油菜莖基潰瘍病菌實時螢光pcr分子檢測試劑盒及其檢測方法
2024-04-04 01:33:05
專利名稱：油菜莖基潰瘍病菌實時螢光pcr分子檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種油菜莖基潰瘍病菌L印tosphaeria maculans (Desm. ) Ces. & de Not.實時螢光PCR(或稱Real-time PCR)分子檢測試劑盒及其應用，屬於生物技術領域。
背景技術：
油菜蓮基饋蕩病 L印tosphaeria maculans (Desm. ) Ces. & de Not.是油菜 (Brassicanapus Linn)生產過程中的一種毀滅性病害。該病原菌的主要自然寄主為油菜， 甘藍，大白菜等十字花科的作物。該病害在田間可造成幼苗的死亡，成株倒伏、早衰，嚴重危 害著大田作物油菜籽的產量和品質。該病可以在多種氣候條件、不同栽培措施下發生和流 行，一般年份產量損失大約在10-20%，重災年份的損失可達30-50%。在加拿大，即使採取 了嚴格的控制措施，該病害每年仍造成了該國油菜籽3億多美元的損失；在英國每年的損 失達5600萬歐元。據統計，每年由於該病原菌造成的損失在澳大利亞、歐洲及北美等世界 主要油菜產區，所造成的經濟損失每年要高達9億美元左右。該病原菌目前在世界範圍油菜主產區如加拿大、澳大利亞、美國等油菜籽主要生 產國廣泛分布。目前，我國只有油菜黑脛病(Lbiglobosa)的發生報導，尚無油菜莖基潰瘍 病的發生和分布。油菜莖基潰瘍病菌可隨感病的植株、病殘體及種子進行遠距離傳播。種子的帶菌 率通常為0. 1_5%，由此導致田間植株發病率為0. 1-19%。該病原菌可以假囊殼和菌絲的 形式在病殘體中越冬和越夏，也可以休眠菌絲的形式藏在種皮內。在田間，該病原菌主要通 過子囊孢子和分生孢子進行擴散。油菜是我國主要油料作物，種植面積約800萬公頃，佔全國油料作物總面積的 40%以上，油菜籽的產量佔全國油料總產量的30%以上，居世界首位。油菜在中國廣泛種 植，且氣候條件與該病原菌發生地的氣候條件相似，因此，作為油菜莖基潰瘍病菌的主要自 然寄主，其病原菌傳入、定殖和擴散的可能性都很大，我國已將該病菌列入「中華人民共和 國進境植物檢疫性有害生物名錄」。目前，檢疫口岸多利用傳統的形態學方法和常規PCR技 術來檢測該病原菌，檢測不夠靈敏、快速。
發明內容
本發明的目的是提供一種適宜於檢疫口岸快速檢測使用的油菜莖基潰瘍病菌 Real-time PCR分子檢測的試劑盒，以便於快速、靈敏、準確地對口岸進口的油菜籽進行油 菜莖基潰瘍病菌的檢測。本發明油菜莖基潰瘍病菌實時螢光PCR分子檢測試劑盒，包括如下試劑基因表達通用混合試劑；ddH20 ；探針與引物混合物，包含5 μ mol · Γ1的LMpro探針、18 μ mol · L—1的LMf上遊引物和18 μ mol · Γ1的LMr下遊引物；陽性對照濃度為lOOng/μ L的油菜莖基潰瘍病菌DNA溶液；所說的LMf 上遊引物序列為 5，-GTTTCCTTGGTGGGCTTGC-3』，所說的LMr 下遊引物序列為 5，-TGTTACTGACGCTGACTGCAATT-3，，所說的LMpro 探針序列為 5，FAM-ATTGGATCCCCTAAAACC-NFQ-MGB3，，其中，FAM為螢光報告基團，NFQ(Non-Fluorescent Quencher)為非螢光淬滅基團， MGB (Minor Groove Binder)為修飾基團。