一種墨蘭培養繁殖方法與流程
2024-03-27 20:40:05 1
本發明涉及植物培養繁殖技術領域，具體涉及一種墨蘭培養繁殖方法。
背景技術：
墨蘭又名報歲蘭，是蘭科蘭屬地生植物。假鱗莖卵球形，包藏於葉基之內。葉帶形，近薄革質，暗綠色。花葶從假鱗莖基部發出，直立，較粗壯，一般略長於葉；花的色澤變化較大，較常為暗紫色或紫褐色而具淺色唇瓣，也有黃綠色、桃紅色或白色的，一般有較濃的香氣；萼片狹長圓形或狹橢圓形；花瓣近狹卵形；唇瓣近卵狀長圓形；蕊柱稍向前彎曲，兩側有狹翅；花粉團4個，成2對，寬卵形。蒴果狹橢圓形，花期10月至次年3月。生於林下、灌木林中或溪谷旁溼潤但排水良好的蔭蔽處，海拔300-2000米。分布於中國、印度、緬甸、越南、泰國、日本琉球群島等。
然而，傳統的墨蘭培育往往存在繁殖速度慢等缺陷，難以滿足商業化生產的需求。因此，人們多數採用組織培養的方法對墨蘭進行快速繁殖。但現有的組織培養往往成苗率低、長勢不好。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種成苗率高、長勢良好、成本低的墨蘭培養繁殖方法。
為了達到上述目的，本發明採用的技術方案為：一種墨蘭培養繁殖方法，包括以下步驟：
(1)材料選取：選取當天挖取的無病蟲害長勢良好的墨蘭，採用假鱗莖為外植體，去除多餘的葉片；
(2)材料消毒：用軟刷毛將選取的墨蘭假鱗莖在水池中進行初步清洗，去除表面的泥沙，然後用洗潔精清洗乾淨，置於流水下衝洗60min，將墨蘭假鱗莖置於超淨工作檯上用體積分數為75％的酒精消毒30s，再用無菌水衝洗5次，然後用質量分數為0.2％的氯化汞溶液分2～3次共消毒6～7min，每次用氯化汞溶液消毒後將墨蘭假鱗莖用無菌水漂洗5次，並用消毒濾紙吸乾表面水分，最後在放入質量分數為4％的次氯酸鈉溶液中消毒5～7min，消毒後用無菌水衝洗6～8次，用消毒濾紙吸乾表面水分後放置於培養皿中備用；
(3)誘導培養：將消毒後的墨蘭假鱗莖，接種在芽誘導培養基中進行培養，所述芽誘導培養基為：1/2MS+0.4～0.8mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+6～8g/L瓊脂+1～3g/L蛋白腖+30～40mg/L赤黴素，pH值為5.8；培養條件：培養溫度23～25℃，光照時間為13h/d，光照強度為1300～1500lx；
(4)增殖培養：將誘導培養後的墨蘭假鱗莖用無菌手術刀切成2～3cm莖段，然後轉移至芽增殖培養基中，所述芽增殖培養基為：1/2MS+1～2mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+6～8g/L瓊脂+3～6g/L蛋白腖+50～60mg/L赤黴素，pH值為5.8；培養條件：培養溫度23～25℃，光照時間為13h/d，光照強度為1500～1800lx；
(5)生根培養：將增殖培養出來的帶有小葉片的假鱗莖無根幼苗單株切下，轉移到生根培養基中，所述生根培養基為：1/2MS+1.4～1.6mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+6～8g/L瓊脂+1～3g/L蛋白腖，pH值為5.8；培養條件：培養溫度23～25℃，光照時間為13h/d，光照強度為1700～2000lx；
(6)移栽：當生根培養試管苗生長至2～3cm高，根2～4條，葉1～2片時，將試管苗放在自然光下煉苗5～7天，打開瓶蓋煉苗1～2天；然後取出培養苗，用清水洗淨附著在根部的培養基，清洗時注意不要損害根部，然後移栽至水苔和腐殖土質量比為1:2的混合基質中，保持溼度和通風，空氣溼度為75～85％，溫度為20～25℃。
如上所述的一種墨蘭培養繁殖方法，進一步說明為，所述芽誘導培養基為：1/2MS+0.6mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂+2g/L蛋白腖+35mg/L赤黴素，pH值為5.8。
如上所述的一種墨蘭培養繁殖方法，進一步說明為，所述芽增殖培養基為：1/2MS+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂+5g/L蛋白腖+55mg/L赤黴素，pH值為5.8。
如上所述的一種墨蘭培養繁殖方法，進一步說明為，所述生根培養基為：1/2MS+1.5mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂+2g/L蛋白腖，pH值為5.8。
本發明的有益效果是：通過本發明能使培養後的苗株成苗率高，栽培後適應性強，苗株長勢良好，通過生物技術手段在短時間內，滿足了商業化生產的需求，為企業規模化、產業化提供了技術支持。本發明的成本低，以1/2MS培養基為基礎母液，並且採用其他營養物來代替價格昂貴的椰子汁作為營養液，其大量元素的用量為標準MS培養基的大量元素用量的一半，在對平均葉長、芽平均伸長高度以及大芽百分比不受影響的前提下，顯著降低了培養基的製備成本。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明做詳細的闡述。
