一種用於鉻渣汙染場地修復的菌株的製作方法

2024-03-09 04:56:15 1

專利名稱：一種用於鉻渣汙染場地修復的菌株的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於環境汙染處理的菌株，特別涉及一種鉻還原功能菌。
背景技術：
六價鉻是一種毒性較大致癌、致畸、致突變劑物質。環境中鉻汙染主要來 自於電鍍、製革、油漆、印染等行業含鉻廢水的排放以及金屬鉻和鉻鹽生產行 業產生的固體廢物一一鉻渣。微生物修復鉻汙染的方法由於其成本低、無二次 汙染和操作簡單等優點而日益引起廣大環保工作者極大的興趣。分離獲得高效 的鉻還原功能菌一直是研究者們致力開展的一項工作。國內外在這方面的報導 較多，已分離具有還原六價鉻能力的細菌有多種，主要有脫硫弧菌
("e5Y/7/bK27 r2》n/^ari6")、芽孢桿菌(5acW〃51 sp.)、假單胞菌(/^ew/。/77。/ as sp.)、希瓦氏菌(577e附"e7〗a sp.)、大腸桿菌(fecAerfcAia coh' sp)等。 但是，迄今為止，尚未有關於屍朋"o/L^3cterp/Lra^L^"ys還原六價鉻的報導。 因此，本發明為六價鉻汙染微生物修復提供了新的微生物資源。

發明內容
本發明的目的在於提供一種新的鉻還原功能菌株，該菌株具有將六價鉻還 原為三價鉻的功能，將該菌株用於鉻汙染的治理，成本低，操作簡單。
發明人採集湖南鐵合金廠鉻渣堆放場汙染土壤，經過篩選、分離、馴化， 得到一種具六價鉻還原特性的菌株，經鑑定，該菌株16s rRNA基因序列與 屍朋/70/7i6a"ar p/Lra^wYet"s sp. 16S rRNA有99%的相似性，命名為 /^朋o/ itecter p力r鄉M7e&s BB。該菌株已於2009年5月5日向中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)提交生物保藏，保藏號為CGMCC No. 3052。該菌株可廣泛用於鉻渣汙染場地修復。
本發明中，篩選、分離、馴化該菌株的過程為採集湖南鐵合金廠鉻渣堆 放場下土壤，在液體培養基中，3(TC恆溫培養箱中生長3 4天；稍振蕩，上部 泥漿按稀釋梯度接種於含有50 250mg/L六價鉻濃度的固體培養基中，挑取不 同形態菌，於含有50 250mg/L六價鉻濃度的液體培養基中，3(TC振蕩培養； 挑取已純化的單菌落，逐步提高鉻濃度，進行馴化。
所述液體培養基組成為5g/L乳酸鈉、5g/L酵母膏和2g/L氯化鈉，其餘 為水，用5mol/L Na0H調節pH=9. 5 9. 8。所述固體培養基為5g/L乳酸鈉、5g/L酵母膏和2g/L氯化鈉，15g/L瓊脂。


圖l:本發明的菌株的菌落形態圖2:本發明的菌株形態圖3:本發明菌株的系統發育分析樹；
圖4:用本發明菌株還原Cr(VI)的還原效果圖。
具體實施例方式
實施例l:本發明的鉻還原菌的分離純化及馴化
採集湖南鐵合金廠鉻渣堆放場下土壤，稱取10g鉻渣土壤於150mL已滅菌 的錐形瓶中，加入10mL滅菌液體培養基(5g/L乳酸鈉、5g/L酵母膏和2g/L 氯化鈉，其餘為水，用5mol/L NaOH調節p^9.5 9.8)，於30 'C培養箱中培 養4天。隨後取lmL泥漿按梯度稀釋成10—3、 10—4、 l(T5、 10—6、 10—7、 10—8，用 移液槍從10—6、10_7和10_8稀釋液中分別取0. lmL置於含有250mg/LCr(VI)(以 K2CrA溶液作為鉻源)的固體培養基，固體培養基組成為5g/L乳酸鈉、5g/L 酵母膏和2g/L氯化鈉，15g/L瓊脂。用三角棒充分塗勻，將平板倒置於30 °C 培養箱中培養4天。用無菌的接種針挑取不同形態的菌落，劃線接種於含250 mg/LCr(VI)的固體培養基上，固體培養基組分同上。倒置，於30 。C培養箱培 養4天。
