一種基於微球生物檢測的微流控晶片的製作方法

2023-05-31 05:16:01 1

專利名稱：一種基於微球生物檢測的微流控晶片的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種基於微球生物檢測的微流控晶片及其製備方法。它可 以用來檢測蛋白質、核酸等生物大分子，能夠廣泛應用於臨床檢測、檢驗檢疫、 環境監測、藥物篩選、微生物鑑定以及核酸和蛋白功能分析等領域。
背景技術：
微流控分析晶片是指通過微電子、微加工技術在平方釐米大小的固相介質 表面構建的微型分析系統，以實現對組織和細胞中DNA、蛋白質和其他生物 組分的快速、高效、靈敏的處理與分析。它是20世紀90年代初中期在分析化 學領域發展起來的一種分析技術，以分析化學和分析生物化學為基礎，應用微 電子加工技術，在微晶片上加工出微米級的容器、泵、閥、管道等微結構網絡， 將樣品的製備、反應和檢測的這個過程進行集成的微全分析系統。晶片的大小 在幾個平方釐米左右，選用矽片、玻璃、矽橡膠、塑料等材料作為基片和蓋片， 通過蝕刻、光刻或印模等方法加工微通道，採用電、壓力、重力等方式驅動通 道內的流體，最後採用化學發光、電化學、螢光檢測器等進行檢測。該晶片在 裝置上的主要特徵是其容納流體的有效結構(包括其通道、反應室和其它功能 部件)至少在一個維度上為微米級尺度。與宏觀尺寸的實驗裝置相比，微流控 分析晶片的微米級結構可以顯著增大流體環境的面積/體積的比例。這一變化 在微流控系統中導致一系列與物體表面有關的決定其特殊性能的特有效應，如 層流效應，表面張力及毛細效應，快速熱傳導效應以及擴散效應等。這些效應 可以使微流體分析晶片的分析性能得到顯著的改善，包括可以使分析裝備的體 積減小，裝備更加的集成化自動化，可以顯著提高分析效率以及使試樣和試劑 消耗顯著下降等。把實驗室大型設備集成在儘可能小的操作平臺上,用以完成不 同的實驗過程，並能對產物進行分析的技術。它不僅使試劑的消耗降低,而且使 實驗速度提高，費用降低，充分體現了當今實驗室設備微型化、集成化和便攜化的發展趨勢。現在微流控晶片巳在生物化學分析和環境分析諸方面發有了廣泛 的應用和快速的發展。由於微流控晶片將整個樣品分析的過程，包括取樣和樣 品的處理、預濃集、稀釋和混合、分離、化學反應和信號檢測全部集成化在一 塊小的晶片上，它與傳統的分析裝置相比實現了亞微升甚至納升級的試劑和樣 品消耗，反應空間的大大縮小使反應的均一性提高，反應速度加快，同時降低 了生產成本並便於攜帶。發明內容技術問題本發明的目的是提供一種基於微球生物檢測的微流控晶片， 用於以微球為固相載體進行生物分子檢測。將固定有生物探針分子的編碼微球 通過晶片進行進樣、與待測樣品反應、洗滌和檢測，提供一種檢測分析的晶片 平臺。技術方案本發明的目的可以通過以下技術方案實現本發明的基於微球生物檢測的微流控晶片由位於上半部的蓋片和位於下 半部的基片所組成；在基片或蓋片內設有功能性的微通道網絡，在微通道網絡 中設有具有編碼的微球作為生物分子檢測的載體，在微通道網絡中，反應池的外周是篩分管道，篩分管道的外周是輔助管道，輔助管道與出口相接，反應池 通過長通道接進口。生物分子檢測以微球作為載體，微球具有編碼，在微球的表面固定有生物 分子探針，所用的生物分子探針可以是核酸、蛋白質、多肽中的一種。在晶片反應池中進行微球與待測樣品的反應；待測溶液和洗滌緩衝液通過 進口進入反應池，在反應池中與微球反應或洗滌微球， 反應結束微球被輸入通道中檢測並輸出。微球作為探針分子載體，其材料可以是玻璃、或聚苯乙烯和橡膠，微球的 大小在50txm 300um之間；晶片的基質材料可以是玻璃、矽、聚甲基丙烯 酸甲酯PMMA、聚二甲基矽氧垸PDMS及聚碳酸酯PC中的一種。