病毒診斷的製作方法
2023-12-10 06:26:22 4
病毒診斷的製作方法
【專利摘要】本公開提供了用於確定受試者是否被淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)感染的方法。這些方法包括從對LCMV感染具有增加的易感性的受試者獲得樣品，使樣品與一種或多種用於檢測的組合物接觸，並確定這一種或多種用於檢測LCMV的組合物是否與來自樣品的LCMV標記相締合，其中檢測到締合表明受試者被LCMV感染。
【專利說明】病毒診斷
[0001]相關專利申請
[0002]本專利申請要求獲得2011年I月7日提交的美國臨時專利申請N0.61/430,822的利益,本文通過援引併入該申請的全部內容。
【技術領域】
[0003]本公開涉及用於檢測受試者體內病毒的組合物和方法。
[0004]背景
[0005]對於某些病毒，用於可靠檢測和診斷的組合物和方法有限。用於區分急性和慢性病毒感染的技術也有限並且可能不太可靠。
[0006]概要
[0007]本公開提供了用於檢測受試者體內淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)和/或區分急性和慢性LCMV感染的組合物和方法。因此，本公開可用於，例如，鑑定LCMV和為LCMV感染的治療開發個性化療法(例如為LCMV抗病毒療法選擇受試者，並監測，必要時修改LCMV抗病毒療法)，降低LCMV擴散，減少宿主-宿主LCMV傳播，減少LCMV疾病發展和致病，和評估LCMV病理狀態。
[0008]因此，在一個方面中，本公開提供了一種用於確定受試者是否被淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)感染的方法，該方法包括:選擇對LCMV感染具有增加的易感性的受試者；從受試者獲得樣品；使樣品與一種或多種用於檢測LCMV的組合物接觸；和確定該一種或多種用於檢測LCMV的組合物是否與來自樣品的LCMV標記相締合，其中檢測到締合表明該受試者被LCMV感染。
[0009]在另一個方面中，本公開提供了一種用於確定受試者是否被淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)感染的方法，該方法包括:選擇懷疑被LCMV感染的受試者；從受試者獲得樣品；使樣品與一種或多種用於檢測LCMV的組合物接觸；和確定該一種或多種用於檢測LCMV的組合物是否與來自樣品的LCMV標記相締合，其中檢測到締合表明該受試者被LCMV感染。
[0010]在另外一個方面中，本公開提供了一種用於確定受試者是否被淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)感染的方法，該方法包括:從受試者獲得樣品；使樣品與從下組選出的至少兩種組合物接觸:與一種或多種LCMV核酸、或一種或多種LCMV核酸的一部分特異性結合的一種或多種探針或引物；一種或多種LCMV蛋白或其片段；和一種或多種用於檢測LCMV肽或LCMV肽片段的組合物(例如一種或多種抗體或抗體片段);和確定該兩種或多種組合物是否與來自樣品的LCMV標記相締合，其中檢測到締合表明該受試者被LCMV感染。
[0011]在另外一個方面中，本公開提供了一種用於確定受試者是否被淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)感染的方法，該方法包括:選擇正在經歷缺氧或者有缺氧風險的受試者，從受試者獲得樣品；使樣品與一種或多種用於檢測LCMV的組合物接觸；和確定該一種或多種用於檢測LCMV的組合物是否與來自樣品的LCMV標記相締合，其中檢測到締合表明該受試者被LCMV感染。[0012]在一些實施方案中，受試者可以是，例如，懷孕的、免疫受損的、移植接受者、具有發生癌症的風險，或者患有癌症，或者其任意組合。在一些實施方案中，受試者正在經歷缺氧狀態或者具有發生缺氧狀態的風險。
[0013]在其它實施方案中，該一種或多種用於檢測LCMV的組合物可以是與一種或多種LCMV核酸或一種或多種LCMV核酸的一部分特異性結合的一種或多種探針或引物。
[0014]在另外的實施方案中，該一種或多種用於檢測LCMV的組合物可以是一種或多種LCMV蛋白或其片段。
[0015]在另外的實施方案中，該一種或多種用於檢測LCMV的組合物可以是用於檢測一種或多種LCMV肽或LCMV肽片段的一種或多種組合物(例如一種或多種抗體或抗體片段)。
[0016]在一個方面中，本公開提供了一種組合物，其包括兩種或多種從下組選出的組合物:與一種或多種LCMV核酸或與一種或多種LCMV核酸的一部分特異性結合的一種或多種探針或引物；一種或多種LCMV蛋白或其片段；和用於檢測LCMV肽或LCMV肽片段的一種或多種組合物(例如一種或多種抗體或抗體片段)。
[0017]在另一個方面中，本公開提供了一種診斷試劑盒，其中該試劑盒包括:至少一種分離的LCMV多肽或其片段，例如NP，GP, GPC, GPl或ZP抗原，或其片段。或者/並且，該試劑盒包括至少一種與NP，GP, GPC, GPl或ZP抗原結合的分離抗體或抗體片段，或其抗原結合片段。或者/並且，該試劑盒可包括至少一種與一種或多種LCMV核酸或其一部分，例如編碼NP, GP, GPC, GPl或ZP抗原的核酸，特異性結合的探針或引物。在一些情況下，試劑盒可以包括上述的任意組合。
[0018]在另外一個方面中，本公開提供了多個分離的多肽，其中該多個多肽包括或者由選自下組的至少2種，例如3、4或5種類型的多肽構成:分離的NP抗原或其片段，分離的GP抗原或其片段，分離的GPC抗原·或其片段，分離的GPl抗原或其片段，分離的ZP抗原或其片段。在一些情況下，本公開提供了一種診斷試劑盒，包括這樣的多個多肽。
[0019]在另外一個方面中，本公開提供了多個分離的抗體，例如單克隆或多克隆抗體，其中該多個抗體包括或者由與選自下組至少2種，例如3、4或5種類型多肽特異性結合的抗體構成:分離的NP抗原或其片段，分離的GP抗原或其片段，分離的GPC抗原或其片段，分離的GPl抗原或其片段，分離的ZP抗原或其片段。在一些情況下，本公開提供包括這樣的多個抗體的診斷試劑盒，。
[0020]在另外一個方面中，本公開提供了多個分離的核酸探針或引物，其中該多個探針或引物包括或者由與編碼選自下組的至少2種，例如3、4或5種類型多肽的核苷酸序列特異性結合的探針或引物構成:NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，ZP抗原或其片段。在一些情況下，本公開提供包括這樣的多種探針或引物的診斷試劑盒。
[0021 ] 在一些實施方案中，這裡介紹的診斷試劑盒可以進一步包含用於治療受試者體內的LCMV或其症狀的作用劑，例如抗病毒劑。