本發明提供的一種墨蘭培養繁殖方法，包括以下步驟：
(1)材料選取：選取當天挖取的無病蟲害長勢良好的墨蘭，採用假鱗莖為外植體，去除多餘的葉片；
(2)材料消毒：用軟刷毛將選取的墨蘭假鱗莖在水池中進行初步清洗，去除表面的泥沙，然後用洗潔精清洗乾淨，置於流水下衝洗60min，將墨蘭假鱗莖置於超淨工作檯上用體積分數為75％的酒精消毒30s，再用無菌水衝洗5次，然後用質量分數為0.2％的氯化汞溶液分2～3次共消毒6～7min，每次用氯化汞溶液消毒後將墨蘭假鱗莖用無菌水漂洗5次，並用消毒濾紙吸乾表面水分，一般消毒用的0.1％氯化汞溶液滅菌效果不佳，而濃度較高的氯化汞溶液又易使外植體失去活性，抑制芽的誘導，而本培育方法採用質量分數為0.2％的氯化汞溶液能較好起到滅菌作用而又對其活性影響較小，並且採用分2～3次操作，能更好的保護外植體活性，使外植體的發芽率大大增加。最後在放入質量分數為4％的次氯酸鈉溶液中消毒5～7min，消毒後用無菌水衝洗6～8次，用消毒濾紙吸乾表面水分後放置於培養皿中備用；
表1為採用上述消毒方法對墨蘭假鱗莖進行處理後，放置於芽誘導培養基中進行培養，對培養後墨蘭假鱗莖發芽率的試驗結果：
由表1可以看出，採用質量分數為0.2％的氯化汞溶液能較好起到滅菌作用而又對其活性影響較小，並且採用分2～3次操作，能更好的保護外植體活性，使外植體的發芽率大大增加。最後用質量分數為4％的次氯酸鈉溶液中消毒5～7min，能更好起到滅菌作用；
(3)誘導培養：將上述消毒後的墨蘭假鱗莖，接種在芽誘導培養基中進行培養，所述芽誘導培養基為：1/2MS+0.4～0.8mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+6～8g/L瓊脂+1～3g/L蛋白腖+30～40mg/L赤黴素，pH值為5.8；培養條件：培養溫度23～25℃，光照時間為13h/d，光照強度為1300～1500lx；誘導培養的時間一般為30～40天；
表2為芽誘導培養基成分及其用量
表2中所述的MS基礎培養基為現有技術，這裡不做詳細闡述；表2中所述的6-BA為6-苄氨基腺嘌呤，又可以叫做細胞分裂素；所述NAA為萘乙酸；作為優選所述芽誘導培養基為：1/2MS+0.6mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂+2g/L蛋白腖+35mg/L赤黴素，pH值為5.8，即為表2中芽誘導培養基3的成分和用量；
(4)增殖培養：將誘導培養後的墨蘭假鱗莖用無菌手術刀切成2～3cm莖段，然後轉移至芽增殖培養基中，所述芽增殖培養基為：1/2MS+1～2mg/L6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+6～8g/L瓊脂+3～6g/L蛋白腖+50～60mg/L赤黴素，pH值為5.8；培養條件：培養溫度23～25℃，光照時間為13h/d，光照強度為1500～1800lx，增殖培養時間一般為40～50天；
表3為芽增殖培養基成分及其用量
表3中所述的6-BA為6-苄氨基腺嘌呤，又可以叫做細胞分裂素；所述NAA為萘乙酸；作為優選所述芽增殖培養基為：1/2 MS+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂+5g/L蛋白腖+55mg/L赤黴素，pH值為5.8，即為表3中芽增殖培養基1的成分和用量；
(5)生根培養：將增殖培養出來的帶有小葉片的假鱗莖無根幼苗單株切下，轉移到生根培養基中，所述生根培養基為：1/2MS+1.4～1.6mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+6～8g/L瓊脂+1～3g/L蛋白腖，pH值為5.8；培養條件：培養溫度23～25℃，光照時間為13h/d，光照強度為1700～2000lx，生根培養的時間一般為20～30天；
表4為生根培養基成分及其用量
表4中所述的6-BA為6-苄氨基腺嘌呤，又可以叫做細胞分裂素；所述NAA為萘乙酸；作為優選所述生根培養基為：1/2MS+1.5mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂+2g/L蛋白腖，pH值為5.8，即為表4中芽增殖培養基1的成分和用量；
(6)移栽：當生根培養試管苗生長至2～3cm高，根2～4條，葉1～2片時，將試管苗放在自然光下煉苗5～7天，打開瓶蓋煉苗1～2天；然後取出培養苗，用清水洗淨附著在根部的培養基，清洗時注意不要損害根部，然後移栽至水苔和腐殖土質量比為1:2的混合基質中，保持溼度和通風，空氣溼度為75～85％，溫度為20～25℃；通過本發明能使培養後的苗株成苗率高，栽培後適應性強，苗株長勢良好，通過生物技術手段在短時間內，滿足了商業化生產的需求，為企業規模化、產業化提供了技術支持。
本發明並不限於上述實例，在本發明的權利要求書所限定的範圍內，本領域技術人員不經創造性勞動即可做出的各種變形或修改均受本專利的保護。