分別挑取己純化的單菌落於上述含250 mg/L Cr(VI)液體培養基中，液體 培養基組成5g/L乳酸鈉、5g/L酵母膏和2g/L氯化鈉，250 mg/LCr(VI)(以 K2Cr2(V溶液作為鉻源)，其餘為水，當培養基顏色從最初的黃色變為蘭灰色時， 培養液中Cr(VI)濃度低於檢出限。檢出限是指用分光光度法無法檢出培養基中 的Cr(VI)。
選取該瓶進行轉接，逐步提高Cr(VI)濃度，從250 mg/L、 300 mg/L、 400 mg/L、 500 mg/L，每種培養重複2 3次。馴化結束後，取培養液10mL接入到 100mL培養液中，30 °C， 150rpm振蕩過液培養，取出，4'C保存。
實施例2:菌株細菌學特徵及生物學鑑定
取菌液少許滴在載玻片上，使菌體附著15min，放入2. 5%的戊二醛溶液 中固定lh，酒精梯度30% 70%逐級脫水，醋酸異戊酯置換30min，臨界點幹 燥，離子濺射，掃描電子顯微鏡觀察並拍照，見附圖l。 1.形態特性(1) 菌落形態特徵將生長有鉻還原菌的液體培養基通過劃線平板法， 接種到含有250mg/L六價鉻濃度的固體培養基中，將平板倒置於3(TC恆溫 培養箱中培養3 4天，觀察其菌落形態，在有Cr(VI)的平板上，菌落呈蘭 灰色，圓形，邊緣整齊，中部突起，見附圖l。
(2) 菌體特徵該菌株屬革蘭氏陰性菌，菌體為杆狀，尾部生有鞭毛， 菌體遊動，表面粗糙且有絲狀物質附著，參見附圖2。
2. 生化特性
還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，吐溫80水解、磷酸酯酶水解為陽性反應；甲基 紅、吲哚產生、3-酮基乳糖、H2S產生、纖維素水解、脲酶活性、白明膠水解、 澱粉水解為陰性反應。
3. 生理生化特性
可利用D-木糖、D-葡萄糖、L-樹膠醛糖、蔗糖、乳糖產酸，能利用檸檬酸 鹽，D-果糖、D-半乳糖、麥芽糖為陰性反應，生長的適宜pH為9-10，適宜溫 度為3(TC，無氯化鈉可生長。
_表l菌株的生理生化特性_
生理生化特性 Strain BB
檸檬酸鹽利用 +
脲酶活性 _
磷酸酯酶 +
白明膠水解 一
吐溫80水解 +
纖維素水解 一
D-木糖產酸 +
D-果糖產酸 _
D-葡萄糖產酸 +
L-樹膠醛糖產酸 +
D-半乳糖產酸 一
蔗糖產酸 +
麥芽糖產酸 _
乳糖產酸 一
甲基紅 一吲哚產生 _ 3-酮基乳糖 _ 硝酸鹽還原 + HzS產生 一 澱粉水解 _ 適宜pH 9-10 _無NaC性長__
4. 16s rRNA特性及系統發育樹分析
用接種環直接挑取一環己純化的菌落於裝有細胞裂解液移液管中，裂解液 用量為lmL(細胞裂解液的組成為100uL或10y。十二烷基磺酸鈉，20uL 40% NaOH， 880 PL無菌水)。破壁，抽絲，破壁後直接作為模板進行16sr RNA菌 落PCR。按TIANGEN公司DNA回收試劑盒操作進行PCR擴增目的片段割膠回收， 瓊脂糖凝膠DNA回收後的片段進一步純化按TIANGEN公司DNA純化試劑盒操作 進行，目的DNA片斷(割膠回收產物)與pGM-T載體連接，將連接產物進行熱 擊轉化，挑取過夜培養後轉化平板上得到的白色菌落進行核酸序列的測定。
