多功能主動靶向透明質酸-聚乳酸載體合成及其抗腫瘤藥物膠束製備方法

2023-11-06 06:58:02 1

多功能主動靶向透明質酸-聚乳酸載體合成及其抗腫瘤藥物膠束製備方法
【專利摘要】本發明屬於高分子化學和藥物製劑領域。具體涉及主動靶向透明質酸-聚乳酸載體的合成及其抗腫瘤藥物膠束的製備方法和應用；採用新型自組裝技術通過靜電作用，將兩親性的PEG嵌段聚酯共聚物與腫瘤靶向性配體透明質酸-聚乳酸共聚物自組裝形成多功能複合膠束，該載抗癌藥膠束與複合膠束組合物，能顯著提高難溶性腫瘤藥溶解性或水溶性抗癌藥的載藥量與包封率，體內能生物降解，能夠避免網狀內皮系統(RES)的吞噬和腎臟的排洩，具有長循環作用，多功能組合物突出優勢有腫瘤主動靶向作用，體內外藥效學參數明顯優於抗腫瘤藥普通注射劑。臨床上可接受的給藥途徑有注射給藥或黏膜給藥；劑型為注射劑、輸液劑、注射凍乾粉針劑或粉霧劑。
【專利說明】多功能主動靶向透明質酸-聚乳酸載體合成及其抗腫瘤藥 物膠束製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於高分子化學和藥物製劑領域。具體涉及主動靶向透明質酸-聚乳酸載 體的合成及其抗腫瘤藥物膠束的製備方法和應用；本發明還涉及具有主動靶向生物降解載 體與兩親性嵌段共聚物載體自組裝新技術。

【背景技術】
[0002] 癌症嚴重是危害人們健康和生命的常見病，全球每年新發病1200萬，死亡率高， 我國每年發病人數超過220萬，惡性腫瘤的發病死亡率在我國逐年上升已是不爭的事實， 並已成為造成我國居民疾病死亡的首要病因。據國家衛生部信息中心的報導，近年來危 害我國民眾的主要癌症類型依次為胃癌（21.76% )、肝癌（17.83% )、肺癌（15. 19% )、 食管癌（15.02% )、結直腸癌（4.54% )、白血病（3.53% )、子宮頸癌（1.64% )、鼻咽癌 (1.53% )和乳腺癌（1.49% )。
[0003] 目前癌症的臨床治療仍以化療為主，上市的紫杉醇和多西紫杉醇普通注射劑的毒 副作用大，缺點是化療藥物對癌細胞沒有選擇性，會導致相當數量正常細胞的死亡，熱點是 針對特定的癌症類型、特定病人研究開發更有針對性、副作用更少"靶向治療"。抗腫瘤藥物 新型製劑得以研究和開發。其中紫杉醇脂質體（力樸素）、白蛋白納米粒（Abmxane? )已 上市並應用與臨床。
[0004] EP0583955B1專利公開一種單甲基聚乙二醇-聚乳酸載多西紫杉醇膠束的製備 方法，將單甲基聚乙二醇聚乳酸和多西紫杉醇，在60°C水浴溶解於乙腈，將乙腈液緩慢滴 加到純化水中，攪拌lh，60°C常壓蒸發5h，膠束粒徑為50nm，載藥量為6%。Kim等採用 ΡΕΟ-b-PDLLA製備Genexol? -PM膠束，已進入臨床研究階段，然而該膠束存在藥物消除速 率過快的問題，劑量提高2. 5倍，該膠束血漿的AUC為Taxol的74. 1 %，血漿清除速率CL為 Taxol StJ 3fp [Kim S C,Kim D ff, Shim Y H, et al. In vivo evaluation of polymeric micellar paclitaxel formulation ：toxicity and efficacy. Journal of Controlled Release, 2007, 72(1) :191-202]。Glen S. Kwon等授權一種腫瘤多藥耐藥逆轉劑熱休克蛋白（Hsp-90)，採用 Hsp-90修飾PEG-b-PLA包載紫杉醇或雷帕黴素，薄膜旋轉蒸發法製備膠束，過濾除菌冷凍 乾燥即得載藥膠束凍乾粉，該膠束存在主要問題，A549荷瘤小鼠藥效學評價中，膠束組del 藥效遠低於市售製劑組[US8529917]。