[0022]在另外一個方面中，本公開提供了一種用於治療受試者的LCMV感染的方法，包括:從患有或者具有被LCMV感染的危險的受試者獲得生物樣品；用上述診斷試劑盒、上述多個多肽、上述多個抗體、或上述多個探針或引物、或其任意組合篩查樣品，以確定受試者是否被LCMV感染；以及如果患者被LCMV感染，則向受試者施用治療LCMV或其症狀的作用劑，例如抗病毒劑。在一些情況下，患有LCMV感染或者具有LCMV感染的風險的受試者具有涉及缺氧的狀況。在一些情況下，患患有LCMV感染或者具有LCMV感染的風險的受試者是懷孕的、免疫受損的、移植接受者、具有癌症發生風險，或者患有癌症，或者其任意組合。
[0023]在另外的一個方面中，本公開提供了一種用於確定受試者是否被LCMV感染的方法，該方法包括:從患有LCMV感染或者具有被LCMV感染的風險的受試者獲得生物樣品；使樣品與上述多個多肽、上述多個抗體、或上述個種探針或引物、或其任意組合接觸；確定該多個多肽、多個抗體、多個探針或引物，或其任意組合是否與來自樣品的LCMV標記相締合，其中檢測到締合表明受試者被LCMV感染。
[0024]在另外一個方面中，本公開提供了一種單克隆抗體M59，其與LCMV NP特異性結合，或其抗原結合片段，例如互補決定區(CDR)，例如其CDR3。在一些情況下，本公開提供了包含這種抗體的試劑盒。
[0025]在另一個方面中，本公開提供了一種單克隆抗體M87，其與LCMV NP特異性結合，或其抗原結合片段，例如互補決定區(⑶R)，例如其⑶R3。在一些情況下，本公開提供了包含這種抗體的試劑盒。
[0026]在另一個方面中，本公開提供了一種單克隆抗體，其與LCMV GPl特異性結合，或其抗原結合片段，例如互補決定區(⑶R)，例如其⑶R3。在一些情況下，本公開提供了包含這種抗體的試劑盒。
[0027]在另一個方面中，本公開提供了一種單克隆或多克隆抗體，其與胺基酸序列RSGffGffAGSDGKTT(SEQ ID NO:89)特異性結合，或其抗原結合片段，例如互補決定區(CDR)，例如其⑶R3。在一些情況下，本公開提供了包含這種抗體的試劑盒。
[0028]在另一個方面中，本公開提供了一種單克隆抗體MJ3，其與LCMV ZP特異性結合，或其抗原結合片段，例如互補決定區(⑶R)，例如其⑶R3。在一些情況下，本公開提供了包含這種抗體的試 劑盒。
[0029]在一些方面中，本公開提供了用於評估(例如檢測、確定、評估和/或監測)受試者體內淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)感染或活性的方法。這些方法可以包括選擇用於評估的受試者，其中候選受試者曾暴露於或者被懷疑正暴露於LCMV或被LCMV感染的人或動物。該方法還包括從所選受試者獲得或提供樣品，使樣品與一種或多種用於檢測LCMV的組合物接觸，並確定該一種或多種用於檢測LCMV的組合物是否與來自樣品的LCMV標記相締合，其中檢測到締合表明受試者被LCMV感染。
[0030]在一些方面中，本公開提供了用於評估(例如檢測、確定、評估和/或監測)受試者，例如被LCMV感染或者懷疑正暴露於LCMV感染源(例如被LCMV感染的人或動物)的受試者體內淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)，包括水平(例如LCMV核酸、蛋白和/或活性的水平)的方法。在一些實施方案中，這些方法可以包括選擇受試者(例如候選受試者)，從受試者獲得或提供樣品，使樣品與一種或多種用於檢測LCMV的組合物接觸，和確定該一種或多種用於檢測LCMV的組合物是否與來自樣品的LCMV標記相締合，其中檢測到締合表明受試者被LCMV感染。
[0031]在一些方面中，本公開提供了用於評估(例如檢測、確定、評估和/或監測)受試者，例如被LCMV感染或者懷疑正暴露於LCMV感染源(例如被LCMV感染的人或動物)的受試者體內淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)，包括水平(例如LCMV核酸、蛋白和/或活性的水平)的方法。在一些實施方案中，這些方法可以包括從受試者(例如合適的受試者)獲得或提供樣品，使樣品與選自下組的至少兩種組合物接觸:與一種或多種LCMV核酸或一種或多種LCMV核酸的一部分特異性結合的一種或多種探針或引物；一種或多種LCMV蛋白或其片段；和一種或多種用於檢測LCMV肽或LCMV肽片段的組合物(例如一種或多種抗體或抗體片段);和確定該兩種或多種組合物是否與來自樣品的LCMV標誌相締合，其中檢測到締合表明該受試者被LCMV感染。
[0032]在一些方面中，本公開提供了用於評估(例如檢測、確定、評估和/或監測)受試者，例如被LCMV感染或者懷疑正暴露於LCMV感染源(例如被LCMV感染的人或動物)的受試者體內淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)，包括水平(例如LCMV核酸、蛋白和/或活性的水平)的方法。在一些實施方案中，這些方法可以包括，從受試者獲得或提供樣品，使樣品與一種或多種用於檢測LCMV的組合物接觸，和確定該一種或多種用於檢測LCMV的組合物是否與來自樣品的LCMV標記相締合，其中檢測到締合表明受試者被LCMV感染。
[0033]在一些實施方案中，本公開的方法可以包括選擇這樣的受試者:受試者具有、或者有風險發生與增高的缺氧和/或自由基形成水平相關的狀況。這些受試者包括，例如，懷孕的、免疫受損的、移植接受者、具有癌症發生風險，或者患有癌症。
[0034]在一些實施方案中，本公開的方法可以包括本文公開的一種或多種組合物單獨的應用或者與本文公開的其它組合物組合的應用。例如，兩種或多種組合物的組合使用並不僅限於同時使用，還包括例如平行使用或順次使用。在一些實施方案中，使用一種組合物觀察到的結果可以用本文公開的一種或多種其它組合物加以確認。
[0035]在一些實施方案中，本公開的方法可包括一種或多種與一種或多種LCMV核酸或一種或多種LCMV核酸的一部分特異性結合的探針或引物的應用。例如，這些探針或引物可以包括具有10種或更多種核酸的核酸探針或引物，其中該10種或更多種核酸與SEQ IDNO: 1-51中一個或多個內的一個或多個靶區域具有至少80%的同一性，從而使該一種或多種核酸探針或引物可與該一個或多個靶區域特異性結合。
