彈射技術(LPC)。
流式細胞儀(FACS)分選效率高，廣泛用於大量細胞或細胞內組分的分離與富集。但其樣品製備過程繁瑣，而且由於是在非目視狀態下分離，對分離對象有嚴格的要求。當被分選的細胞器大小的區別不夠明顯時，通過流式細胞儀得到的樣品純淨度較差，仍然含有幾種不同染色體的混合物。
玻璃微針法1981年Scanlenghe等最早採用玻璃微針挑出果蠅中期染色體鋪片中的單條染色體，目前已有應用。但該方法操作難度大，對使用人員的實驗技能要求很高，因此效率低，不易推廣。特別是這種方法只能用於對鋪片染色體的分離與挑選，生物樣品已失去活性。
雷射彈射技術(LPC)類似於玻璃微針挑取法。先進的雷射彈射技術大大降低了對操作者實驗技能的要求，但同樣只能在幹的鋪片上操作，存在影響生物組織活性的問題，而且要求專用樣品製備膜，價格昂貴，推廣應用受到限制。
以上方法共同存在的缺點是，分選的樣品都是已經從細胞中提取出來的細胞內物質，細胞的活性已經受到幹擾或失去活性。
本發明的目的在於解決上述問題，提出一種新的具有高選擇性，無損傷的液相中細胞內物質分選提取的方法，在保持細胞活性的情況下實現細胞內物質的實時分選，提取目標物質。
發明內容
本發明的技術解決方案是一種用雷射分選提取液相細胞內物質(以下簡稱細胞器)的技術，其特徵是用兩束雷射，即光刀(雷射微束)和光鑷(光阱)對細胞或細胞器進行有目的的損傷和分選，通過計算機控制載有樣品的樣品載物臺在顯微鏡工作範圍內實現微米精度操控，顯微操作分選過程由攝錄系統實時顯示於視屏上並記錄存儲。
具體分離方法是使待分離的細胞隨樣品載物臺移至光刀在視場中的作用位點，用光刀對細胞膜或結構進行破壞，釋放出細胞內物質。移動樣品載物臺，使被選中的目標細胞器隨樣品載物臺移至光鑷在視場中的光阱中心，細胞器被光鑷俘獲。再次移動樣品載物臺，周圍的雜質及細胞殘骸隨樣品載物臺一起運動，而被光鑷俘獲的細胞器由於受到光阱的束縛而固定不動，實現目標細胞器與周邊環境的相對運動，用這種方法把該細胞器相對移動到一個比較空曠的視場中，遠離細胞碎片，與其它細胞或細胞殘骸的完全分離；最後用微吸管或微分選室，從樣品中提取被光鑷俘獲的目標細胞器，完成分選工作。
雷射光鑷是20世紀80年代新發展起來的生命科學研究手段，主要用於在微米、亞微米尺度上對單個的細胞器，包括細胞、細胞器以及生物大分子進行顯微操作和研究，該方法一經出現就在生命科學，基因工程，分散體系，大氣汙染，微機械等領域得到應用。本發明是綜合了光鑷和光刀的全光學生物微操作、微加工技術，在對微米、亞微米量級的細胞器進行顯微操作的同時進行精細的操控和加工，因為光刀切割的精確性(損傷範圍只有1微米，損傷位置可以精細調節)，細胞器可以不受損傷，其形態依然保持完整，整個分離過程都在細胞器的液體生存環境中，並且通過光來完成，沒有直接接觸分選物，所以最大程度上避免了分選過程中可能發生的汙染和其它意外。
本發明可直接從細胞中提取細胞內物質，實現單個目標細胞器的挑選與操控。與現有技術相比，具有樣品製備容易、分選效率高、自動化程度高、操作易掌握、無損傷以及操作尺度小(達亞微米量級)等優點，本發明由於完全在液體環境中進行操作，操作條件溫和，可以保持細胞組分生物活性的條件下(例如對單條染色體的分選)分選其細胞組分。
附圖