編碼微球是條形碼編碼、螢光編碼、量子點編碼、光子晶體編碼、拉曼標 籤編碼、紅外光譜編碼、形狀編碼、射頻編碼、大小編碼以及位置編碼中的一 種。反應池的直徑在200 P m 1200 n m之間，長通道寬度在60 u m 550 ix m之間，長度在10mm 50mm之間。 其工作原理是a) 在晶片出口處連接一個往返式注射泵或者蠕動泵，將晶片外編碼微球 連其運載緩衝液通過長通道，吸入反應池。由於篩分通道的尺寸小於 編碼微球的直徑，因此通過泵的繼續抽吸，微球留在反應池中，而運 載微球的緩衝液則被吸乾；b) 此時，在通過進口吸入待測樣品溶液到反應池，使待測樣品溶液與微 球充分反應；C)反應完畢，繼續通過進口吸入洗滌緩衝液；d)洗滌完全之後，通過出口注入微球運載緩衝液，使微球隨運載緩衝液進入長通道，在微球通過長通道時，檢測微球表面的反應結果。 有益效果根據本發明，利用晶片進行檢測載體、樣品注樣，反應，洗滌 和檢測的連續化操作，以編碼微球為生物分子檢測的固相載體具有以下優點(1) 檢測速度快由於雜交反應只在微通道內進行，雜交液循環流動， 可以減少溶液的揮發和目的靶分子到達探針的時間，提高反應的速度，縮短檢 測時間；(2) 可以實現多元分析檢測每次進樣的微球具有編碼，因此可以編碼 多元生物分子檢測，同時檢測同一個樣品中的多個指標。同時球形載體具有比 表面積大，可以滾動等特點，所以檢測反應的靈敏度高，樣品需要量少，反應 速度快；(3) 準確度高微球在進入長通道的時候，由於通道尺寸略大於微球直 徑，遠小於兩個微球的直徑，因此微球只能單個通過，依次被檢測，準確性 高；(3)可擴展性高由於採用了微流控晶片的形式，可以方便的同樣品預 處理等微流控晶片集成，促進了分析系統的微型化和自動化(3)本發明同時結合了微球載體以及微流控晶片的生物檢測優勢，對小 尺寸的微球操作簡單，具有鮮明的優勢。


圖1為本發明晶片的的俯視圖。圖2為本發明晶片使用時，整個裝置的結構示意圖。 以上的圖中有進口 1、出口2、長通道3、反應池4、輔助管道5、篩分 管道6。
具體實施方式
本發明是一種基於微球的微流控分析晶片，該生物晶片由位於上半部的蓋 片和位於下半部的基片所組成；在基片或蓋片內設有功能性的微通道網絡，在 微通道網絡中設有具有編碼的微球作為生物分子檢測的載體，在微通道網絡 中，反應池4的外周是篩分管道6,篩分管道6的外周是輔助管道5，輔助管 道5與出口2相接，反應池4通過長通道3接進口 1。生物分子檢測以微球作為載體，微球具有編碼，在微球的表面固定有生物 分子探針，所用的生物分子探針可以是核酸、蛋白質、多肽中的一種。在晶片 反應池4中進行微球與待測樣品的反應；待測溶液和洗滌緩衝液通過進口 1進 入反應池4，在反應池4中與微球反應或洗滌微球，反應結束微球被輸入通道 3中檢測並輸出。微球作為探針分子載體，其材料可以是玻璃、或聚苯乙烯和 橡膠，微球的大小在50um 300um之間；晶片的基質材料可以是玻璃、矽、 聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚二甲基矽氧垸PDMS及聚碳酸酯PC中的一種。 編碼微球是條形碼編碼、螢光編碼、量子點編碼、光子晶體編碼、拉曼標籤編 碼、紅外光譜編碼、形狀編碼、射頻編碼、大小編碼以及位置編碼中的一種。 反應池4的直徑在200um 1200um之間，長通道3寬度在60u m 550u m 之間，長度在10mm 50mm之間。作為探針分子載體的微球其材料可以是玻璃、聚苯乙烯或橡膠等。