[0036]在一些實施方案中，本公開的方法可以包括從下組選出的一種或多種探針或引物，該組包括一種或多種與SEQ` ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQID NO:62，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69，SEQID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73 中一個或多個具有至少 80% 同一性的核酸序列。在一些實施方案中，本公開的方法可以包括從下組選出的一種或多種探針或引物:SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ IDNO:63，SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:70，SEQ IDNO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID N0:73。
[0037]在一些實施方案中，本公開的方法可以包括一種或多種與編碼LCMV NP的核酸結合的探針或引物的應用。例如，這些探針或引物可以包括:SEQ ID NO:58和59，或與SEQ IDNO: 58和59具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID NO: 66和67，或與SEQ ID NO: 66和67具有至少80%同一性的核酸序列對。
[0038]在一些實施方案中，本公開的方法可以包括一種或多種與編碼LCMV GP的核酸結合的探針或引物的應用。例如，這些探針或引物可以包括:SEQ ID N0:60和61，或與SEQID N0:60和61具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID NO:68和69，或與SEQ IDNO:68和69具有至少80%同一性的核酸序列對。
[0039]在一些實施方案中，本公開的方法可以包括一種或多種與編碼LCMV ZP的核酸結合的探針或引物的應用。例如，這些探針或引物可以包括:SEQ ID NO:62和63，或與SEQ IDNO: 62和63具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID NO: 72和73，或與SEQ ID NO: 72和73具有至少80%同一性的核酸序列對。
[0040]在一些實施方案中，本公開的方法可以包括一種或多種與編碼LCMV L的核酸結合的探針或引物的應用。例如，這些探針或引物可以包括:SEQ ID NO: 70和71，或與SEQ IDNO:70和71具有至少80%同一性的核酸序列對。
[0041]在一些實施方案中，本公開的方法可以包括編碼LCMV NP, LCMV GP，LCMV ZP和LCMV L中兩個或多個的核酸的應用。
[0042]在一些實施方案中，本公開的方法可以包括下列的應用:SEQ ID N0:58和59，或與SEQ ID NO: 58和59具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID NO: 66和67，或與SEQID NO:66和67具有至少80%同一性的核酸序列對，其中所述引物與LCMV NP結合；SEQ IDN0:60和61，或與SEQ ID NO:60和61具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID NO:68和69，或與SEQ ID NO:68和69具有至少80%同一性的核酸序列對，其中所述引物與LCMVGP結合，SEQ ID NO: 62和63，或與SEQ ID NO: 62和63具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID NO: 72和73，或與SEQ ID NO: 72和73具有至少80%同一性的核酸序列對，其中所述引物與LCMV ZP結合；或者SEQ ID NO: 70和71，或與SEQ ID NO: 70和71具有至少80%同一性的核酸序列對，其中所述引物與LCMV L結合。
[0043]在一些實施方案中，本公開的方法可包括一種或多種LCMV蛋白或其片段的應用。
[0044]在一些實施方案中，本公開的方法包括一種或多種抗體或抗體片段的應用。在一些實施方案中，這些抗體或抗體片段可以包括與雜交瘤MJ3具有相同表位特異性的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，這些抗體或抗體片段可以包括由雜交瘤MJ3產生的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，這些抗體或抗體片段可以包括與雜交瘤M166具有相同表位特異性的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，這些抗體或抗體片段可以包括由雜交瘤M166產生的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，這些抗體或抗體片段可以包括與雜交瘤MJ3具有相同的表位特異性的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM),以及與雜交瘤M166具有相同的表位特異性的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，並保藏在比利時Ghent大學的寄比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，這些抗體或抗體片段可以包括由雜交瘤MJ3產生的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)，和由雜交瘤M166產生的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，這些抗體或抗體片段可以包括單克隆抗體M87重鏈可變區的⑶R3(SEQ ID N0:78)，其不包含(例如包含O個)或至少I個(例如1、2、3、4、5、少於10個、少於20個、少於30個、少於50個、或少於100個)保守胺基酸替換，和/或單克隆抗體M87重鏈可變區的⑶R2(SEQID NO: 77)，其不包含(例如包含O個)或至少I個(例如1、2、3、4、5、少於10個、少於20個、少於30個、少於50個、或少於100個)保守胺基酸替換，和/或單克隆抗體M87重鏈可變區的CDRl (SEQ ID NO: 76)，其不包含(例如包含O個)或至少I個(例如1、2、3、4、5、少於10個、少於20個、少於30個、少於50個、或少於100個)保守胺基酸替換。在一些實施方案中，這些抗體或抗體片段可以包括與SEQ ID NO:74具有同一性的抗原結合肽(例如包括抗體和/或抗原結合性抗體片段)，其中相應於SEQ ID N0:74互補決定區胺基酸序列內的區域包含一個或多個保守胺基酸替換，相應於SEQ ID NO: 74框架區胺基酸序列內的區域與SEQID NO:74的相應區域具有至少80%的同一性，和/或抗原結合肽與LCMV NP結合。