16s rRNA基因序列和Genbank中己登錄的16s rRNA基因序列進行核苷酸同 源性比較，與Pa/MOTJ'fe"er p/Lrag頂it""s 16S rRNA有99%的相似性，將該菌 株命名為屍a/wo/2j7^c^rp/Lra^u'fez^sBB。該菌株的系統發育分析樹見附圖3。 實施例3:鉻還原菌還原Cr(VI)效果
細菌還原Cr(VI)條件培養基組分5g/L乳酸鈉，5g/L酵母膏，2g/L氯 化鈉；用5mol/L NaOH調節pH=9. 5 9. 8;溫度30 。C 。
用接種環挑取已純化的菌落於裝有100 mL滅菌培養基的錐形瓶中，於30 °C， 150 rpm搖床培養24h,然後，用滅菌移液管移取10mL該過夜生長的菌液， 接種到六價鉻濃度分別為25， 50， 100， 150， 200， 300， 400和500mg/L的100mL 滅菌培養基中(以K2Cr207溶液作為源)，於30。C， 150 rpm，搖床培養72 h， 期間，分別在培養後0， 6， 12， 24， 36， 48， 60及72 h，用滅菌針筒取 樣，離心，上清液進行殘餘六價鉻的測定，各個時段測定Cr (VI)的結果如附圖 4所示。
權利要求
1.一種用於鉻渣汙染場地修復的菌株，所述菌株為Pannonibacterphragmitetus BB，CGMCC No.3052，具有能將六價Cr還原為三價Cr的能力。
2. 如權利要求1所述的菌株，其特徵在於該菌適合培養條件為培養基含 5g/L乳酸鈉，5g/L酵母膏，2g/L氯化鈉;pH=9.5 9.8;溫度30。C。
3. —種分離培養權利要求1所述菌株的方法，其特徵在於包括以下步驟採集湖南鐵合金廠鉻渣堆放場下土壤，在乳酸鈉酵母膏液體培養基中，3(TC 恆溫培養箱中生長3 4天;稍振蕩，上部泥漿按稀釋梯度接種於含有50 250mg/L六價鉻濃度的固體培養基中，挑取不同形態菌，於含有50 250mg/L六價絡濃度的培養基中，3(TC振蕩培養；挑取己純化的單菌落， 逐步提高鉻濃度，進行馴化。
4. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述液體培養基組成為5g/L 乳酸鈉、5g/L酵母膏、2g/L氯化鈉，其餘為水；所述固體培養基為5g/L 乳酸鈉、5g/L酵母膏、2g/L氯化鈉和15g/L瓊脂。
5. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述馴化時Cr(VI)梯度濃度分別 為250 mg/L、 300 mg/L、 400 mg/L、 500 mg/L。
全文摘要
本發明公開了一種用於鉻渣汙染場地修復的菌株Pannonibacterphragmitetus BB，保藏號為CGMCC No.3052。發明人採集湖南鐵合金廠鉻渣堆放場汙染土壤，經過篩選、分離、馴化，得到一種具六價鉻還原特性的菌株，該菌株具有將六價鉻還原為三價鉻的功能。將該菌株用於鉻汙染的治理，成本低，操作簡單。
文檔編號C12N1/20GK101684453SQ200910043840
公開日2010年3月31日 申請日期2009年7月3日 優先權日2009年7月3日
發明者兵 彭, 楊志輝, 柴立元, 兵 王, 王雲燕, 王海鷹, 蘇長青, 閔小波, 黃順紅 申請人:中南大學