實施例一以PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)作為晶片材料，在光子晶體 編碼玻璃微球上固定探針進行生物檢測，微球直徑為50ixm。a、 基片的製備採用雷射微加工方法。通過AutoCAD設計微通道圖形， 將CAD圖形轉換成雷射微加工系統可識別指令；採用雷射微加工系統 在基片(或蓋片)上加工成所需的網絡微通道，其中，長通道寬度為 60nm，長20mm,反應池直徑為250um，篩分管道寬為20um，通 道的深度為60um。兩端打孔分別作為進樣口和出樣口；b、 蓋片的製備選擇與基片同樣大小的PMMA片子作為蓋片；蓋片和基片的封裝:直接通過玻璃態熱鍵和方法進行基片和蓋片的封裝; C、微球上固定探針洗淨的微球經矽烷化和雙功能試劑修飾，然後將不同 的探針分子固定到光子晶體編碼的玻璃微球上；d、 微流控晶片的連接進口 1通過管線連接樣品池，出口 2接往復式注射 泵；e、 進樣通過注射泵將編碼微球連同其運載緩衝液吸入長通道3，然後進 入反應池4，最後抽乾運載緩衝液，編碼微球留在反應池4中；f、 反應通過注射泵將待檢測溶液吸入長通道3，最後進入反應池4中與 編碼微球表面的探針分子進行反應；g、 洗滌反應完畢後，通過注射泵從入口 1吸入洗滌緩衝液到反應池4 對微球進行充分洗滌；h、 檢測抽乾反應池4中的洗滌緩衝液，利用注射泵從出口2注入微球的 運載緩衝液，運載緩衝液將微球帶入長通道(3)，微球依次通過長通道 3)，並在長通道3中依次被檢測。實施例二以玻璃作為晶片材料，在量子點編碼聚苯乙烯微球上固定探針進 行生物檢測，微球直徑為100um。a、 基片的製備採用標準光刻技術進行溼法刻蝕。在乾淨平滑的玻璃基片表面上鍍一層金屬鉻，在鉻層上用甩膠機均勻的塗布一層光刻膠，將芯 片結構圖通過光刻掩膜用紫外光曝光到光刻膠上，顯影以除去曝光的光刻膠，再用去鉻液腐蝕去鉻層，顯出微通道網絡的平面二維圖形；最後 即可溼法刻蝕出所需的微通道。其中，長通道寬度為130 P m，長30mm, 反應池直徑為500um,篩分管道寬為40nm,通道的深度為130wm;b、 蓋片的製備選擇與基片同樣大小的玻璃作為蓋片；C、蓋片和基片的封裝:在進口 l和出口2處打孔後的玻璃基片和平的玻璃 蓋片清洗後即可進行高溫加壓鍵合；d、 微球上固定探針:將不同的探針分子固定到不同編碼的聚苯乙烯微球表 面；e、 微流控晶片的連接進口 1通過管線連接樣品池，出口 2接往復式微蠕 動泵；f、 進樣通過蠕動泵將編碼微球連同其運載緩衝液吸入長通道3，然後進入反應池4，最後抽乾運載緩衝液，編碼微球留在反應池4中；g、 反應通過蠕動泵將待檢測溶液吸入長通道3，最後進入反應池4中與 編碼微球表面的探針分子進行反應；h、 洗滌反應完畢後，通過蠕動泵從入口 1吸入洗絡緩衝液到反應池4對微球進行充分洗滌；i、 檢測抽乾反應池4中的洗滌緩衝液，利用蠕動泵從出口 2注入微球的 運載緩衝液，運載緩衝液將微球帶入長通道3，微球依次通過長通道3， 並在長通道3中依次被檢測。實施例三以PDMS (聚二甲基矽氧烷)作為晶片材料，在螢光編碼玻璃微 球上固定探針進行生物檢測，微球直徑為200ym。a、 基片的製備選擇PDMS的基質和固化劑的比例為10: 1 (質量比)， 混合均勻後，經真空抽氣以除去氣泡後，澆注在事先加工好的陽模上， 進行加熱固化25min,其中，長通道寬度為250U m，長50mm,反應池 直徑為1200ixm，篩分管道寬為50wm，通道的深度為250 u m。