[0045]在一些方面中，本公開包括含有如下的組合(例如包含其中1、2或3種)的組合物:與一種或多種LCMV核酸或一種或多種LCMV核酸的一部分特異性結合的一種或多種探針或引物；一種或多種LCMV蛋白或其片段；和一種或多種抗體或抗體片段。在一些實施方案中，這裡的組合物的一種或多種探針或引物可以包括一種或多種這樣的核酸探針或引物:其具有10種或更多種核酸，其中該10種或更多種核酸與SEQ ID NO: 1-51中一個或多個中的一個或多個靶區域具有至少80%同一性，從而使該一種或多種核酸探針或引物可與該一個或多個靶區域特異性結合。在一些實施方案中，這裡的組合物的一種或多種探針或引物選自下組:一個或多個與 SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:61, SEQID NO:62，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69，SEQ IDNO:70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO: 73 中一個或多個具有至少80% 同一性的核酸序列。在一些實施方案中，組合物的一種或多種探針或引物選自下組:SEQ ID NO:58, SEQID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:66, SEQID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQID NO: 73。在一些實施方案中，這裡的組合物的一種或多種探針或引物包括與編碼LCMV NP的核酸結合的一種或多種探針或引物。在一些實施方案中，這裡的組合物的一種或多種探針或引物包括從下組選出的一種或多種探針或引物:SEQ ID N0:58和59或與SEQ ID NO:58和59具有至少80%同一性的核酸·序列對；或SEQ ID NO:66和67或與SEQ ID NO:66和67具有至少80%同一性的核酸序列對。
[0046]在一些實施方案中，這裡的組合物的一種或多種探針或引物包括與編碼LCMV GP的核酸結合的一種或多種探針或引物。例如，這樣的探針或引物可包括:SEQ ID N0:60和61或與SEQ ID NO:60和61具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID NO:68和69或與SEQ ID NO:68和69具有至少80%同一性的核酸序列對。
[0047]在一些實施方案中，這裡的組合物的一種或多種探針或引物包括與編碼LCMV ZP的核酸結合的一種或多種探針或引物。例如，這樣的探針或引物可包括:SEQ ID N0:62和63或與SEQ ID NO:62和63具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID NO:72和73或與SEQ ID NO:72和73具有至少80%同一性的核酸序列對。
[0048]在一些實施方案中，這裡的組合物的一種或多種探針或引物包括與編碼LCMV L的核酸結合的一種或多種探針或引物。例如，這樣的探針或引物可包括:從下組選出的一種或多種探針或引物:SEQ ID N0:70和71或與SEQ ID NO:70和71具有至少80%同一性的核酸序列對。[0049]在一些實施方案中，這裡的組合物的一種或多種探針或引物包括與編碼LCMV GP的核酸結合的一種或多種探針或引物。例如，這些探針或引物可以包括一種或多種與編碼LCMV NP, LCMV GP, LCMV ZP和/或LCMV L中兩者或更多者的核酸結合的探針或引物。
[0050]在一些實施方案中，這裡的組合物的一種或多種探針或引物包括與編碼LCMV GP的核酸結合的一種或多種探針或引物。例如，這些探針或引物可以包括這樣的一種或多種探針或引物，其包括:SEQ ID N0:58和59或與SEQ ID NO:58和59具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID NO:66和67或與SEQ ID NO:66和67具有至少80%同一性的核酸序列對，其中該引物與LCMV NP結合；SEQ ID NO:60和61或與SEQ ID N0:60和61具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID N0:68和69或與SEQ ID NO:68和69具有至少80%同一性的核酸序列對，其中該引物與LCMV GP結合；SEQ ID NO: 62和63或與SEQ ID NO: 62和63具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID NO:72和73或與SEQ ID NO:72和73具有至少80%同一性的核酸序列對，其中該引物與LCMV ZP結合；或SEQ ID NO: 70和71或與SEQ ID NO:70和71具有至少80%同一性的核酸序列對，其中該引物與LCMV L結合。
[0051]在一些方面中，本公開包括包含一種或多種抗體的組合物。在一些實施方案中，本公開組合物中包含的抗體或抗體片段可以包括與雜交瘤MJ3具有相同表位特異性的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，這些抗體或抗體片段可以包括由雜交瘤MJ3產生的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，這些抗體或抗體片段可以包括與雜交瘤M166具有相同表位特異性的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，這些抗體或抗體片段可以包括由雜交瘤M166產生的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，這些抗體或抗體片段可以包括與雜交瘤MJ3具有相同表位特異性的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghen t大學的比利時微生物保藏中心(BCCM);以及與雜交瘤M166具有相同表位特異性的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，這些抗體或抗體片段可以包括由雜交瘤MJ3產生的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)，以及由雜交瘤M166產生的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，這些抗體或抗體片段可以包括單克隆抗體M87重鏈可變區的CDR3(SEQID N0:78)，其中包含I個或多個保守胺基酸替換，和/或單克隆抗體M87重鏈可變區的⑶R2(SEQ ID NO: 77)，其中包含I個或多個保守胺基酸替換，和/或單克隆抗體M87重鏈可變區的⑶Rl (SEQ ID NO: 76)，其中包含I個或多個保守胺基酸替換。
