膽鹼單氧化物酶基因及培育耐旱耐鹽植株的方法
2024-03-27 17:32:05
專利名稱：膽鹼單氧化物酶基因及培育耐旱耐鹽植株的方法
技術領域：
本發明涉及膽鹼單氧化物酶，編碼該酶的基因，含有該基因的植物表達載體以及培育耐鹽耐旱植株的方法。
乾旱和鹽害是造成作物減產的主要原因，培育耐旱耐鹽作物是育種的主要目標之一。甜菜鹼是一種植物滲透調節劑。在植物中，其生物合成涉及2個酶膽鹼單氧化物酶(CMO)和甜菜鹼醛脫氫酶(BADH)。CMO參於甜菜鹼合成的第一步反應，乾旱和鹽鹼誘導該酶的表達。山菠菜(Atriplex hortensis)是一種耐鹽植物，發明人已從山菠菜中克隆了CMO基因cDNA並構建了分別適用於單，雙子葉植物的表達載體，轉化模式植物菸草，轉基因菸草有明顯的高耐鹽性和高耐旱性。
本發明的一個目的是提供一種具有較強的抗乾旱和抗鹽鹼效果的膽鹼單氧化物酶，這種酶來源於山菠菜(Atriplex hortensis)。其胺基酸序列示於
圖1。
本發明的另一個目的是提供一種編碼本發明的膽鹼單氧化物酶的基因。在一個優選的實施方案中，所述的基因具有如
圖1所示的核苷酸序列。
本發明的再一個目的是提供一種培育耐鹽耐旱植株的方法，該方法包括用本發明的膽鹼單氧化物酶的基因構建植物表達載體；用構建的植物表達載體轉化植物細胞；將轉化的植物細胞培育成植株。
本發明的又一個目的是提供一種含有所說的膽鹼單氧化物酶的基因的表達載體。可使用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的表達載體。這些植物表達載體包括，但不限於，雙元農桿菌載體，例如Bin 19(Bevan，M.，1984，核酸研究128711-8721)以及用於單子葉植物微彈轟擊的載體。載體可還包括3』非翻譯區域。3』非翻譯區域是指一種基因的部分，它含有一種包含聚腺苷酸信號和任何其它的可效應mRNA加工或基因表達的DNA片段。聚腺苷酸信號引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3』端。3』區域的例子包括含有農桿菌腫瘤誘導(Ti)質粒基因(例如胭脂鹼合成酶(Nos基因))，和植物基因(例如大豆貯存蛋白質基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)的小亞單位基因)的3』轉錄的非翻譯區域。本發明的膽鹼單氧化物酶的3』非翻譯區域可被用於在植物中表達。
本發明的載體也可含有適當的啟動子。在本發明中可使用任何一種強啟動子。這些啟動子包括但不限於花椰菜花葉病毒(CAMV 35S)。它可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用。
本發明的表達載體在需要時也可包括增強子，不論是翻譯增強子或轉錄增強子。這些增強子區域包括但不限於ATG起始密碼子和鄰接區域。起始密碼子必需與編碼序列的閱讀框同相，以保證整個序列的翻譯。翻譯控制信號和起始密碼子可以是多種不同的來源，可以是天然的或合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域，或來自結構基因。
為了便於轉化的植物細胞的鑑定，可對本發明的載體進行進一步的基因工程操作以包括植物可選擇性標記。可使用的選擇性標記包括對抗生素抗性的酶，抗生素包括慶大黴素，潮黴素，卡那黴素等。同樣，可使用可產生通過顏色變化(例如GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶))或發光(例如螢光酶)來識別的化合物的酶。
本發明的表達載體可通過使用Ti質粒，Ri質粒，植物病毒載體，直接的DNA轉化，微注射，電穿孔等導入植物細胞。對這些技術的綜述參見Weissbach和Weissbach，植物分子生物學方法(Method for Plantmolecular Biology)，Academy Press，New York VIII，pp.421-463(1988)；和Geiserson和Corey，植物分子生物學(Plant Molecular Biology)，第二版(1988)。
可使用本發明的方法轉化的植物宿主包括單子葉植物和雙子葉植物，例如玉米，大麥，小麥，水稻，黑麥，燕麥，菸草等。
以發明人克隆的菠菜CMO cDNA為探針篩選了2.5×105未擴增斑得到37個陽性斑，其插入片段為1.77Kb。克隆片段測序採用Taq DyePrimer Cycle Sequencing試劑盒(Amersham)在ABI377型自動測序儀上進行。該片段包含一個1314bp的開放讀碼框，編碼由438個胺基酸組成的多肽，其5』端為136bp，3』端為314bp。山菠菜CMO cDNA全序列及胺基酸序列見