[0005] 針對被動靶向載體嵌段共聚物膠束存在體內靶向性低問題，提出了靶向治療，是 指在細胞分子水平上，針對已經明確的致癌位點，來設計相應的治療藥物，藥物進入體內 會特異地選擇致癌位點來相結合發生作用，使腫瘤細胞特異性死亡，而不會波及腫瘤周圍 的正常組織細胞。通過靶向治療可以改善藥物在腫瘤部位的分布，上皮細胞癌、卵巢癌、直 腸癌、胃癌等多種腫瘤細胞表面陽性表達透明質酸受體⑶44, RHAMM、HARE和LYVE-1等，表 達量高，而正常細胞CD44、RHAMM受體陰性。將透明質酸與膠束傳遞系統結合，可
[0006] 透明質酸（HA)在人體內存在多種特異性受體，如⑶44, RHAMM、HARE和LYVE-1等， 而CD44、RHAMM在多種腫瘤（如上皮、卵巢、直腸、胃部腫瘤）均有過度表達。HA具有高度特 異性和生物相容性，HA修飾載體是設計和製備聚合物膠束親水鏈段介導腫瘤主動靶向成的 關鍵。將藥物主動靶向腫瘤細胞，從而提高藥物在腫瘤組織分布，達到腫瘤靶向治療目的。
[0007] Choi K Y等合成PEG修飾的透明質酸-5 β-膽烷酸聚合物，將聚合物溶於水相， 喜樹鹼DMS0溶液緩慢滴入聚合物水相，用透析法製備膠束。與成纖維細胞ΝΙΗ-3Υ3相比， 在CD44過表達SCC7癌細胞，細胞攝取量顯著增加。但該方法缺點是膠束的平均粒徑較大 為319. 6nm，另透明質酸包覆於PEG內部無法暴露，影響與靶細胞表面受體的作用，使藥物 難以從網狀內皮系統（RES)逃逸，被單核巨噬細胞系統（MPS)清除，降低了膠束中藥物在腫 瘤部位蓄積[Choi K Y，Yoon Η Y，Kim J-H，et al.，Smart nanocarrier based on PEGylated hyaluronic acid for cancer therapy. ACS nano,2011,5 (11) :8591-9]〇 Pitarresi G 合 成透明質酸接枝聚乳酸與聚乙二醇（HA-g-PLA-g-PEG)共聚，製備阿黴素膠束，該膠束通過 CD44受體介導內吞作用增加 HCT116細胞的攝取，但PLA接枝率較低為5. 0%，導致該膠束 載藥量低為4. 8%，包封率為9. 6%，抗腫瘤藥效降低[Pitarresi G，Palumbo F S，Albanese A, et al. , Self-assembled amphiphilic hyaluronic acid graft copolymers for targeted release of antitumoral dmg. J Drug Target, 2010,18 (4) :264-76] 〇
[0008] Yadav A K等製備阿黴素（D0X) HA-PEG-PLGA膠束，將PLGA-PEG-NH2溶於純化水中 加入HA和EDCA，磁力攪拌7h，冷凍乾燥得HA-PEG-PLGA。用沉澱分散法水相方法製備聚 合物膠束，包封率為87. 66%。藥動學結果表明，D0X膠束血漿藥物濃度遠低於游離D0X， 可能由於血漿中抗透明質酸酶和玻尿酸降解酶的作用分解膠束，降低藥物在血液循環滯 留時間[Yadav A K, Mishra P, Mishra A K, et al· , Development and characterization of hyaluronic acid-anchored PLGA nanoparticulate carriers of doxorubicin. Nanomedicine ：nanotechnology, biology, and medicine,2007,3(4) :246-57]〇 中國專 利201010228961授權一種透明質酸-C18膠束的製備方法，將HA-C18和紫杉醇溶於DMS0 中，磁力攪拌混合均勻，用透析法透析除有機溶劑和游離紫杉醇，粒徑為236. 6nm，載藥量為 9. 57%，與聚酯相比十八烷甲酸的生物相容性不好，今後臨床應用有困難。
