一種用於貼壁培養細胞的培養基及其應用的製作方法

2024-03-28 01:11:05

本發明涉及細胞培養領域，更特別地，涉及一種用於貼壁培養細胞的培養基及其應用，還涉及一種貼壁培養mdck細胞的方法以及由此得到mdck細胞培養物。
背景技術：
：mdck細胞系(mdckcelllines)由madin和darby於1958年從美國cockerspaniel母曲架犬的腎臟組織分離培育建立，通常是以貼壁方式生長的上皮樣細胞。mdck細胞系廣泛用於多種病毒的擴增和純化，如：呼腸孤病毒、腺病毒、犬細小病毒、貓粒細胞缺乏症病毒及禽流感病毒等。由於其病毒感染效率高、增殖快，且不易變異，mdck細胞系被公認為最適於甲、乙型流感病毒疫苗生產的3種細胞系之一。傳統的mdck細胞培養大多採用有血清貼壁培養方式。血清的應用也存在許多問題：易受病毒、支原體或其他病原體的汙染；批間差異造成產品批次間的質量難以嚴格控制；大量血清蛋白的存在增加了下遊分離純化的難度，部分蛋白難以通過分離純化手段徹底去除，影響了產品的最終質量；此外，血清來源困難、價格昂貴，大規模動物細胞培養過程中使用血清將會大大增加生產成本。然而，如果培養基中不加血清，則會導致細胞無法貼壁。此外，現有的培養基培養的mdck細胞即便在同一批次中也是形態不一，鋪展不完全，並且細胞內部折光性差，沉澱顆粒較多。因此，需要一種新的培養基用於培養mdck細胞。技術實現要素：為解決以上問題，本發明提供了一種用於貼壁培養細胞的培養基，其在基礎培養基的基礎上包含了貼壁誘導組分，所述貼壁誘導組分由以下物質組成：氫化可的松、胰島素、前列腺素e1、轉鐵蛋白、三碘甲狀腺原氨酸。進一步地，所述貼壁誘導組分由以下物質組成：1-10×10-8mm氫化可的松、1-10μg/ml胰島素、1-10×10-8mm前列腺素e1、1-10μg/ml轉鐵蛋白、1-10×10-12mm三碘甲狀腺原氨酸。在一個優選實施方案中，所述基礎培養基為dmem/f12培養基。在一個優選實施方案中，所述細胞為mdck細胞。本發明還提供了上述培養基在貼壁培養mdck細胞中的應用。本發明還提供了一種貼壁培養mdck細胞的方法，其包括使用上述培養基培養mdck細胞的步驟。本發明還提供了一種mdck細胞培養物，其通過上述方法得到。本發明的培養基中不含血清，但是仍然具有誘導細胞貼壁的功能，並且尤其適合用於貼壁培養mdck細胞，培養得到的貼壁細胞形態完整，呈現明顯的上皮細胞樣，細胞折光性好，內部無明顯的顆粒沉澱物，可在疫苗研究中發揮更大的作用。附圖說明圖1為分別使用實施例1-4和傳統培養基培養的mdck細胞貼壁後的顯微照片。具體實施方式以下結合實例對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。1.無血清培養基的配製本發明的培養基通過將表1所示的成分添加至dmem/f12培養基中配製得到。表1向dmem/f12培養基中添加的成分實施例1實施例2實施例3實施例4氫化可的松(mm)1×10-84×10-88×10-810×10-8胰島素(μg/ml)14810mm前列腺素e1(mm)1×10-84×10-88×10-810×10-8轉鐵蛋白(μg/ml)14810三碘甲狀腺原氨酸(mm)1×10-84×10-88×10-810×10-82.mdck細胞的培養分別用上述實施例中配製得到的培養基培養mdck細胞，以傳統的dmem+10％血清為對照，培養方法如下：復甦細胞，離心，棄上清，加入k-1培養基，培養細胞，待細胞密度生長至80％，進行傳代。k-1培養基為無血清培養基，在胰蛋白酶消化後，需要離心去除胰蛋白酶，因為k-1沒有血清，不能抑制胰蛋白酶的作用，故需要離心。3.細胞貼壁後顯微鏡檢觀察驗證將上述培養得到的貼壁細胞放在顯微鏡下觀察，結果如圖1所示，使用傳統培養基培養的mdck細胞形態不均一，鋪展不完全，細胞內部折光性差，沉澱顆粒較多，而使用上述實施例培養得到的mdck細胞形態均一，貼壁後形態完整，呈現明顯的上皮細胞樣，細胞折光性好，內部無明顯的顆粒沉澱物。以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。當前第1頁12