培養基及其應用的製作方法
2024-03-27 23:35:05
本發明涉及細胞領域，特別涉及培養基及其應用。
背景技術：
：間充質幹細胞是一類存在於多種組織(如骨髓、臍帶血和臍帶組織、胎盤組織、脂肪組織等)，具有多向分化潛力，非造血幹細胞的成體幹細胞。這類幹細胞具有向多種間充質系列細胞(如成骨、成軟骨及成脂肪細胞等)或非間充質系列細胞分化的潛能，並具有獨特的細胞因子分泌功能。許多臨床應用已經證實，間充質幹細胞能解決多種血液系統疾病，心血管疾病，肝硬化，神經系統疾病，膝關節半月板部分切除損傷修復，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。許多的研究也證實，間充質幹細胞分泌的營養物質也具有與間充質幹細胞相似的作用，現在，越來越多的學者相信，間充質幹細胞分泌的營養物質或許比細胞本身的作用更加重要。MSCs能分泌包括血管內皮生長因子(vEGF)、胎盤生長因子(PGF)、成纖維細胞生長因子(FGFs)、血小板源生長因子(PDGF)、轉化生長因子(TGF-β)、肝細胞生長因子(HGF)等在內的各種生長因子，這些生長因子可參與多種細胞反應。而穩定可靠的培養條件下收集的條件培養基是取得細胞分泌的營養物質的有效手段。條件培養製備的方法有很多，方法一，如去掉培養用培養基後，條件無血清培養基繼續培養後收集條件培養基；方法二，直接收集培養後含血清或血清替代物的條件培養基，含有間充質幹細胞的條件培養基的角膜內皮細胞培養用培養基等。但牛血清成分複雜，來源不穩定，使得條件培養基的質量不可控制且存在潛在威脅。技術實現要素：有鑑於此，本發明提供了培養基及其應用。培養基使用DMEMF12+非必需胺基酸，營養更佳豐富，為細胞合成各種活性蛋白提供更豐富廣泛的來源，提高了蛋白獲得量。使用該培養基培養間充質幹細胞收集得到的條件培養基培養間充質幹細胞，細胞數量和活性顯著提高。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：本發明提供了一種培養基，包括基礎培養基和非必需胺基酸。在本發明的一些具體實施方案中，所述培養基中所述非必需胺基酸選自甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬醯胺、L-天冬氨酸、L-穀氨酸、L-脯氨酸或L-絲氨酸。在本發明的一些具體實施方案中，所述培養基中所述基礎培養基為DMEMF12。在本發明的一些具體實施方案中，所述培養基中所述非必需胺基酸在所述基礎培養基中的濃度為0.05～0.2mM。在本發明的一些具體實施方案中，所述培養基中所述培養基的使用劑量為：每2.5×104個細胞使用所述培養基0.1～0.2mL。本發明還提供了所述培養基在培養間充質幹細胞中的應用。本發明還提供了所述培養基在培養間充質幹細胞收集條件培養基中的應用。本發明還提供了一種間充質幹細胞條件培養基的製備方法，取間充質幹細胞初步培養後，與本發明提供的所述培養基混合後繼續培養，收集培養上清。在本發明的一些具體實施方案中，所述製備方法中所述初步培養為取P1～P5代的間充質幹細胞(不限來源，包括脂肪、臍帶、牙髓、羊膜等)，使用DMEMF12+10％FBS+0.05～0.1mMNEAA培養，當細胞處於指數生長期，匯合度達到70～90％，去培養上清，用PBS洗滌。本發明還提供了所述製備方法製得的間充質幹細胞條件培養基。本發明提供了一種培養基，包括基礎培養基和非必需胺基酸。該培養基使用DMEMF12+非必需胺基酸，營養更佳豐富，為細胞合成各種活性蛋白提供更豐富廣泛的來源，提高了蛋白獲得量。使用該培養基培養間充質幹細胞收集得到的條件培養基培養間充質幹細胞，細胞數量和活性顯著提高。附圖說明為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1示細胞增殖情況。具體實施方式本發明公開了培養基及其應用，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。1、取P1～P5代的間充質幹細胞(不限來源，包括脂肪、臍帶、牙髓、羊膜等)，使用DMEMF12+10％FBS+0.05～0.1mMNEAA培養，當細胞處於指數生長期，匯合度達到70～90％，去培養上清，用PBS洗兩遍後，加入0.1～0.2ml/cm2(cm2為培養皿或培養板的底面積，約2.5×104個細胞)的DMEMF12+0.05～0.2mMNEAA靜置培養24h後，收集條件培養基；再加入0.1～0.2ml/cm2(cm2為培養皿或培養板的底面積，約2.5×104個細胞)的DMEMF12+0.05～0.2mMNEAA繼續培養24h後，收集條件培養基；再加入0.1～0.2ml/cm2(cm2為培養皿或培養板的底面積，約2.5×104個細胞)的DMEMF12+0.05～0.2mMNEAA繼續培養24h後，收集最後一次條件培養基。把三天收集的條件培養合併。第一次為細胞培養基，是為了細胞增殖；後續三次是無血清的的細胞培養基，是為了收集條件培養基。2、收集到的條件培養基200～400g離心5～10min，取上清，過0.22μm濾膜。3、3KD濾膜包超濾濃縮至1/5到1/20原體積，所得即為製備所得的條件培養基。本發明提供了一種培養基，包括基礎培養基和非必需胺基酸。該培養基使用DMEMF12+非必需胺基酸，營養更佳豐富，為細胞合成各種活性蛋白提供更豐富廣泛的來源，提高了蛋白獲得量。