一種辣椒品種培育用花葯誘導培養基配方的製造方法與工藝
2024-03-28 00:16:05
本發明涉及一種辣椒品種培育用花葯誘導培養基配方，具體涉及一種顯著提高辣椒花葯出愈率的誘導培養基配方，屬於農業科學技術領域。
背景技術：
辣椒（CapsicumannuumL.），又稱番椒、海椒、青椒、椒子等，為茄科蔬菜作物，一種重要的經濟作物，也是世界上普遍栽培的一種蔬菜作物。辣椒果皮、胎座組織中含有豐富的胡蘿蔔素和維生素C，特別是線椒中Vc含量居蔬菜之冠，因而營養價值極高。辣椒中含有的辣椒素具有增強食慾、幫助消化、增強人體抵抗力、抵禦多種疾病的作用。辣椒產量高，供應季節長，食用方式多樣，營養豐富，是一種深受人們喜愛的蔬菜。辣椒起源於中南美洲及墨西哥一帶的熱帶地區，1493年由哥倫布最初帶到西班牙，傳播到歐洲，再經印度於17世紀傳到中國，之後便在我國各地廣泛種植。雖然我國辣椒種植至今只有三百七十幾年的栽培歷史，但發展很快，我國甜辣椒種植面積和年產量不斷增長。近年來，除常規露地栽培外，設施種植面積也在不斷擴大，全國已形成數個甜辣椒規模化生產基地。據統計，2005年我國甜辣椒種植面積達到130萬hm2，約佔全國蔬菜種植面積的10%，各地市場甜辣椒基本實現了周年供應。現在中國已是世界上最大的辣椒種植國，同時，也是世界上幹辣椒的主要生產和出口國家，遠銷俄羅斯、新加坡、馬來西亞、韓國及歐洲等國和地區。辣椒在我國農業生產中具有十分重要的地位，開展辣椒的遺傳育種研究工作具有重要意義。隨著人們生活水平的提高，對辣椒品質的要求不斷提高；同時保護地栽培技術的推廣，選育適用於保護地栽培的品種提到了廣大科技工作者的面前；由於我國尚未實行大規模集約化生產，重茬嚴重，導致病毒病、炭疽病和疫病等大面積發生，已成為影響辣椒生產的重大障礙。因此，選育品質優良、適合不同條件栽培和抗病的辣椒新品種，已成為廣大育種工作者急需解決的問題。常規辣椒育種多利用雜種優勢育種，即選用兩個雜交配合力高的、雜種優勢表現明顯和性狀互補性強的純系品種或自交系或不育系進行人工授粉生產雜交種子。但是辣椒是一種常異花授粉植物，天然雜交率為4%～10%，有的品種達25%，而通過自交分離選育純化而穩定的自交系，一般需要進行5～6代選擇才能獲得，不僅時間長，而且基因之間存在顯隱性關係，很難選育出綜合性狀優良、具有突出優點且配合力強、適宜作為強優勢親本的品系，而且會造成作物遺傳多樣性下降和有益基因的流失。隨著植物組織培養技術的發展，植物細胞具有全能性得到廣泛證實，因此，在離體條件下培養花葯，人為改變小孢子的發育途徑，使其配子體發育途徑終止，轉向孢子體發育，通過胚發生或器官發生途徑，形成完整的單倍體植株，為人工大量生產單倍體植株提供了有效手段。單倍體育種作為一種新的育種途徑，通過培育單倍體，然後對單倍體材料進行加倍，在較短時間內便可以選育出適宜作為強優勢親本的純系，同時由於不存在基因間的顯隱性關係，因此一些由隱性基因控制的性狀便可以得到充分利用，這樣既大大縮短了育種年限，又能豐富所選優良品系的遺傳基礎，這樣的品系易於實現親本的選配。因此，進行辣椒單倍體培養技術的研究，無疑對於選育具有突出優點的親本品系，加速育種進程，培育強優勢辣椒組合具有重要意義。辣椒花葯培養工作開始較早，自20世紀70年代初，國內外眾多學者對辣椒花葯培養進行了研究。1973年，王玉英和George報導獲得了辣椒單倍體植株。1981年Dumas等利用花葯培養的技術成功獲得了3個不同遺傳來源的群體，並對影響花葯培養的主要因素進行了較為系統的研究，提出了一套有效的培養方法。