圖1。2.山菠菜CMO活性與環境脅迫的關係以2.0％NaCl溶液連續處理山菠菜4天，分別在1，2，3和4天收集葉片，提取RNA作Northern分析。結果表明CMO基因的表達量隨鹽脅迫的時間而增加。處理4天的表達量約為處理前的4倍。因此，CMO基因是受鹽誘導的(圖2)。二.CMO基因植物表達質粒的構建和農桿菌介導轉化CMO cDNA植物表達載體的構建按常規方法進行。雙元表達載體pBI121含35S啟動子和翻譯增強子TMV的Ω片段。CMO cDNA經EcoRI和SalI酶切後扦入pBI121.得到的含35S啟動子的植物表達載體直接轉導農桿菌AGL1將約5mm大小的無菌菸草葉片分別浸入稀釋5倍的AGL1農桿菌液中，約30min後取出，放在無菌濾紙上，吸去菌液，接種在MS2培養基(MS基本培養基含1mg/6-BA，0.1mg/LIAA)中共培養3天後轉入篩選培養(MS2含100mg/L卡那酶素和600mg/L頭孢黴素)。對照用含pBI121的農桿菌侵染，共得到轉CMO基因的植株7棵。用無性培養技術每棵繁殖6棵備用。三.轉基因植株的耐鹽性和耐旱性測定將轉基因植株和對照都分別移栽到含0，0.9，1.2，1.5％的NaCl和10％PEG-6000的MS培養基中繼續生長，在0.9％和1.2％的鹽濃度下，7個轉基因株系均長勢良好，而同時移載的對照則葉片發黃，生長停滯；在1.5％的鹽濃度下，轉基因植株和對照均不能正常生長，葉片發黃並死亡(圖3)。在10％PEG-6000中7株轉基因植株均長勢良好，而對照萎蔫，生長停滯(圖4)。四.轉基因植株的分子鑑定Northern分析按常規進行，結果示於圖5。五.CMO基因在山菠菜基因組中的分析山菠菜總DNA經BamHI，DraI，EcoRI和HindIII完全酶解後以CMOcDNA為探針作Southem分析，由於CMO cDNA中不含BamHI和DraI切點，含EcoRI和HindIII各1個切點。BamHI酶切時僅檢測到1條雜交帶，說明CMO基因在山菠菜基因組中僅含1個拷貝。其他酶切時有多條雜交帶暗示在CMO全基因中含多個內含子(圖6)。
權利要求
1.一種來源於山菠菜(Atriplex hortensis)的分離的膽鹼單氧化物酶。
2.按照權利要求1所述的膽鹼單氧化物酶，它具有如下的胺基酸序列M A A S A T T M L L K Y P T T V C G I P N S S A 24N N S T D P S N N I V Q I P Q T T T T N S P L L 48K F R T P N K P V N A V A A P A F P S V T T T T 72T T T P S S I Q S L V K D F D P L V P A E D A L 96T P P S S W Y T E P A F Y A H E L D R I F Y K G 120W Q V A G Y S D Q V K E A N Q Y F T G T L G N V 144E Y L V C R D G E G K V H A F H N V C T H R A S 168I L A C G S G K K S C F V C P Y H G W V Y G M N 192G S L T K A S K A T P E Q S L N P D E L G L V P 216L K V A V W G P F I L I S L D R S S R E V G D V 240G S E W L G S C A E D V K A H A F D P N L Q F I 264N R S E F P I E S N W K I F S D N Y L D S S Y H 288V P Y A H K Y Y A T E L D F D T Y Q T D M V G N 312V T I Q R V A G T S N N G F N R L G T Q A F Y A 336F A Y P N F A V E R Y G P W M T T M H I V P L G 360P R K C K L V V D Y Y I E K S K L D D K D Y I E 384K G I A I N D N V Q K E D V V L C E S V Q K G L 408E T P A Y R S G R Y V M P I E K G I H H F H C W 432L H Q V L K * 438
3.一種編碼權利要求1或2的膽鹼單氧化物酶的基因。