本試劑盒中的基因表達通用混合試劑採用TaqMan Gene Expression Master Mix (美國應用生物系統公司產品)，包含超純AmpliTaq Gold DNA聚合酶，尿嘧啶-DNA糖 基化酶(UDG)，帶有脫氧尿嘧啶核苷酸(dUTP)的脫氧核糖核苷酸(dNTP)，R0X 內參染料以 及優化的PCR緩衝液。利用本發明油菜莖基潰瘍病菌實時螢光PCR分子檢測試劑盒檢測油菜莖基潰瘍 病菌的方法，包括如下步驟(1)提取待測樣品的DNA ；(2)實時螢光PCR反應以所得樣品DNA為模板，進行實時螢光PCR反應；實時螢光PCR反應體系含有 10 μ L的基因表達通用混合試劑，1 μ L探針與引物的混合物，2 μ L樣品DNA，7 μ L的ddH20， 反應總體積為20 μ L ；實時螢光PCR的反應條件為95°C反應IOmin ；95°C反應15sec，60°C 反應60sec，共40個循環；(3)結果分析實時螢光PCR反應結束後，利用實時螢光PCR儀分析軟體，對擴增的圖譜進行分 析，當初始循環數(Ct) <35時，判定實時螢光PCR反應為陽性，表示所檢測的樣品中含有
油菜莖基潰瘍病菌。本發明試劑盒用於油菜莖基潰瘍病菌的實時螢光PCR檢測，可針對該病原菌以種 子或病殘體傳播的特點，直接對油菜籽或植株病殘體進行檢測，與傳統的形態學鑑定方法 和常規PCR方法相比，具有快速、靈敏、準確、重複性好等優點，尤其可準確檢出樣品中含量 較低的病原菌，特別適合對進出境對油菜籽等十字花科作物的種子、植株及病殘體中油菜 莖基潰瘍病菌的快速檢測，具有良好的應用前景。
圖1是油菜莖基潰瘍病菌RealtimePCR擴增曲線。圖2是油菜莖基潰瘍病菌RealtimePCR特異性反應擴增曲線。圖3是油菜莖基潰瘍病菌RealtimePCR靈敏度檢測擴增曲線。圖4是油菜莖基潰瘍病菌RealtimePCR靈敏度檢測標準曲線。
具體實施例方式實施例1油菜莖基潰瘍病菌實時螢光PCR分子檢測試劑盒組成為2xTaqMan Gene Expression Master Mix (美國應用生物系統公司產品)，ddH20，
20xTaqMan MGB探針和引物混合物，包含18 μ mol · Γ1的LMf上遊引物、 18 μ mol · L"1 的 LMr 下遊弓丨物、5 μ mol · L"1 的 Lmpro 探針；陽性對照為IOOng/ μ L的油菜莖基潰瘍病菌DNA溶液(菌株200782，美國菌種保 藏中心ATCC)；上述油菜莖基潰瘍病菌TaqMan MGB探針與引物的設計和合成通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)油菜莖基潰瘍病菌核糖體RNA(r RNA)基因(基因登錄號DQ133891、AJ550889、AJ550885)和其近似種油菜黑脛病菌 B 型種(L. biglobosa)r RNA 基因(NCBI 基因登錄號FJ172238、AM410082、DQ133893、 AJ550871)進行比對後，根據油菜莖基潰瘍病菌r RNA內轉錄間隔區(ITSdnternal transcriptionspacer 1) ITSl基因的保守序列，設計如下一對寡核苷酸引物和TaqMan MGB探針上遊引物LMf 序列為 5，-GTTTCCTTGGTGGGCTTGC-3，；下遊引物LMr 序列為 5，-TGTTACTGACGCTGACTGCAATT-3，；探針LMpro 序列為 5，FAM-ATTGGATCCCCTAAAACC-NFQ-MGB3，，其中，FAM為螢光報告基團，NFQ(Non-Fluorescent Quencher)為非螢光淬滅基團， MGB (Minor Groove Binder)為修飾基團。