[0009] 基於HA與聚酯兩親性生物降解載體修飾藥物傳遞系統，對於一些腫瘤治療具有 重大潛在應用價值，新型給藥系統對抗癌藥臨床應用提供理論依據。本發明以透明質酸為 主動靶頭通過與聚酯合成系列兩嵌段共聚物，以透明質酸為基礎構建的主動靶向藥物傳遞 系統，具有免疫原性低、生物相容性良好和可降解等優點，還具有低臨界膠束濃度和藥物緩 釋等特性；HA與CD44高表達的腫瘤細胞特異性結合，引導納米膠束在腫瘤細胞中主動蓄 集，達到主動靶向腫瘤細胞目的。


【發明內容】

[0010] 本發明涉及主動靶向透明質酸-聚乳酸載體的合成及其抗腫瘤藥物膠束的製備 方法和應用；本發明還涉及具有主動靶向生物降解載體與兩親性嵌段共聚物載體自組裝新 技術。本發明的目的是將透明質酸-聚酯（聚乳酸、聚己內酯等）通過還原胺化反應合成， 採用該兩親性載體包覆抗癌藥物製備聚合物膠束；更重要的目的是採用自組裝技術通過靜 電作用，將兩親性的PEG嵌段聚酯共聚物與腫瘤靶向性配體透明質酸-聚乳酸共聚物自組 裝形成多功能複合膠束。 toon] 本發明利用透明質酸分子中含有多種基團通過共價鍵與聚酯中活性基團結合，通 過醯氨化反應合成HA-聚酯，通過與PEG化-聚酯載體自組裝新技術新策略，使PEG在循環 過程中屏蔽HA表面，通過攝取前暴露HA靶點，更有利於延長藥物在循環系統中的循環時 間，其雙親水外殼和聚酯環繞的疏水內核，可逃避單核巨噬細胞的吞噬，減少藥物全身性擴 散的毒副作用提高抗癌藥物靶向治療作用。
[0012] 本發明提供一種或系列具有腫瘤靶向性載體和多功能作用的自組裝複合膠束組 合物，其特徵在於：透明質酸末端的羥基與聚乳酸中羧基通過共價鍵結合，為具有兩親性的 嵌段共聚物，其結構通式（I):
[0013]

【權利要求】
1. 主動靶向透明質酸-聚乳酸載體及其抗腫瘤藥物膠束組合物，其特徵在於：透明質 酸末端的羥基與聚乳酸中羧基通過共價鍵結合，為具有兩親性的嵌段共聚物載體；其結構 通式（I):
其中透明質酸分子量為4500?45000Da，聚乳酸分子量為1200?13000Da，m範圍為 20?92, η範圍為30?103 ; 所述（I)的透明質酸-聚乳酸包載抗癌藥物能自發形成膠束，通過自組裝新技術與ΑΒ、 ABA、ABC兩親性-聚酯嵌段共聚物包覆抗癌藥物自組裝成多功能複合膠束，其自組裝膠束 由雙親水性外殼和聚酯環繞的疏水內核組成； 所述透明質酸與聚乳酸的重量比為1 : 〇. 2?0. 8 ;透明質酸-聚乳酸與兩親性聚酯 共聚物的自組裝膠束組合物的重量比為：1 : 〇. 2?4. 0。
2. 根據權利要求1所述的透明質酸-聚乳酸（I)，其特徵在於，可以包載疏水性或親水 性抗腫瘤藥物，其中藥物與（I)的重量比為1 : 1.0?200。
3. 根據權利要求1所述主動靶向透明質酸-聚乳酸載體及其抗腫瘤藥物膠束組合物， 其特徵在於所述難溶性抗腫瘤藥物選自紫杉醇、多烯紫杉醇、阿黴素、冬凌草素、薑黃素、姜 黃素3、人參皂苷Rh2、柔紅黴素、表柔比星、10羥基喜樹鹼、9-硝基喜樹鹼、S-38、甲氨蝶呤、 依託泊苷、米託蒽醌或其衍生物；水溶性抗腫瘤藥物選自有鹽酸阿黴素、鹽酸拓撲黴素、鹽 酸柔紅黴素等。
4. 根據權利要求1-3所述的透明質酸-聚乳酸共聚物⑴載體，製備方法包括如下步 驟： (1) 聚乳酸的合成 將D，L-丙交酯適量加入圓底燒瓶中，油浴溫度為100-135°C，待丙交酯熔融，加入催化 齊[J Sn (Oct)2，通氮氣排淨容器中空氣，逐步升溫至140-175°C溫度，聚合反應6-8h，加有機溶 劑a純化，真空乾燥，即得聚乳酸固體； 聚乳酸的活化：將聚乳酸溶於有機溶劑a，加 N，N-二環己基碳二亞胺和N-羥基-琥珀 醯亞胺，氮氣保護，室溫反應24h，用有機溶劑b沉澱，抽濾，真空乾燥，即得聚乳酸-NHS ; (2) 透明質酸-聚乳酸的合成 透明質酸的末端胺化合成：將N，N-二乙基乙二胺用pH7-9. 5磷酸鹽緩衝溶解，稱取透 明質酸加純化水溶解滴入上述溶液中，磁力攪拌2-6h。