1990年李春玲等報導成功選育出國內外第一個用花培法育成的辣椒品種「海花三號」，以後又相繼育成海豐1號、海豐2號、海豐5號、海豐12號、海豐14號等6個甜辣椒品種或雜交種，並在生產上推廣應用，表現出明顯的早熟性及豐產性。陳肖師等利用地方品種「易縣甜椒」進行花葯培養，育成了花培品種「塞花一號」。花葯培養作為新興技術，已廣泛應用於辣椒育種工作中。目前，辣椒花葯培養研究雖取得了較大進展，但在理論和應用上仍存在一些問題。關於辣椒小孢子由配子體發育途徑向孢子體途徑轉變，進而形成單倍體或雙單倍體植株的發育調控機理尚不明確。培養基成分及培養條件間相互作用關係不清楚，胚狀體或愈傷組織的誘導率和分化率較低，離實際應用要求有較大差距。因此，加快辣椒花培育種機理研究，開發出花葯愈傷誘導率分化率更高的培養基配方，具有重要的現實需求。培養基是花葯培養的物質基礎，直接關係到培養物的生長與分化，培養基組分是影響花培成功的一個非常重要的因素，多種辣椒花培實驗表明：培養基各組分的合適用量，以及它們之間一定的組合關係，可顯著影響花培效率，發現和優化組合花葯培養有機附加物質，可進一步提高花葯培養力。因此，培養基成分的優化，生長調節劑種類、配比及濃度的調節，有機附加物質的篩選等，均是篩選出培養效率更高的花培培養基的重要研究對象。通過多年辣椒花葯培養的摸索和實踐，我們進一步優化了基本培養基配方，並且不斷嘗試加入一些提高辣椒花葯誘導力的有機添加物並組合其種類搭配及濃度，最終摸索出了一種辣椒品種培育用花葯誘導培養基配方。我們的研究技術對於推動辣椒花培育種的產業化推廣無疑具有極大的現實意義。
技術實現要素：
本發明提供了一種辣椒品種培育用花葯誘導培養基，其特徵在於：該培養基的配方如下：KNO3900～1000mg/L，NH4NO3800～850mg/L，KH2PO4650～700mg/L，MgSO4∙H2O1100～1300mg/L，CaCl2∙2H2O200～250mg/L，Na2-EDTA72～78mg/L，FeSO4∙7H2O53～57mg/L，MnSO4∙H2O16～18mg/L，ZnSO4∙7H2O17～19mg/L，H3BO35.5～6.5mg/L，KI0.75～0.85mg/L，CuSO4∙5H2O0.02～0.03mg/L，CoCl∙6H2O0.025～0.035mg/L，NaMoO4∙2H2O0.2～0.3mg/L，AgNO34.5～5.5mg/L，肌醇90～110mg/L，維生素B10.45～0.55mg/L，維生素B60.45～0.55mg/L，煙酸4.5～5.5mg/L，甘氨酸1.8～2.2mg/L，葉酸0.45～0.55mg/L，環磷酸鳥苷0.25～0.35g/L，麥芽糖18～22g/L，蔗糖14～16g/L，植物凝膠4.5～5.5g/L；2，4-D0.5～0.7mg/L，激動素0.4～0.6mg/L，復酞核酸0.7～0.9mg/L，生物素0.04～0.06mg/L，維生素C40～50μmol/L，活性炭150～200mg/L，水解蛋白0.35～0.45g/L。所述的培養基配方的最佳含量為：KNO3950mg/L，NH4NO3825mg/L，KH2PO4675mg/L，MgSO4∙H2O1200mg/L，CaCl2∙2H2O225mg/L，Na2-EDTA75mg/L，FeSO4∙7H2O55mg/L，MnSO4∙H2O17mg/L，ZnSO4∙7H2O18mg/L，H3BO36.0mg/L，KI0.8mg/L，CuSO4∙5H2O0.025mg/L，CoCl∙6H2O0.03mg/L，NaMoO4∙2H2O0.25mg/L，AgNO35.0mg/L，肌醇100mg/L，維生素B10.5mg/L，維生素B60.5mg/L，煙酸5.0mg/L，甘氨酸2.0mg/L，葉酸0.5mg/L，環磷酸鳥苷0.3g/L，麥芽糖20g/L，蔗糖15g/L，植物凝膠5.0g/L；2，4-D0.6mg/L，激動素0.5mg/L，復酞核酸0.8mg/L，生物素0.05mg/L，維生素C45μmol/L，活性炭175mg/L，水解蛋白0.4g/L。