其預期的擴增產物大小為72bp ；以上TaqMan MGB探針與PCR引物由美國應用生 物系統公司(Applied Biosystems)合成。實施例2油菜莖基潰瘍病菌的檢測1、用於檢測的油菜莖基潰瘍病菌菌株樣品(共七個樣品)，分別為200782 (美國菌種保藏中心ATCC)、J_2、J_4、J_9、J-Il (從加拿大油菜籽中分離到 的油菜莖基潰瘍病菌)、A-7 (從澳大利亞油菜籽中分離到的油菜莖基潰瘍病菌),UK-20 (英 國油菜莖基潰瘍病菌，安徽省農科院作物研究所惠贈)。2、油菜莖基潰瘍病菌DNA的製備取各樣品培養的油菜莖基潰瘍病菌菌絲或菌絲塊少量，分別加入液氮充分研磨成 粉狀物後，利用真菌DNA提取試劑盒(DNeasy plant mini kit, QIAGEN公司產品)製備 各菌株的DNA。3.實時螢光PCR反應τ ； PCR β. IS # ^ ^ 20 μ L, ^ 2xTaqMan Gene Expression Master Mix 10yL，20xTaqMan MGB探針及引物Mix 1 μ L，DNA模板2 μ L和ddH20 7 μ L，進行實時螢光 PCR反應，反應條件為95°C反應IOmin ；95°C反應15sec，60°C反應60sec，40個循環。4.結果分析實時螢光PCR反應結束後，利用實時螢光7500FAST PCR儀分析軟體，對擴增的圖 譜進行分析，當初始循環數(Ct) <35時，判定實時螢光PCR反應為陽性。檢測結果的擴增圖 譜如圖1。圖1表明，參試的七個油菜莖基潰瘍病菌菌株均有良好的擴增曲線，Ct值從左到 右分別為 16. 9 (200782)、20. 23 (J-9) ,21. 84 (J-4)、22. 36 (J-Il),22. 94 (J-2)、24. 32 (A-7) 和25. 77(UK-20)，表示實時螢光PCR反應結果均為陽性。實施例3油菜莖基潰瘍病菌實時螢光PCR反應的特異性試驗
1.參試菌株近似種油菜黑脛病菌(L. biglobosa)菌株6個，其中2_2、9_4、12-2、19-3四 個菌株均為安徽省農科院作物研究所李強生老師惠贈；CK6和CK8為從加拿大油菜籽 中分離到的油菜黑脛病菌(L. biglobosa)；一個近似種草莖點病菌(Phoma herbarum) 和一個種腐病菌(Phomopsis longicolla)；從加拿大油菜籽中分離到的其他病菌 5 株， 分 別 為 CK3 (Leptosphaerulina chartarum)、CK7 (Alternaria alternata)、 CK9 (Alternariaoregonenis)、CK12(芸苔交鏈孢菌 Alternaria brassicae)和 CK13(串孢 鐮刀菌Fusarium proliferatum)；另外，陽性對照為油菜莖基潰瘍病菌(ATCC :200782)；總 共14個菌株。2.製備參試菌株的DNA取少量培養的參試菌株菌絲或菌絲塊，加入液氮充分研磨成粉狀物後，利用真菌 DNA提取試劑盒(DNeasy plant mini kit，QIAGEN公司產品)製備菌株DNA。3.用實施例2相同的方法對共14個菌株的實時螢光PCR反應4.結果分析實時螢光PCR反應結束後，利用實時螢光PCR儀分析軟體(7500FAST 2. 0)，對擴增 的圖譜進行分析，當初始循環數(Ct) 500pg/ μ L>50pg/ μ L、5pg/y L、500fg/y L>50fg/ μ L>5fg/ μ L 禾口 0. 5fg/y L03、實時螢光PCR反應用實施例2相同的方法對各濃度的菌株DNA進行實時螢光PCR反應，每個濃度設 置三次重複試驗。