一種電化學發光快速檢測抗生素ZwittermicinA濃度的方法與流程
2024-03-27 23:28:05
本發明是抗生素的在線檢測，屬於生物技術領域，特別涉及一種電化學發光快速檢測抗生素Zwittermicin A濃度的方法。
背景技術：
Zwittermicin A（ZwA）是蘇雲金芽胞桿菌（英文縮寫Bt）和蠟狀芽胞桿菌（英文縮寫Bc）在發酵過程中產生的一種抗生素，於1994年由Siol-Suh等人首次分離出來，簡寫為ZwA，其結構式參見說明書附圖，圖1 ZwA的分子結構式（分子量396D）。
農藥的使用影響環境生態，生物防治是將來的發展方向。在生物防治中，雖然Bt菌殺蟲晶體蛋白的應用可以降低農藥的使用量，但是殺蟲效果緩慢。近年來的研究發現，ZwA與Bt菌殺蟲晶體蛋白的殺蟲效果有協同作用。即ZwA對Bt菌產生的殺蟲晶體蛋白起到很好的增效作用，能夠起到減少Bt殺蟲晶體蛋白的使用量，延緩害蟲抗性的產生，拓寬殺蟲譜。
目前，國內外一直沒有ZwA標準品，為此，建立對其檢測方法的開發極為困難。已經具有的ZwA檢測方法：⑴生物活性檢測法，即ZwA對草生歐文氏桿菌有抑菌作用，依據抑菌圈的大小判斷ZwA含量；⑵茚三酮顯色分光光度計檢測法，茚三酮使ZwA由無色變有色，計算出含量；⑶HPLC檢測法，色譜條件：色譜柱C18（10mm×25cm），210nm紫外檢測器，5mmol/L醋酸銨為流動相，流速為l.0mL/min，ZwA的保留時間為2.27min。
技術實現要素：
本發明的目的是為了針對現有技術中檢出限高、專一性差等缺陷，提供一種操作更加簡單、檢出限更低、低成本的電化學發光快速檢測抗生素Zwittermicin A濃度的方法。
具體步驟為：
(1)用二次蒸餾水作為溶劑，分別配製5mmol/L的三聯吡啶釕溶液（Ru(bpy)32+）、60mmol/L 且pH值為8.5的 Na2HPO4-NaOH緩衝溶液和1mg/mL的Zwittermicin A標準溶液，其中1mg/mL的Zwittermicin A標準溶液用於繪製標準曲線。
(2)在流動注射化學發光分析儀的檢測池中加入150µL步驟(1)配製的緩衝溶液、100µL步驟(1)配製的三聯吡啶釕溶液及20µL步驟(1)配製的Zwittermicin A標準溶液，使用循環伏安法對步驟(1)配製的Zwittermicin A標準溶液進行測試，設定初始電壓為0.2V，高電位為1.25V，低電位為0.2V，掃描速率為0.1V/s，靜止時間為4s，光電倍增管的高壓為800V，空白樣即緩衝溶液和三聯吡啶釕溶液的化學發光強度記為Io，Zwittermicin A樣品的化學發光強度記為Is，增光強度記為△I，△I=Is-Io，該測試過程中光電倍增管及所用試劑均在30℃恆溫條件下進行。
(3)根據步驟(2)中對步驟(1)配製的Zwittermicin A標準溶液進行測試的結果，繪製標準曲線，並作出標準曲線方程：△I=206.31x+26.677，其中x為Zwittermicin A的濃度，其單位為mg/mL，其取值範圍為0.001~0.1，R2=0.9947。
(4) Zwittermicin A樣品的濃度測定：重複步驟(2)的操作過程，將Zwittermicin A標準溶液換為待測Zwittermicin A樣品，測試其化學發光強度Is，計算出增光強度△I，代入步驟(3)作出的標準曲線方程，即計算出Zwittermicin A樣品的濃度x。
本發明方法操作簡單，靈敏度高，重複性好，線性範圍寬，被檢測樣品用量少，且所使用儀器設備簡單，檢測成本低，能夠在線進行常規性測定，易於應用到工業或農業生產中。
附圖說明
圖1為本發明中Zwittermicin A的結構式。
圖2為本發明實施例中繪製的Zwittermicin A標準曲線。
具體實施方式
以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的試驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為常規生化試劑公司購買得到的。
實施例：
本實施例中所用的儀器均為IFFM-E型流動注射化學發光分析儀（西安瑞邁電子有限公司）。分析過程中採樣、注樣、實驗數據採集及處理，均由Windows XP系統下IFFM-E型流動注射化學發光分析儀完成。
本實施例中，抗生素ZwA純品：≧85%，實驗室自己分離提取；抗生素活性檢測指示菌：草生歐文氏桿菌LS005，菌種由中國農業科學院植物保護研究所提供。
具體步驟為：
(1)用二次蒸餾水作為溶劑，分別配製5mmol/L的三聯吡啶釕溶液（Ru(bpy)32+）、60mmol/L 的pH 8.5的 Na2HPO4-NaOH緩衝溶液和1mg/mL的Zwittermicin A標準溶液，其中1mg/mL的Zwittermicin A標準溶液用於繪製標準曲線。
(2)在IFFM-E型流動注射化學發光分析儀（西安瑞邁電子有限公司）的檢測池中加入150µL步驟(1)配製的緩衝溶液、100µL步驟(1)配製的三聯吡啶釕溶液及20µL步驟(1)配製的Zwittermicin A標準溶液，使用循環伏安法對步驟(1)配製的Zwittermicin A標準溶液進行測試，設定初始電壓為0.2V，高電位為1.25V，低電位為0.2V，掃描速率為0.1V/s，靜止時間為4s，光電倍增管的高壓為800V，空白樣即緩衝溶液和三聯吡啶釕溶液的化學發光強度記為Io，Zwittermicin A樣品的化學發光強度記為Is，增光強度記為△I，△I=Is-Io，該測試過程中光電倍增管及所用試劑均在30℃恆溫條件下進行。
(3)根據步驟(2)中對步驟(1)配製的Zwittermicin A標準溶液進行測試的結果，繪製標準曲線，並作出標準曲線方程：△I=206.31x+26.677，其中x為Zwittermicin A的濃度，其單位為mg/mL，其取值範圍為0.001~0.1，R2=0.9947。
(4) Zwittermicin A樣品的濃度測定：重複步驟(2)的操作過程，將Zwittermicin A標準溶液換為待測Zwittermicin A樣品，測試其化學發光強度Is，計算出增光強度△I=5，代入步驟(3)作出的標準曲線方程，即計算出Zwittermicin A樣品的濃度x。