所述的培養基配方的配製pH值為：5.6～6.0，最佳配製pH值為5.8。本發明所述的培養基具有高效率地誘導辣椒花葯產生花粉愈傷的優點，可以顯著提高辣椒花葯培養效率，加快辣椒良種培育進程。下面的實施例以及對比實驗可以清楚地反映本發明所述培養基的特點。具體實施方式實施例1配製如下配方的培養基：KNO3950mg/L，NH4NO3825mg/L，KH2PO4675mg/L，MgSO4∙H2O1200mg/L，CaCl2∙2H2O225mg/L，Na2-EDTA75mg/L，FeSO4∙7H2O55mg/L，MnSO4∙H2O17mg/L，ZnSO4∙7H2O18mg/L，H3BO36.0mg/L，KI0.8mg/L，CuSO4∙5H2O0.025mg/L，CoCl∙6H2O0.03mg/L，NaMoO4∙2H2O0.25mg/L，AgNO35.0mg/L，肌醇100mg/L，維生素B10.5mg/L，維生素B60.5mg/L，煙酸5.0mg/L，甘氨酸2.0mg/L，葉酸0.5mg/L，環磷酸鳥苷0.3g/L，麥芽糖20g/L，蔗糖15g/L，植物凝膠5.0g/L；2，4-D0.6mg/L，激動素0.5mg/L，復酞核酸0.8mg/L，生物素0.05mg/L，維生素C45μmol/L，活性炭175mg/L，水解蛋白0.4g/L，pH5.8。選擇辣椒品種新豐5號和朝天椒作為花葯培養供體，在晴日溫度較低、日照較弱的早上，選取生長於露地的無病蟲危害的花蕾（花萼與花瓣近等長或花瓣略長於花萼，鏡檢此時小孢子正處於單核晚期，為培養的最佳時期），取後立即於4℃冰箱中保存。接種前將花萼用自來水衝洗10-15min，75%乙醇浸20s，0.1%升汞消毒10min，然後無菌水衝洗3-4次，取出花葯置於盛有無菌吸水紙的培養皿中備用。接種時將花葯從花蕾中小心地切取出來，接種於盛有10ml培養基的60mm×15mm的培養皿中，每皿接種25-30枚花葯，然後用封口膜封口。花葯接種後先於33℃高溫下暗培養8天左右，之後25℃暗培養至胚狀體出現，花葯出胚後置於25℃光下培養，計算愈傷組織誘導率，然後轉移入再生培養基。愈傷組織誘導率（%）=（愈傷組織產生數/接種花葯總數）×100。實施例2配製如下配方的培養基（AgNO3添加濃度的優選）：KNO3950mg/L，NH4NO3825mg/L，KH2PO4675mg/L，MgSO4∙H2O1200mg/L，CaCl2∙2H2O225mg/L，Na2-EDTA75mg/L，FeSO4∙7H2O55mg/L，MnSO4∙H2O17mg/L，ZnSO4∙7H2O18mg/L，H3BO36.0mg/L，KI0.8mg/L，CuSO4∙5H2O0.025mg/L，CoCl∙6H2O0.03mg/L，NaMoO4∙2H2O0.25mg/L，肌醇100mg/L，維生素B10.5mg/L，維生素B60.5mg/L，煙酸5.0mg/L，甘氨酸2.0mg/L，葉酸0.5mg/L，環磷酸鳥苷0.3g/L，麥芽糖20g/L，蔗糖15g/L，植物凝膠5.0g/L；2，4-D0.6mg/L，激動素0.5mg/L，復酞核酸0.8mg/L，生物素0.05mg/L，維生素C45μmol/L，活性炭175mg/L，水解蛋白0.4g/L，pH5.8。AgNO3的添加濃度...