[0052]在一些實施方案中，本公開的組合物中包含的抗體或抗體片段可以包括單克隆抗體M87重鏈可變區的CDR3(SEQ ID NO: 78)，和/或單克隆抗體M87重鏈可變區的CDR2 (SEQID NO:77)，和/或單克隆抗體M87重鏈可變區的CDRl (SEQ ID NO:76)。
[0053]在一些實施方案中，本公開的組合物中包含的抗體或抗體片段可以包括與SEQ IDNO: 74具有同一性的抗原結合肽(例如包括抗體和/或抗原結合性抗體片段)，其中:胺基酸序列內對應於SEQ ID NO: 74內的互補決定區的的區域包含一個或多個保守胺基酸替換，胺基酸序列內對應於SEQ ID NO:74框架區的區域與SEQ ID NO:74中的相應區域具有至少80%的同一性，並且所述抗原結合肽與LCMV NP結合。
[0054]在一些方面中，本公開包括診斷試劑盒。在一些實施方案中，這些診斷試劑盒可包括，至少一種分離的LCMV多肽或其片段，其中LCMV多肽是NP，GP或ZP抗原，或其片段；一種或多種與NP，GP或ZP抗原結合的分離抗體或抗體片段，或其抗原結合片段；和/或與一種或多種LCMV核酸或其一部分特異性結合的一種或多種探針或引物；和/或其組合。
[0055]在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒可包括一種或多種探針或引物，其包含一種或多種具有10個或更多個核酸的核酸探針或引物，其中該10個或更多個核酸與SEQID NO: 1-51中一個或多個序列中的一個或多個靶區域具有至少80%的同一性，從而使該一種或多種核酸探針或引物能夠與該一個或多個靶區域特異性結合。在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒中含有的探針或引物包括從下組選出的探針和引物:一種或多種與SEQID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQID NO:72, SEQ ID NO:73中的一個或多個具有至少80%同一性的核酸序列。在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒中含有的探針或引物包括從下組選出的探針和引物:SEQ IDNO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ IDNO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ IDNO:72，SEQ ID NO:73。
[0056]在一些實施方 案中，本公開的診斷試劑盒中含有的探針或引物包括與編碼LCMVNP的核酸結合的探針或引物。在一些實施方案中，這些探針或引物可以包括:例如，SEQ IDNO: 58和59，或與SEQ ID NO: 58和59具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID NO: 66和67，或與SEQ ID NO: 66和67具有至少80%同一性的核酸序列對。
[0057]在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒中含有的探針或引物可包括與編碼LCMVGP的核酸結合的探針或引物。在一些實施方案中，這些探針或引物可以包括:例如，SEQ IDN0:60和61，或與SEQ ID NO:60和61具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID NO:68和69，或與SEQ ID NO: 68和69具有至少80%同一性的核酸序列對。
[0058]在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒中含有的探針或引物可包括與編碼LCMVZP的核酸結合的探針或引物。在一些實施方案中，這些探針或引物可以包括:例如，SEQ IDNO: 62和63，或與SEQ ID NO: 62和63具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID NO: 72和73，或與SEQ ID NO: 72和73具有至少80%同一性的核酸序列對。
[0059]在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒中含有的探針或引物包括與編碼LCMV L的核酸結合的探針或引物。在一些實施方案中，這些探針或引物可以包括:例如，SEQ IDNO:70和71，或與SEQ ID N0:70和71具有至少80%同一性的核酸序列對。
[0060]在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒中含有的探針或引物包括與編碼LCMVNP, LCMV GP, LCMV ZP和LCMV L中兩個或多個的核酸結合的一種或多種探針或引物。
[0061]在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒中含有的探針或引物包括如下的一種或多種:SEQ ID NO: 58和59，或與SEQ ID NO: 58和59具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID NO: 66和67，或與SEQ ID NO: 66和67具有至少80%同一性的核酸序列對，其中所述引物與LCMV NP結合，SEQ ID NO: 60和61，或與SEQ ID NO: 60和61具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID NO: 68和69，或與SEQ ID NO: 68和69具有至少80%同一性的核酸序列對，其中所述引物與LCMV GP結合，SEQ ID NO:62和63，或與SEQ ID N0:62和63具有至少80%同一性的核酸序列對；或SEQ ID NO:72和73，或與SEQ ID N0:72和73具有至少80%同一性的核酸序列對，其中引物與LCMV ZP結合；或者SEQ ID N0:70和71，或與SEQ ID NO:70和71具有至少80%同一性的核酸序列對，其中引物與LCMV L結合。