圖1為本發明的裝置示意2為用本發明提取水稻單條染色體的過程示意圖參見圖1，在實施例中採用的倒置生物顯微鏡，使用100×物鏡，數值孔徑(是物鏡的一個參數，表徵它的集光本領)1.25。螢光經M(M、M1、M2都是雙向分束鏡，對不同波長的光可產生反射或透射效應)反射進入顯微物鏡，光鑷光束經過從M1透過，再由M2反射進入顯微物鏡，光刀光束被M3(全反鏡)反射，再經過M1、M2耦合、從M透過進入顯微物鏡。這樣螢光光束、光鑷光束和光刀光束經過反射和透射後合併成一束，經過M進入物鏡並被聚焦後照射在樣品(樣品載物臺中間有通光孔，光可以從中透過)上，樣品載物臺通過計算機控制在顯微鏡工作範圍內以微米精度運動。照明光由上至下照射樣品，通過顯微鏡物鏡在CCD(感光元件)上成像，CCD輸出的視頻信號送入錄像機進行記錄，同時在計算機屏幕上實時顯示並採集實驗中的動態圖象。
參見圖2圖2-1結構完整的細胞器—染色體被包裹在細胞內；圖2-2光刀精確作用於細胞，細胞壁局部穿孔、破裂，而細胞內染色體物質不受傷害；圖2-3細胞壁被光刀破壞，內部的染色體開始散落到細胞外部。(由於細胞骨架的作用，染色體仍然相對集中)；圖2-4光鑷捕獲住染色體群中一個目標染色體，光鑷將其與染色體群及細胞碎片分離，並移至微吸管口；圖2-5微吸管(收集染色體所用的空心玻璃微吸管使用NARISHIGE公司產PP-830型拉制儀拉制，尖端直徑為2微米)接近被光鑷捕獲的染色體；圖2-6微吸管將染色體吸入管內；圖2-7將吸取了染色體的微吸管從培養液中提出，完成整個分選過程。
權利要求
1.一種用雷射分選提取液相細胞內物質(以下簡稱細胞器)的技術，其特徵是用兩束雷射，即光刀(雷射微束)和光鑷(光阱)，對細胞或粒子進行有目的的損傷和分選，通過計算機控制載有樣品的樣品載物臺實現微米精度的操控，顯微操作分選過程由攝錄系統實時顯示於視屏上並記錄存儲。具體分離方法是使待分離的細胞器隨樣品載物臺移至光刀在視場中的作用位點上，用光刀對細胞膜或結構進行破壞，釋放出細胞內物質；移動樣品載物臺，使被選中的目標細胞器隨樣品載物臺移至光鑷在視場中的光阱中心，細胞器被光鑷俘獲。再次移動樣品載物臺，周圍的雜質及細胞殘骸隨樣品載物臺一起運動，而被光鑷俘獲的細胞器由於受到光阱的束縛而固定不動，實現目標細胞器與周邊環境的相對運動，用這種方法把該細胞器相對移動到一個比較空曠的視場中，與其它細胞器或細胞殘骸的完全分離；最後用微吸管或微分選室，從樣品中提取被選中的目標細胞器，最終完成分選工作。
全文摘要
一種用雷射分選提取液相細胞內物質的技術，其特徵是兩束雷射，光刀(雷射微束)和光鑷(光阱)，對細胞或細胞內物質進行有目的的損傷和分選，通過計算機控制載有樣品的樣品載物臺在顯微鏡工作範圍內以微米精度移動，分別用光刀和切割細胞、光鑷俘獲目標細胞器，移動樣品載物臺使目標細胞器遠離雜質或細胞殘骸，最後用微吸管或微分選室提取目標細胞器，最終使該細胞器與其它細胞器或細胞殘骸的完全分離。本發明可直接從細胞中提取細胞內物質，實現單個目標細胞器的挑選與操控。與現有技術相比，具有樣品製備容易、分選效率高、自動化程度高、操作易掌握、無損傷以及操作尺度小(達亞微米量級)等優點，本發明由於完全在液體環境中進行操作，操作條件溫和，可以保持細胞組分生物活性的條件下(例如對單條染色體的分選)分選其它細胞組分。
文檔編號G01N21/66GK1438479SQ02160678
公開日2003年8月27日 申請日期2002年12月31日 優先權日2002年12月31日
發明者李銀妹, 王浩威, 樓立人 申請人:上海中科大光鑷科技有限公司