一種活性物及其應用的製作方法

2024-02-29 09:09:15

專利名稱：一種活性物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種活性物及其應用，屬生物農藥技術領域。
背景技術：
根結線蟲是一種極難防治的植物寄生線蟲。隨著設施蔬菜栽培的迅猛發展，根結線蟲的發生區域不斷擴大，危害日益加劇。根結線蟲有90餘種，其中南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)是危害最為嚴重的根結線蟲之一。南方根結線蟲(M.1ncognita)屬線蟲門(Nematoda)、側尾腺 P 綱(Secernentea)、墊刃目(Tylenchida)、墊刃亞目(Tylenchina)、墊刃總科(Tylenchoidea)、異皮線蟲科(Heteroderidae)、根結亞科(Meloidogyninae)、根結線蟲屬(Meloidogyne)。南方根結線蟲(Μ· incognita)寄主範圍 廣，受害後的植株根部形成大小不等的瘤狀根，水分和養料運輸受阻，導致植株營養不良，發病嚴重時整株萎蔫枯死，是一種極難防治的土傳性病害。現有南方根結線蟲(M.1ncognita)病的防治方法包括化學防治、抗病育種、物理防治等，其中以化學殺線蟲劑為主。隨著化學藥劑對環境所造成的汙染，一些有效的殺線蟲劑逐步被禁用，因此人們力求從自然界中尋找能防治南方根結線蟲(M.1ncognita)病的天然藥劑。微生物是產生活性天然產物的主要源泉之一，從微生物的代謝產物中尋找具有對南方根結線蟲(M.1ncognita)有毒殺活性的天然產物成為一個研究熱點。

發明內容
本發明的目的在於提供一種活性物及其應用。本發明是這樣實現的1、活性發酵液的製備本發明使用的細菌菌株是變形桿菌(Proteus sp.)⑶-126，菌株⑶-126已於2012年7月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所；保藏號=CGMCC No. 6357。變形桿菌(Proteus sp.)⑶-126保存在酵母提取物胰蛋白腖(LB)培養基(酵母提取物=5. O g,胰蛋白腖10. O g,氯化鈉10. O g，水1000 ml, pH :7. O)中，使用時在LB的液體培養基中活化24小時。將活化後菌種100 μ I接種於裝有50 ml - 250 ml液體LB培養基三角瓶中，在溫度為28-37°C，轉速為120-180rpm的條件下培養96小時，即得到培養液。將培養液8500 rpm離心10分鐘後，取上清放入4°C的冰箱中備用，得到本發明使用的活性發酵液。2製備試驗用的南方根結線蟲(M.1ncognita)番茄根系用於南方根結線蟲(M.1ncognita)的製備。取發病嚴重的番茄根系，洗淨後統計根結數量，放入水中浸泡過夜，收集浸泡液；同法再泡洗3次，棄去根系。殘液和泥土經2000 rpm離心2 min,棄去上清液,加入494 g/L鹿糖,混勻後2000 rpm離心2 min,將上清液用800目的分離篩清洗，收集分離篩上的幼蟲和蟲卵。洗液再用100、200和500目的分離篩反覆漂洗，收集500目分離篩上的收集物-大部分為蟲卵；500目分離篩上的濾過液再經800目的分離篩清洗，收集分離篩上的蟲體-2齡幼蟲。所分離的蟲和蟲卵儲於4°C的冰箱中備。3.實驗方法液體浸泡法取5 ml稀釋10倍的測試樣品溶液、200 μ 含有±200條線蟲的懸液於直徑為6 cm的培養皿中，輕輕混勻後將培養皿室溫放置。在解剖鏡下隨機選擇10個視野定時(6小時、12小時、24小時)進行觀察，計數病蟲數(以線蟲不動作為標準)和總線蟲數。每個測試樣品設三個重複，並以未接種菌株的培養基為對照，得到測試樣品對線蟲的致死率，以致死率高低評定樣品對線蟲的毒力。三格平板法取5 ml發酵液於三格板一格中，其餘兩格各加入水瓊脂，在水瓊脂表面分別加入線蟲(約100條)。在顯微鏡下定時(12小時、24小時、48小時)進行觀察，觀察到的僵直針刺無反應線蟲計為死蟲，記下觀察到的死蟲數和總線蟲數，計算各發酵液對線蟲的致死率。每一處理重複三次，用等量LB培養基作為對照。本發明的活性發酵液在製備毒殺南方根結線蟲(M.1ncognita)生物農藥中應用。本發明對南方根結線蟲(M.1ncognita)具有良好的毒殺作用，綜合性狀好，高效低毒的優點，能夠作為製備生物農藥殺線劑的應用，易於工業化生產。
具體實施例方式下面用實施例來進一步詳述本發明，但本發明的內容並不局限於此。實施例一將活化後的變形桿菌(Proteus sp. )CD_126 100 μ I接種於液體LB培養基中(500ml三角瓶裝250 ml培養基)，於28°C、180 rpm條件下培養96小時。將培養液8500 rpm離心10分鐘後，取上清作為測試樣品，稀釋十倍後用液體浸泡法測試活性。結果見表I。表I變形桿菌(Proteus sp. ) Q)_126發酵液對南方根結線蟲(Μ· incognita)液體浸泡法測定的活性
權利要求
1.一種活性物，其特徵在於該活性物經如下步驟得到 a.將保藏號為CGMCCNo. 6357的變形桿菌(Proteus sp. ) CD-126保存在酵母提取物胰蛋白腖(LB)培養基中，培養基包括酵母提取物5. 0 g,胰蛋白腖10. 0 g,氯化鈉10. 0g，水1000 ml,及pH 7. 0，使用時在同樣的液體培養基中活化24小時； b.將活化後菌種100接種於裝有50 ml - 250 ml液體LB培養基三角瓶中，在溫度為28°C -37°C，轉速為120-180rpm的條件下培養96小時，得到培養液；將培養液8500rpm離心10分鐘後，取上清放入4°C的冰箱中備用。
2.權利書I所述的活性物在製備殺南方根結線蟲(M.1ncognita)生物製劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種活性物及其應用，屬生物農藥技術領域。該活性物經如下步驟得到a. 將保藏號為CGMCC No. 6357的變形桿菌(Proteus sp.)CD-126保存在酵母提取物胰蛋白腖(LB)培養基中，培養基包括酵母提取物5.0g，胰蛋白腖10.0g，氯化鈉10.0g，水1000ml，及pH7.0，使用時在同樣的液體培養基中活化24小時；b. 將活化後菌種100μl接種於裝有50ml - 250ml液體LB培養基三角瓶中，在溫度為28℃-37℃，轉速為120-180rpm的條件下培養96小時，得到培養液；將培養液8500 rpm離心10分鐘後，取上清放入4℃的冰箱中備用。該活性物在製備殺南方根結線蟲(M. incognita)生物製劑中的應用。本發明的活性物，具有成本低，製備方法簡便，高效低毒的優點，能用於殺南方根結線蟲(M. incognita)的生物製劑的製備。
文檔編號C12R1/37GK103014068SQ20121058035
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者李國紅, 盧皓, 張克勤, 王芯 申請人:雲南大學