4、結果分析實時螢光PCR反應結束後，利用實時螢光7500FAST PCR儀分析軟體，對擴增的圖 譜進行分析，當初始循環數(Ct) ^ 35時，判定實時螢光PCR反應為陽性。擴增的圖譜如圖3。圖3表明，菌絲DNA的濃度從5ng/ μ L、500pg/ μ L、50pg/ μ L、 5pg/ μ L、500fg/ μ L、50fg/ μ L和5fg/ μ L均有良好的擴增曲線，Ct平均值從小到大依次為 16. 2,19. 89,23. 54,27. 29,30. 87,34. 44,34. 48 和 36. 99，因此，所建立的油菜蓮基潰蕩病 菌real-timePCR檢測的靈敏度可達IOfg的菌絲DNA。並且，圖4可見，菌絲DNA的濃度在5ng/yL 50fg/yL範圍內，real-time PCR具有良好的線性關係，在此範圍內，可對未知 的油菜莖基潰瘍病菌DNA進行定量分析。
權利要求
一種油菜莖基潰瘍病菌實時螢光PCR分子檢測試劑盒，其特徵是包括如下試劑基因表達通用混合試劑，ddH2O；探針與引物的混合物，包含5μmol·L 1的LMpro探針、18μmol·L 1的LMf上遊引物和18μmol·L 1LMr的下遊引物；陽性對照濃度為100ng/μL的油菜莖基潰瘍病菌DNA溶液；所說的LMf上遊引物序列為5』 GTTTCCTTGGTGGGCTTGC 3』，所說的LMr下遊引物序列為5』 TGTTACTGACGCTGACTGCAATT 3』，所說的LMpro探針序列為5』FAM ATTGGATCCCCTAAAACC NFQ MGB3』，其中，FAM為螢光報告基團，NFQ(Non Fluorescent Quencher)為非螢光淬滅基團，MGB(Minor Groove Binder)為修飾基團。
2.用權利要求1的試劑盒檢測油菜莖基潰瘍病菌的方法，其特徵是包括如下步驟(1)提取待測樣品的DNA;(2)實時螢光PCR反應以所得樣品DNA為模板，進行實時螢光PCR反應；實時螢光PCR反應體系含有10 μ L 的基因表達通用混合試劑，1 μ L探針與引物的混合物，2 μ L樣品DNA，7 μ L的ddH20，反應 總體積為20 μ L ；實時螢光PCR的反應條件為95°C反應IOmin ；95°C反應15sec，60°C反應 60sec，共40個循環；(3)結果分析實時螢光PCR反應結束後，利用實時螢光PCR儀分析軟體，對擴增的圖譜進行分析，當 初始循環數(Ct) <35時，判定實時螢光PCR反應為陽性，表示所檢測的樣品中含有油菜莖 基潰瘍病菌。
全文摘要
本發明涉及一種油菜莖基潰瘍病菌實時螢光PCR分子檢測試劑盒，包含基因表達通用混合試劑、ddH2O、探針與引物混合物及陽性對照。探針與引物混合物包含5μmol·L-1的LMpro探針、18μmol·L-1的LMf上遊引物和18μmol·L-1的LMr下遊引物；陽性對照為濃度為100ng/μL的油菜莖基潰瘍病菌DNA溶液。本試劑盒可直接對油菜籽或植株病殘體檢測，快速、靈敏、準確、重複性好，尤其可用於檢測病原菌含量較低的樣品，特別適合對進出境油菜籽等十字花科作物的種子、植株及病殘體中油菜莖基潰瘍病菌的快速檢測，具有良好的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101928779SQ20101902606
公開日2010年12月29日 申請日期2010年2月8日 優先權日2010年2月8日
發明者吳新華, 吳晶, 吳翠萍, 孫民琴, 安榆林, 李彬, 粟寒, 陳貫源 申請人:江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心