[0062]在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒包括一種或多種分離的抗體或抗體片段。在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒中含有的分離抗體或抗體片段可以包括與雜交瘤MJ3具有相同表位特異性的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒中含有的分離抗體或抗體片段可以包括由雜交瘤MJ3產生的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒中含有的分離抗體或抗體片段可以包括與雜交瘤M166具有相同表位特異性的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒中含有的分離抗體或抗體片段可以包括由雜交瘤M166產生的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒中含有的分離抗體或抗體片段可以包括:與雜交瘤MJ3具有相同表位特異性的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時(ihent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)，和與雜交瘤M166具有相同表位特異性的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒中含有的分離抗體或抗體片段可以包括:由雜交瘤MJ3產生的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)，和由雜交瘤M166產生的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。
[0063]在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒中含有的分離抗體或抗體片段可以包括單克隆抗體M87重鏈可變區的⑶R3 (SEQ ID NO: 78)，其中包含一個或多個保守胺基酸替換，和/或單克隆抗體M87重鏈可變區的CDR2(SEQ ID NO: 77)，其中包含一個或多個保守胺基酸替換，和/或單克隆抗體M87重鏈可變區的CDRl (SEQ ID NO: 76)，其中包含一個或多個保守胺基酸替換。
[0064]在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒中含有的分離抗體或抗體片段可以包含單克隆抗體M87重鏈可變區的CDR3(SEQ ID NO: 78)，和/或單克隆抗體M87重鏈可變區的CDR2 (SEQ ID NO: 77)，和/或單克隆抗體M87重鏈可變區的CDRl (SEQ ID NO: 76)。
[0065]在一些實施方案中，本公開的診斷試劑盒中含有的分離抗體或抗體片段可以包括與SEQ ID N0:74具有同一性的抗原結合肽(例如抗體或抗原結合性抗體片段)，其中:胺基酸序列內相應於SEQ ID NO: 74的互補決定區的區域包含一個或多個保守胺基酸替換，胺基酸序列內相應於SEQ ID NO:74的框架區的區域與SEQ ID NO:74的相應區域具有至少80%的同一性，和/或該抗原結合肽與LCMV NP結合。
[0066]在一些方面中，本公開包括分離的多肽的群體，其中所述群體包括從下組選出的至少兩個多肽:分離的NP抗原或其片段，分離的GP抗原或其片段，分離的GPC抗原或其片段，分離的GPl抗原或其片段，和分離的ZP抗原或其片段。在一些實施方案中，本公開的群體可以包括:至少三個從下組選出的多肽:分離的NP抗原或其片段，分離的GP抗原或其片段，分離的GPC抗原或其片段，分離的GPl抗原或其片段，和分離的ZP抗原或其片段，至少四個從下組選出的多肽:分離的NP抗原或其片段，分離的GP抗原或其片段，分離的GPC抗原或其片段，分離的GPl抗原或其片段，和分離的ZP抗原或其片段。在一些實施方案中，這樣的群體可以作為試劑盒提供或者包含在試劑盒中。
[0067]在一些方面中，本公開包括分離的抗體或抗體片段的群體，其中所述群體包括與至少兩個選自下組的多肽特異性結合的抗體或片段:NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，和ZP抗原或其片段。
[0068]在一些方面中，本公開包括分離的抗體或抗體片段的群體，其中所述群體包括與至少三個選自下組的多肽特異性結合的抗體或片段:NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，和ZP抗原或其片段。
[0069]在一些方面中，本公開包括分離的抗體或抗體片段的群體，其中所述群體包括至少四個與選自下組的多肽特異性結合的抗體或片段:NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，和ZP抗原或其片段。
[0070]在一些方面中，本公開包括分離的抗體或抗體片段的群體，其中該群體包括特異性結合下述的抗體或片段:NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，和ZP抗原或其片段。
[0071]在一些實施方案中，本公開的抗體群體可包括與雜交瘤MJ3具有相同表位特異性的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，本公開的抗體群體可包括由雜交瘤MJ3產生的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施`方案中，本公開的抗體群體可包括與雜交瘤M166具有相同表位特異性的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，本公開的抗體群體可包括由雜交瘤M166產生的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB。在一些實施方案中，本公開的抗體群體可包括與雜交瘤MJ3具有相同表位特異性的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)，和與雜交瘤M166具有相同表位特異性的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。在一些實施方案中，本公開的抗體群體可包括由雜交瘤MJ3產生的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)，和由雜交瘤M166產生的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。