4.按照權利要求3所述的基因，它具有如下所示的核苷酸序列atacaggcctcgagggccgaattccgttgctgtcgattgttgatcattcatctcatcacctcct64tatatattatattaaaataaattaataaatattaacaaggaagtgtttaagtttgttgatcatacaacaatc 136ATGGCAGCAAGTGCAACAACAATGTTGCTAAAATACCCAACTACTGTTTGTGGAATACCAAATTCATCCGCA 208AACAATTCTACTGATCCTTCAAATAACATCGTCCAAATTCCACAAACTACTACTACTAATAGCCCGCTACTT 280AAGTTCCGTACTCCTAATAAACCCGTTAACGCCGTCGCTGCCCCGGCTTTTCCGTCCGTAACCACCACTACA 352ACCACCACTCCGTCGTCCATCCAATCACTTGTCAAGGATTTCGATCCTCTTGTTCCGGCCGAGGATGCTCTT 424ACTCCTCCTAGCTCTTGGTATACCGAACCTGCCTTCTATGCTCATGAACTTGACCGTATCTTTTACAAAGGA 496TGGCAAGTCGCAGGGTACAGTGATCAAGTTAAGGAGGCTAACCAATATTTCACCGGAACGTTAGGAAATGTT 568GAATATTTGGTGTGTCGAGATGGAGAAGGAAAAGTTCATGCATTTCACAATGTTTGCACCCATCGTGCATCT 640ATCCTTGCTTGTGGAAGTGGCAAAAAGTCATGTTTCGTATGCCCTTATCATGGATGGGTATATGGCATGAAT 712GGATCGCTTACGAAAGCTTCAAAAGCAACACCAGAACAATCACTAAATCCCGATGAACTTGGGCTTGTACCA 784CTAAAAGTTGCAGTATGGGGCCCATTTATACTCATCAGTTTGGACAGATCAAGCCGTGAAGTAGGTGACGTT 856GGATCTGAATGGCTTGGTAGTTGTGCTGAAGATGTTAAGGCCCATGCTTTTGACCCGAATCTTCAGTTCATT 928AATAGGAGTGAATTTCCAATTGAATCTAATTGGAAGATTTTCAGTGACAACTATTTGGATAGCTCTTACCAT 1000GTTCCTTATGCACACAAATACTATGCAACTGAGCTCGACTTTGATACTTACCAAACCGATATGGTTGGAAAT 1072GTCACGATTCAAAGGGTGGCTGGGACTTCAAACAATGGTTTTAATAGACTTGGAACTCAAGCCTTCTATGCT 1144TTTGCATACCCTAACTTTGCTGTGGAAAGGTATGGCCCTTGGATGACTACAATGCATATTGTTCCATTAGGA 1216CCAAGGAAATGCAAACTAGTGGTGGACTACTATATTGAAAAATCAAAGCTGGACGACAAGGATTACATCGAA 1288AAGGGCATAGCAATCAATGATAATGTGCAGAAAGAAGATGTGGTGTTGTGTGAAAGCGTCCAAAAAGGGTTG 1360GAGACACCAGCATATCGTAGTGGAAGATATGTGATGCCAATTGAGAAAGGAATTCACCATTTCCACTGCTGG 1432TTACACCAAGTGTTGAAGTGAttgcacccagattatatgtaatcttggtttctttccttctatgattggata 1504ttataataagtaaaattataatgtcatcatttagttgagattgttgttagagttgagcttatgctcattagt 1576aacgtgtgtatgtgtgtatgtgtttggtcatggtaaaaaatgtttgttattgctagaattttataataatag 1648tatggtgctgatgtccagtataaataaagaacatagcacccctttccctacttaagaaattatattccatat 1720attttcaggggaactatgagattgtctatgaacaaaaaaaaaaaaaa 1767
5.一種含有權利要求3所述的膽鹼單氧化物酶基因的植物表達載體。
6.一種培育耐鹽耐旱植株的方法，包括用權利要求3所述的膽鹼單氧化物酶的基因構建植物表達載體；用構建的植物表達載體轉化植物細胞；將轉化的植物細胞培育成植株。
7.按照權利要求6所述的方法，其中所述的植物表達載體是雙元農桿菌載體。
8.按照權利要求6所述的方法，其中所述的轉化是通過農桿菌介導或基因槍法進行的。
9.按照權利要求6所述的方法，其中所述的植物是單子葉植物或者雙子葉植物。
10.按照權利要求6所述的方法，其中所述的植物是菸草。
全文摘要
本發明提供了一種新的山菠菜膽鹼單氧化物酶,編碼該酶的基因,含有該基因的植物表達載體以及培育耐鹽耐旱植株的方法。本發明的基因可用於培育耐鹽耐旱植物。
文檔編號A01H5/00GK1328132SQ0010916
公開日2001年12月26日 申請日期2000年6月13日 優先權日2000年6月13日
發明者陳受宜, 沈義國, 張勁松, 杜保興 申請人:中國科學院遺傳研究所