一種木聚糖酶突變體及其應用的製作方法
2024-04-04 22:48:05
一種木聚糖酶突變體及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種木聚糖酶突變體，是胺基酸序列為SEQ?ID?NO：1的木聚糖酶的第5位胺基酸由Pro變為Asn，第34位胺基酸由Gln變為Asn。上述木聚糖酶突變體的胺基酸序列為SEQ?ID?NO：2，其一種編碼基因的核酸序列為SEQ?ID?NO：3。本發明的木聚糖酶突變體最適pH值為5.5，在酸性、中性範圍內具有較高酶活，在pH2.0-5.0範圍內，突變體的酶活殘留率均高於野生型；木聚糖酶突變體的最適作用溫度為60℃，且在70℃條件下仍能保持約80%的酶活，比野生型具有更強的耐熱性。此外，本發明的木聚糖酶突變體對胃蛋白酶和胰蛋白酶也具有很強的耐受性，有利於其在飼料領域的廣泛應用。
【專利說明】一種木聚糖酶突變體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於功能基因改造【技術領域】，具體是一種木聚糖酶突變體及其應用。
技術背景
[0002]木聚糖(xylan)廣泛存在於自然界中，是半纖維素的重要組分，它是自然界中含量僅次於纖維素的第二豐富的多聚糖，幾乎佔地球可更新有機碳含量的三分之一。在被子植物中木聚糖佔乾物質重的15%-30%，在裸子植物中佔乾物質重的7%-12%。但木聚糖具有很強的抗營養作用，在動物的消化道內不能被消化和吸收，而且會影響其它養分的吸收利用，因而大大限制了富含木聚糖飼料(大麥、小麥、黑麥等)的應用。木聚糖酶(Xylanase)是指能專一降解半纖維素木聚糖為低聚木糖和木糖的一組酶的總稱。人們對木聚糖酶的研究早在六十年代就已開始，主要研究集中在食品、飼料、造紙、能源工業等方面的木聚糖酶，已經從不同來源的微生物中分離到大量的不同類型不同功能的木聚糖酶。並分離出多種木聚糖酶基因，已工業化生產多種木聚糖酶產品。
[0003]迄今為止發現的大多數木聚糖酶最適作用pH值在6-7範圍內，關於酸性木聚糖酶的報導比較少。近幾年對酸性木聚糖酶(PH4.0以下時仍保持較高酶活性)的開發已經引起人們的廣泛關注，對於酸性木聚糖酶的生產、純化、性質、酸性特徵的結構基礎及其在飼料加工、釀酒工業、 果汁加工、以及能源等領域的應用等方面的研究正在不斷深入。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種木聚糖酶突變體及其應用，通過對來源於裡氏木黴(Trichoderma reesei)的木聚糖酶進行蛋白質工程改造,獲得了突變體蛋白，其耐熱性得到顯著提高，有利於其在飼料領域的廣泛應用。
[0005] 申請人:對裡氏木黴木聚糖酶的N末端進行突變，經過大量的篩選，發現P5N、Q34N這兩個突變位點能引起木聚糖酶耐熱性的改變，從而促成本發明。
[0006]本發明一方面提供了一種木聚糖酶突變體，是胺基酸序列為SEQ ID NO:1的木聚糖酶的第5位胺基酸由Pro變為Asn，第34位胺基酸由Gln變為Asn。
[0007]上述木聚糖酶突變體的胺基酸序列為SEQ ID NO:2，其一種編碼基因的核酸序列為 SEQ ID NO:3o
[0008]本發明另一方面提供了攜帶有編碼序列為SEQ ID NO:3的木聚糖酶突變體基因的質粒。
[0009]將上述質粒轉入畢赤酵母中進行重組表達，獲得的木聚糖酶突變體耐熱性得到很大提聞。
[0010]本發明的木聚糖酶突變體最適pH值為5.5，在酸性、中性範圍內具有較高酶活，在PH2.0-5.0範圍內，突變體的酶活殘留率均高於野生型；木聚糖酶突變體的最適作用溫度為60°C，且在70°C條件下仍能保持約80%的酶活，比野生型具有更強的耐熱性。此外，本發明的木聚糖酶突變體對胃蛋白酶和胰蛋白酶也具有很強的耐受性，有利於其在飼料領域的廣泛應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1:本發明木聚糖酶突變體XYNHlO與野生型XynII的最適作用pH比較示意圖；
[0012]圖2:本發明木聚糖酶突變體XYNHlO與野生型XynII的pH穩定性比較圖；
[0013]圖3:為木聚糖酶突變體XYNHlO與野生型XynII的最適作用溫度比較圖；
[0014]圖4:木聚糖酶突變體XYNHlO與野生型XynII的耐熱性比較圖。
【具體實施方式】
[0015]本發明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook,2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(AusubeI, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，本領域的技術人員可以在本發明所記載的技術方案的基礎上，採用本領域其它常規的方法、實驗方案和試劑，而不限於本發明具體實施例的限定。
[0016]下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細描述。
[0017]實施例1木聚糖酶突變體基因的合成及擴增
[0018]為了提高來源於裡氏木黴的木聚糖酶XynII (GenBank:AAB29346.1，其胺基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的耐熱性,通過定向進化技術對該酶進行了大量突變的篩選,設計PCR 引物 Xynl1-FUXynI1-Rl 如下:·[0019]XynI1-Fl:GGCGAATTCCAGACTATCCAACCAGGAA (下劃線為限制性內切酶 EcoRI 識別位點)
[0020]XynI1-Rl:ATAGCGGCCGCTTAAGAAACAGTAATAGAT (下劃線為限制性內切酶 NotI 識別位點)