[0072]在一些實施方案中，本公開的抗體群體可包括與SEQ ID NO:74具有同一性的抗原結合肽，其中:相應於SEQ ID NO:74互補決定區胺基酸序列內的區域包含一個或多個保守胺基酸替換，相應於SEQ ID NO:74框架區胺基酸序列內的區域與SEQ ID N0:74的相應區域具有至少80%的同一性，和/或所述抗原結合肽與LCMV NP結合。
[0073]在一些方面中，本公開的抗體群體可以作為診斷試劑盒提供(例如銷售、許諾銷售、上市、運輸、儲存和/或包裝)或者包含在診斷試劑盒內。
[0074]在一些方面中，本公開的抗體群體可以包括與編碼至少兩種從下組選出的多肽的核苷酸序列特異性結合的探針或引物:NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，和ZP抗原或其片段。在一些方面中，本公開的抗體群體可以包括與編碼至少三種從下組選出的多肽的核苷酸序列特異性結合的探針或引物:NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，和ZP抗原或其片段。在一些方面中，本公開的抗體群體可以包括與編碼至少四種從下組選出的多肽的核苷酸序列特異性結合的探針或引物:NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，和ZP抗原或其片段。在一些方面中，本公開的抗體群體可以包括與編碼NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，和ZP抗原或其片段的核苷酸序列特異性結合的探針或引物。
[0075]在一些方面中，本公開的抗體群體可以作為診斷試劑盒提供(例如銷售、許諾銷售、上市、運輸、儲存和/或包裝)或者包含在診斷試劑盒內。在一些實施方案中，這些診斷試劑盒可以進一步包括至少一種(例如1、2、3、4、5或更多種)用於治療受試者體內的LCMV或其症狀的作用劑(例如藥物)。在一些實施方案中，至少一種這樣的作用劑是抗病毒劑。[0076]在一些實施方案中，本公開提供了用於治療受試者體內LCMV感染的方法，包括:從具有LCMV感染或有LCMV感染風險的受試者獲得生物樣品；使用權利要求1的方法篩選樣品以確定受試者是否被LCMV感染；和如果患者被LCMV感染，給受試者施用用於治療LCMV或其症狀的作用劑。在一些實施方案中，本公開的治療方法可以包括選擇的具有LCMV感染或有LCMV感染風險受試者具有涉及缺氧的病症。這些受試者可以包括例如懷孕的、免疫受損的、移植接受者、和具有發生癌症風險的，或者患有癌症的。
[0077]在一些方面中，本公開提供了單克隆抗體M59，其與LCMV NP或其片段特異性結
口 ο
[0078]在一些方面中，本公開提供了單克隆抗體M87，其與LCMV NP或其片段特異性結
口 O
[0079]在一些方面中，本公開提供了單克隆抗體，其與LCMV GPl或其片段特異性結合。
[0080]在一些方面中，本公開提供了單克隆抗體，其與胺基酸序列RSGWGWAGSDGKTT(SEQID NO:89)特異性結合。
[0081]在一些方面中，本公開提供了單克隆抗體MJ3，其與LCMV ZP或其片段特異性結
入
口 ο
[0082]在一些方面中，本公開提供了本文中公開的一種或多種抗體的互補決定區(CDR)。在一些實施方案中，該⑶R是⑶R3。
[0083]在一些方面中，本文公開的一種或多種抗體或抗體結合片段本公開的抗體群體可以作為診斷試劑盒提供(例如銷售、許諾銷售、上市、運輸、儲存和/或包裝)或者包含在診斷試劑盒內。
[0084]在一些方面中，本公開提供了與雜交瘤MJ3具有相同表位特異性的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。
[0085]在一些實施方案中，本公開提供了由雜交瘤MJ3產生的單克隆抗體，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。
[0086]在一些實施方案中，本公開提供了雜交瘤MJ3細胞，MJ3的LMBP保藏號為9217CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。
[0087]在一些實施方案中，本公開提供了與雜交瘤M166具有相同表位特異性的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。
[0088]在一些實施方案中，本公開提供了由雜交瘤M166產生的單克隆抗體，M166的LMBP保藏號為9216CB，並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。
[0089]在一些實施方案中，本公開提供了雜交瘤M166細胞，M166的LMBP保藏號為9216CB,並保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)。
[0090]在一些實施方案中，本公開提供了一種分離的抗體或抗體片段，包括單克隆抗體M87重鏈可變區的⑶R3(SEQ ID NO: 78)，其包含一個或多個保守的胺基酸替換，和/或單克隆抗體M87重鏈可變區的⑶R2(SEQ ID NO: 77)，其包含一個或多個保守的胺基酸替換，和/或單克隆抗體M87重鏈可變區的⑶Rl (SEQ ID NO: 76)，其包含一個或多個保守的胺基酸替換。
[0091]在一些方面中，本公開提供了一種分離的抗體或抗體片段，包括單克隆抗體M87重鏈可變區的CDR3(SEQ ID NO: 78)，和/或單克隆抗體M87重鏈可變區的CDR2 (SEQ IDNO:77)，和/或單克隆抗體M87重鏈可變區的CDRl (SEQ ID NO:76)。
[0092]在一些方面中，本公開提供了一種與SEQ ID NO:74具有同一性的抗原結合肽(例如包括抗體和/或抗原結合性抗體片段)，其中:相應於SEQ ID NO: 74互補決定區胺基酸序列內的區域包含一個或多個保守胺基酸替換，相應於SEQ ID NO:74框架區胺基酸序列內的區域與SEQ ID NO: 74的相應區域具有至少80%的同一性，和與LCMV NP結合的抗原結合肽。
[0093]除非另外定義，否則這裡所用的全部技術和科學術語具有與本發明所屬【技術領域】普通技術人員所公知的相同的意義。這裡介紹了用於本發明的方法和材料；也可以使用本【技術領域】已知的其它合適的方法和材料。材料、方法和實施例僅是出於舉例的目的，沒有限制意義。本文引用在這裡提到的全部出版物、專利申請書、專利、序列、資料庫和其它參考的全部內容作為參考。在發生衝突時，以本專利說明書，包括定義，為準。