使用該培養基培養間充質幹細胞收集得到的條件培養基培養間充質幹細胞，細胞數量和活性顯著提高。本發明提供的培養基及其應用中所用原料及試劑均可由市場購得。市售的DMEMF12培養基(GIBCO貨號：12400-024)；NEAA(GIBCO貨號：11140-050)成分如下：(單位mM，濃度均為0.05～0.2mM)；包括Glycine；L-Alanine；L-Asparagine；L-Asparticacid；L-GlutamicAcid；L-Proline；L-Serine。下面結合實施例，進一步闡述本發明：實施例11、取P1代的脂肪間充質幹細胞(使用DMEMF12+10％FBS+NEAA培養，當細胞處於指數生長期，匯合度達到80％，去培養上清，用PBS洗兩遍後；加入0.1ml/cm2的DMEMF12+0.1mMNEAA靜置培養24h後，收集條件培養基；再加入0.1ml/cm2DMEMF12+0.1mMNEAA繼續培養24h後，收集條件培養基；再加入0.1ml/cm2DMEMF12+0.1mMNEAA繼續培養24h後，收集最後一次條件培養基。把三天收集的條件培養合併。2、收集到的條件培養基200g離心5min，取上清，過0.22μm濾膜。3、3KD濾膜包超濾濃縮至1/5原體積，所得即為製備所得的條件培養基。對比例1、取P1代的脂肪間充質幹細胞(使用DMEMF12+10％FBS+NEAA培養，當細胞處於指數生長期，匯合度達到80％，去培養上清，用PBS洗兩遍後；加入0.1ml/cm2的DMEM靜置培養24h後，收集條件培養基；再加入0.1ml/cm2DMEM繼續培養24h後，收集條件培養基；再加入0.1ml/cm2DMEM繼續培養24h後，收集最後一次條件培養基。把三天收集的條件培養合併。2、收集到的條件培養基200g離心5min，取上清，過0.22μm濾膜。3、3KD濾膜包超濾濃縮至1/5原體積，所得即為製備所得的條件培養基。實施例3使用bradford法檢測獲得的總蛋白量，結果如表1所示：(單位：μg/ml)表1單位：μg/ml123實施例1115123120對比例766981結果可見，發明組(實施例1製得的條件培養基)獲得的蛋白量明顯高於對比組(對比例)，P<0.01。使用條件培養基培養P15代的脂肪間充質幹細胞，檢測其增殖情況：陰性對照：DMEMF12+10％FBS+0.1mMNEAA對照組：DMEMF12+10％FBS+0.1mMNEAA+20％對照組(對比例)條件培養基發明組：DMEMF12+10％FBS+0.1mMNEAA+20％發明組(實施例1)條件培養基，每組設三個重複，連續培養7天，結果如表2所示：表2由圖1、表2可看出，細胞培養至第五天後，進入平臺期，細胞增殖緩慢，但發明組在連續7天後，細胞數量明顯高於其餘兩組，即發明組對P15代細胞的促進作用強於對照組及陰性對照組(P<0.05)，證明發明組不但蛋白含量高於對照組，活性也高於對照組。實施例41、取P3代的臍帶間充質幹細胞，使用DMEMF12+10％FBS+0.1mMNEAA培養，當細胞處於指數生長期，匯合度達到70％，去培養上清，用PBS洗兩遍後，加入0.2ml/cm2的DMEMF12+0.05mMNEAA靜置培養24h後，收集條件培養基；再加入0.2ml/cm2DMEMF12+0.05mMNEAA繼續培養24h後，收集條件培養基；再加入0.2ml/cm2DMEMF12+0.05mMNEAA繼續培養24h後，收集最後一次條件培養基。把三天收集的條件培養合併。2、收集到的條件培養基400g離心10min，取上清，過0.22μm濾膜。3、3KD濾膜包超濾濃縮至1/20原體積，所得即為製備所得的條件培養基。4、使用bradford法檢測獲得的總蛋白量，蛋白濃度為：201μg/mL。陰性對照組及對照組同實施例3。取製得的條件培養基按照實施例3的實驗方法檢測，實驗結果與實施例1製得條件培養基的效果相近，兩者無顯著差異(P＞0.05)。發明組對細胞的促進作用強於對照組及陰性對照組(P<0.05)，證明發明組不但蛋白含量高於對照組，活性也高於對照組。表3實施例51、取P5代的羊膜間充質幹細胞，使用DMEMF12+10％FBS+0.1mMNEAA培養，當細胞處於指數生長期，匯合度達到90％，去培養上清，用PBS洗兩遍後，加入0.15ml/cm2的DMEMF12+0.2mMNEAA靜置培養24h後，收集條件培養基；再加入0.15ml/cm2DMEMF12+0.2mMNEAA繼續培養24h後，收集條件培養基；再加入0.15ml/cm2DMEMF12+0.2mMNEAA繼續培養24h後，收集最後一次條件培養基。把三天收集的條件培養合併。2、收集到的條件培養基300g離心8min，取上清，過0.22μm濾膜。3、3KD濾膜包超濾濃縮至1/20原體積，所得即為製備所得的條件培養基。4、使用bradford法檢測獲得的總蛋白量，蛋白濃度為：261μg/mL。陰性對照組及對照組同實施例3。取製得的條件培養基按照實施例3的實驗方法檢測，實驗結果與實施例1製得條件培養基的效果相近，兩者無顯著差異(P＞0.05)。發明組對細胞的促進作用強於對照組及陰性對照組(P<0.05)，證明發明組不但蛋白含量高於對照組，活性也高於對照組。表4以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁1 2 3