[0021]以XynII基因為模板，以上述引物用GeneMorph II隨機突變PCR試劑盒(Stratagene)進行PCR擴增，膠回收PCR產物，EcoR1、NotI進行酶切處理後與經同樣酶切後的pET21a載體連接，轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，塗布於LB+Amp平板，37°C倒置培養，待轉化子出現後，用牙籤逐個挑至96孔板，每個孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培養基，370C 220rpm培養6h左右，離心棄上清，菌體用緩衝液重懸，反覆凍融破壁，獲得含有木聚糖酶的大腸桿菌細胞裂解液。
[0022]分別取出30ul裂解液至兩塊新的96孔板，其中一塊於70°C處理IOmin後，兩塊96孔板都加入30ul底物，於37°C反應30min後，DNS法測定生成的還原糖，不同的突變子高溫處理後保持的活性不同。結果發現有些突變對木聚糖酶的耐熱性沒有影響，有些突變甚至使耐熱性降低了，對依然保持高活性的突變子進行DNA測序，最終， 申請人:獲得了能提高木聚糖酶耐熱性的突變組合P5N和Q34N。
[0023]含P5N和Q34N兩點突變的木聚糖酶突變體，其胺基酸序列為SEQ ID N0:2，編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:3由上海捷瑞生物公司合成。
[0024]將合成的木聚糖酶突變體基因命名為XynHIO，用引物Xynll-Fl、XynI1-Rl進行PCR擴增，引物兩端引入EcoR 1、Not I位點。PCR反應條件為:94°C變性5min ;然後94°C變性30s，56°C復性30s，72°C延伸lmin，30個循環後，72°C保溫lOmin。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，XynHlO基因為大小576bp的片段。
[0025]通過上述同樣的PCR方法擴增得到野生型木聚糖酶XynII的基因片段。
[0026]實施例2畢赤酵母工程菌株的構建
[0027]將上述克隆得到的木聚糖酶突變體基因XynHlO片段，通過EcoR I和Not I位點與表達載體PPIC9K相連接，構建表達載體pPIC9K-XynH10。
[0028]將表達質粒pPIC9K_XynH10用Sal I進行線性化，表達質粒線性化片段通過電穿孔法轉化畢赤酵母GSl 15，在MD平板上篩選得到畢赤酵母重組菌株GSl 15/pPIC9K-XynH10，然後在含不同濃度遺傳黴素的YPD平板上篩選多拷貝的轉化子。
[0029]將一個轉化子命名為畢赤酵母XynHlO (Pichia pastoris XynHlO)，轉接於BMGY培養基中，30°C、250rpm振蕩培養Id ;再轉入BMM培養基中，30°C、250rpm振蕩培養；每天添加0.5%的甲醇，誘導表達4d ;離心去除菌體，得到含木聚糖酶XynHlO的發酵上清液；將其進行SDS-PAGE電泳檢測分析，結果顯示發酵上清液中重組木聚糖酶突變體XynHlO的分子量大小約為20kDa。
[0030]通過上述同樣的酶切連接方法將野生型木聚糖酶基因XynII克隆到畢赤酵母GS115宿主中，構建得到重組表達野生型木聚糖酶的畢赤酵母工程菌，命名為畢赤酵母XynII (Pichia pastoris XynlD0 搖瓶水平發酵畢赤酵母 XynII, 30°C、250rpm 振蕩培養；每天添加0.5%的甲醇，誘導表達4d;離心去除菌體，得到含重組野生型木聚糖酶XynII的發酵上清液。
[0031](I)木聚糖酶活單位的定義
[0032]在37°C、pH值為5.5的條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的木聚糖溶液中釋放
Iμ mol還原糖所需要的酶量即為一個酶活力單位U。
[0033](2)酶活測定方法
[0034]取2ml濃度為1%的木聚糖底物(pH5.5乙酸-乙酸鈉緩衝液配製)，加入到比色管中，37°C平衡lOmin，再加入2ml經pH5.5乙酸-乙酸鈉緩衝液適當稀釋並經37°C平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混勻於37°C精確保溫反應30min。反應結束後，加入5ml DNS試劑，混勻以終止反應。然後沸水浴煮沸5min，用自來水冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25ml，混勻後，以標準空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光值Ae。
[0035]酶活計算公式:
[0036]
【權利要求】
1.一種木聚糖酶突變體，是胺基酸序列為SEQ ID NO:1的木聚糖酶的第5位胺基酸由Pro變為Asn，第34位胺基酸由Gln變為Asn。
2.如權利要求1所述的木聚糖酶突變體，其特徵在於，所述的突變體的胺基酸序列為SEQ ID NO:2o
3.編碼權利要求1所述的突變體的基因，其核酸序列為SEQID Ν0:3。
4.一種重組質粒，所述的重組質粒攜帶有權利要求3所述的基因。
5.一種重組畢赤酵母，所述的重組畢赤酵母攜帶有權利要求4所述的重組質粒。
【文檔編號】C12N15/81GK103627686SQ201310567525
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月14日 優先權日:2013年11月14日
【發明者】徐曉東, 王華明, 李冬冬, 趙俊橋, 王海, 邵靜 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司