固化 好後將PDMS從模版上揭下，即製成基片；b、 蓋片的製備選擇PDMS的基質和固化劑的比例為5: 1 (質量比)，混 合均勻後，經真空抽氣以除去氣泡後，直接水平放置加熱固化20min 即製成蓋片；C、蓋片和基片的封裝固化好的基片和蓋片再用氧等離子體處理後貼合， 然後直接通過熱鍵合方法進行基片和蓋片的封裝；d、 微球上固定探針將不同的探針分子固定到不同編碼的玻璃微球表面；e、 微流控晶片的連接進口 1通過管線連接樣品池，出口 2接往復式微注 射泵；f、 進樣通過注射泵將編碼微球連同其運載緩衝液吸入長通道3，然後進 入反應池4，最後抽乾運載緩衝液，編碼微球留在反應池4中；g、 反應通過注射泵將待檢測溶液吸入長通道3，最後進入反應池4中與 編碼微球表面的探針分子進行反應；h、 洗滌反應完畢後，通過注射泵從入口 1吸入洗滌緩衝液到反應池4 對微球進行充分洗滌；i、 檢測抽乾反應池4中的洗滌緩衝液，利用注射泵從出口 2注入微球的運載緩衝液，運載緩衝液將微球帶入長通道3，微球依次通過長通道3, 並在長通道3中依次被檢測。
權利要求
1、一種基於微球生物檢測的微流控晶片，其特徵在於該生物晶片由位於上半部的蓋片和位於下半部的基片所組成；在基片或蓋片內設有功能性的微通道網絡，在微通道網絡中設有具有編碼的微球作為生物分子檢測的載體，在微通道網絡中，反應池(4)的外周是篩分管道(6)，篩分管道(6)的外周是輔助管道(5)，輔助管道(5)與出口(2)相接，反應池(4)通過長通道(3)接進口(1)。
2、 根據權利要求1所述的一種基於微球生物檢測的微流控晶片，其特徵在 於生物分子檢測以微球作為載體，微球具有編碼，在微球的表面固定有生物分 子探針，所用的生物分子探針可以是核酸、蛋白質、多肽中的一種。
3、 根據權利要求1和2所述的一種基於微球生物檢測的微流控晶片，其特 徵在於在晶片反應池(4)中進行微球與待測樣品的反應；待測溶液和洗滌緩 衝液通過進口 (1)進入反應池(4)，在反應池(4)中與微球反應或洗滌微球， 反應結束微球被輸入通道(3)中檢測並輸出。
4、 根據權利要求2所述的一種基於微球生物檢測的微流控晶片，其特徵 在於微球作為探針分子載體，其材料可以是玻璃、或聚苯乙烯和橡膠，微球的 大小在50ym 3O0um之間；晶片的基質材料可以是玻璃、矽、聚甲基丙烯 酸甲酯PMMA、聚二甲基矽氧垸PDMS及聚碳酸酯PC中的一種。
5、 根據權利要求1或2所述的一種基於微球生物檢測的微流控晶片，其 特徵在於編碼微球是條形碼編碼、螢光編碼、量子點編碼、光子晶體編碼、拉 曼標籤編碼、紅外光譜編碼、形狀編碼、射頻編碼、大小編碼以及位置編碼中 的一種。
6、 根據權利要求1所述的一種基於微球生物檢測的微流控晶片，其特徵 在於反應池(4)的直徑在200 u m 1200 um之間，長通道(3)寬度在60u m 550um之間，長度在10mm 50mm之間。
全文摘要
一種基於微球生物檢測的微流控晶片可以用來檢測蛋白質、核酸等生物大分子，在臨床檢測、檢驗檢疫、環境監測、藥物篩選、微生物鑑定以及核酸和蛋白功能分析等領域具有廣泛的應用前景。該生物晶片由位於上半部的蓋片和位於下半部的基片所組成；在基片內設有微通道網絡，在微通道中設有具有編碼的微球作為生物檢測中探針分子的固相載體，在微通道的兩頭設有一個進口(1)、一個出口(2)，一個長通道(3)、一個反應池(4)，一組輔助管道(5)以及篩分管道(6)。在晶片的使用過程中，樣品的進樣、反應以及反應結果的檢測都在晶片上進行，具有集成度高，使用方便，樣品消耗量小，檢測靈敏度高等優點。
文檔編號G01N33/48GK101221168SQ20081001939
公開日2008年7月16日 申請日期2008年1月8日 優先權日2008年1月8日
發明者靖 扈, 趙文舉, 趙祥偉, 趙遠錦, 顧忠澤 申請人:東南大學