加還原試劑，控制溫度8?20°C反 應l-3h，室溫反應8-16h ;將反應物放入透析袋中，用PBS緩衝溶液透析兩天，冷凍乾燥凍 幹，即得透明質酸-nh2; 稱取透明質酸-NH2適量，加 pH7-9. 5PBS緩衝溶液，超聲溶解，加聚乳酸-NHS有機溶 劑a，室溫磁力攪拌反應15_30h，採用有機溶劑a，除去雜質沉澱；純化水透析袋法透析 24-72h，除去未反應的透明質酸-NH 2，冷凍乾燥，即得透明質酸-聚乳酸固體； 其中所述有機溶劑a為甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、氯仿、二氯甲烷、二甲基亞碸一種或混 合物；所述溶劑b為石油醚、冰乙醚、乙酸乙酯的一種或混合物； 所述還原試劑選自氰基硼氫化鈉、硼氫化鈉等。
5. 根據權利要求1所述主動靶向透明質酸-聚乳酸載體及自組裝多功能膠束組合物， 其特徵在於，所述兩親性-聚酯為AB、ΑΒΑ或ABC型兩嵌段共聚物、三嵌段共聚物或接枝共 聚物，其中兩嵌段共聚物選自mPEG-PLA、mPEG-PCL、mPEG-PLGA、mPEG-PAA，三嵌段共聚物選 自 mPEG-PLLA-PMMD、PLA-PEG-PLA、PCL-PEG-PCL、PLGA-PEG-PLGA 或 PEG-PAA-PEG ;PMMD 為 聚丙氨酸、聚賴氨酸、聚甘氨酸、聚穀氨酸，m為800?20000。
6. 根據權利要求1-5所述主動靶向透明質酸-聚乳酸載體及其抗腫瘤藥物膠束組合 物，其特徵在於，採用乳化溶劑擴散-薄膜分散法-或與透析法結合，所述聚合物膠束和復 合膠束組合物的製備方法如下： (1) 稱取透明質酸-聚乳酸溶於純化水，抗腫瘤藥物加有機溶劑a超聲溶解，將含藥相 滴入載體水相，置恆溫磁力攪拌儀，擴散2-6h得膠束初混懸液；再將上述膠束初混懸液移 至透析袋中，在純化水或磷酸鹽緩衝液中透析12-48h，探頭超聲5-40min，0. 22 μ m微孔濾 膜過濾，即得膠束混懸液；另取膠束混懸液，加凍幹保護劑，分裝西林瓶冷凍乾燥，即得聚合 物膠束固體粉；或 (2) 兩親性聚酯溶解於有機溶劑，抗腫瘤藥物溶於有機溶劑；將含藥相緩慢滴入載體 有機相，置恆溫磁力攪拌儀，擴散2-6h即得膠束初混懸液；再將上述膠束初混懸液置入 旋轉蒸發儀發揮除去有機溶劑，加純化水分散，即得膠束混懸液1 ;另取兩親性聚酯載體 加有機溶劑超聲溶解，滴入磁力攪拌的膠束混懸液1中，固體分散組裝2?3h，探頭超聲 5-30min，0. 22 μ m微孔濾膜過濾，即得自組裝複合膠束混懸液；另取自組裝複合膠束混懸 液，加凍幹保護劑，分裝西林瓶冷凍乾燥，即得自組裝複合膠束固體粉。
7. 根據權利要求1-6所述主動靶向透明質酸-聚乳酸載體及其抗腫瘤藥物膠束組合 物，其特徵是，其中所述有機溶劑為甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷等的 一種或兩種混合溶劑； 所述聚合物膠束或複合膠束凍幹保護劑選自甘露醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖或海藻糖中的 一種或幾種，凍幹保護劑用量按載藥聚合物膠束混懸液重量計，1份載藥聚合物膠束混懸液 加入凍幹保護劑〇. 01?〇. 2份。
8. 根據權利要求1-7所述主動靶向透明質酸-聚乳酸載體及其抗腫瘤藥物膠束組合 物，其特徵在於該載藥膠束和複合膠束可用於治療非小細胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸 癌、胃癌、肝癌、白血病、腎癌等惡性腫瘤的單一或聯合用藥。
【文檔編號】A61K47/36GK104056275SQ201410244165
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年5月30日 優先權日:2014年5月30日
【發明者】李娟 , 王廣基, 陳芳, 張經緯, 周芳 申請人:中國藥科大學