[0094]通過下面的詳細說明和圖表以及權利要求，本發明的其它特徵和優勢將變得顯而易見。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0095]圖1A顯示了 LCMV的結構，包括外跨膜糖蛋白I和2 (GPl和GP2)、LCMV病毒粒的Z蛋白、NP、RNA和L蛋白，和病毒複製策略。
[0096]圖1B是圖解LCMV生命周期的示意圖。
[0097]圖2 (即圖2i_2vi)顯示了所選LCMV病毒株/分離株S節段上NP基因組區域核苷酸序列的比對。
[0098]圖3 (即圖3i_3vi)顯示了所選LCMV病毒株/分離株S節段上GP (即GPC，包括GPl和GP2)基因組區域核苷酸序列的比對。[0099]圖4顯示了所選LCMV病毒株/分離株L節段上ZP基因組區域核苷酸序列的比對。
[0100]圖5(即圖5i_5ii)顯不了所選LCMV病毒株/分尚株NP抗原胺基酸序列的比對。
[0101]圖6(即圖6i_6ii)顯不了所選LCMV病毒株/分尚株GP抗原胺基酸序列的比對。
[0102]圖7顯示了所選LCMV病毒株/分離株ZP抗原胺基酸序列的比對。
[0103]圖8A-8D顯示了用於本文公開方法的示例性基於抗體的測定。
[0104]圖9顯示了用於本文公開方法的示例性的基於RNA的測定。
[0105]圖1OA是顯示氧上調LCMV基因表達的圖表。誘導倍數通過與正常氧對照比較確定。數值代表3次獨立實驗每次4個重複樣品的平均值。誤差線代表標準差。*Ρ〈0.02，_P〈0.001 (缺氧(HY) vs.正常氧(NO))。
[0106]圖1OB是顯示了 DMOG處理上調LCMV基因表達的圖表。數值代表兩次實驗中一個代表性實驗三次重複確定的平均值，誤差線指示標準差。*p〈0.05, ***P〈0.001 (DM0G對無DMOG)ο
[0107]圖1OC是免疫印跡的圖，顯示了缺氧上調LCMV蛋白表達。肌動蛋白顯示作為上樣和轉移效率的對照。檢測到HIF-1alpha作為誘發對缺氧的細胞響應的對照。顯示了至少三次具有相似結果的獨立實驗的一個代表性結果。
[0108]圖1OD是顯示通過RLM-RACE評估得到的在正常氧和缺氧條件下各種LCMV基因的相對表達水平的柱狀圖。
·[0109]圖1lA是凝膠圖像，通過RT-PCR檢測確認了在正常氧(NO)條件下培養的HeLa-MX細胞的培養基中和在缺氧(HY)條件下培養的細胞的培養基中存在LCMV基因組。
[0110]圖1lB是凝膠圖像，通過RT-PCR評估顯示了用來自第(P)l、P3、P5和PlO代的HeLa-MX細胞的培養基感染的細胞中的LCMV基因表達。
[0111]圖1lC是用來自HeLa-MX細胞的培養基感染的細胞的圖像。對細胞染色以鑑定LCMV。還使用了細胞核染色。細胞在P1、P3和PlO代被染色。使用的放大倍數為20倍。數據代表了兩次獨立的實驗。
[0112]圖12A是顯示用於表徵抗體重鏈可變區序列的操作規程的示意圖。
[0113]圖12B顯示了單抗M87重鏈可變區的胺基酸序列。黃色陰影指示信號肽序列。綠色陰影指示高變區。
[0114]圖12C圖解了單抗M87重鏈的結構。
[0115]圖13是免疫印跡圖像，確認了在發生自然流產的婦女的血清中存在抗NP抗體。通過免疫沉澱檢測了人血清中的抗-NP抗體。
[0116]圖14的圖像顯示了腎腫瘤中(圖14A)和陰性對照中(圖14B)病毒NP的免疫組化檢測結果。
[0117]圖14C是免疫印跡圖像顯示了通過用NP特異性單克隆抗體進行免疫檢測和隨後的免疫印跡在來自人RCC受試者的組織中進行LCMV的免疫檢測。HT=健康組織，TT=腫瘤組織，HMX=HeLa/MX (陽性對照)，H=HeLa (陰性對照)。
[0118]圖15A和15B的圖片圖解了 M87和M59抗體之間競爭性結合研究的結果。
[0119]圖16是顯示NP特異抗體與NP片段的表位結合的線圖。
[0120]圖17是顯示純化重組蛋白的SDS-PAGE分析的凝膠圖像。泳道I，純化的LCMV NP抗原；泳道2，純化的陰性對照抗原。檢測到一條大約為62kDa的LCMV NP抗原蛋白條帶(泳道I)。
[0121]圖18A-18B是顯示LCMV PCR產物的電泳的瓊脂糖凝膠圖像。
[0122]圖19A-19B是顯示單鏈體模式(singl印lex format)的LCMV MX NP和GP基因的實時檢測的線圖。
[0123]圖20顯示了雙鏈體模式(duplex format)的LCMV MX NP和GP基因的實時檢測的線圖。
[0124]圖21A-21B是顯示單鏈體模式的LCMV ARM NP和GP基因的實時檢測的線圖。
[0125]圖22是顯示雙鏈體模式的LCMV ARM NP和GP基因的實時檢測的線圖。
[0126]圖23A-23D是顯示LCMV實時PCR測定的靈敏度的線圖。摻入有系列稀釋的LCMV感染細胞的血液樣品通過實時PCR測定加以檢測，圖23A，圖23B為單鏈體模式，圖23C，23D為雙鏈體模式。
[0127]圖24是顯示通過實時PCR評估的缺氧和正常氧條件下的LCMV MX NP和GP基因表達的柱狀圖。
【具體實施方式】
[0128]本公開是基於但不限於一個令人驚訝的發現，即持續感染的LCMV可以被缺氧重新激活。這種病毒重新激活可以在臨床上有表現，例如在易感的受試者中表現，這樣的受試者體內，包括但不僅限於，懷孕的受試者、免疫受損的受試者、移植接受者和具有發生癌症的危險或者患有癌 症的受試者。因此，本公開提供了用於可靠地檢測LCMV，例如重新激活的LCMV，的組合物和方法。
[0129]淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)是沙粒病毒科(Arenaviridae)的一種原型成員，具有帶包膜的病毒粒子和雙節段的(bisegmented)單鏈RNA基因組(見圖1)。兩個節段(小[S]和大[L])均包含兩個沿著彼此相反方向的開放閱讀框，採用雙義(ambisense)編碼策略(Meyer et al，2002)。S RNA編碼一個主要的病毒蛋白核蛋白(NP)和一個糖蛋白前體(GP-C)，其被共翻譯地裂解成周糖蛋白I (GPl)和跨膜糖蛋白2 (GP2) (Southern etal, Virology, 157 (I): 145-55 (1987) )。L RNA 節段編碼 RNA 依賴的 RNA 聚合酶(L)和調節環指 Z 蛋白(ZP) (Buchmeier Curr Top Microbiol Immunol.262:159-73 (2002) ; Salvato,Virologyl73, 1-10(1989))。
[0130]病毒複製開始是在L聚合酶驅動下轉錄負極性的3』 RNA基因組臂，產生mRNA，mRNA隨後被翻譯成NP和L聚合酶。這些病毒蛋白質有助於將RNA基因組轉錄成病毒cRNA，病毒cRNA作為合成新基因組RNA分子的模板，以及翻譯成GPC和ZP的亞基因組mRNA的模板。這種兩階段複製策略有助於建立病毒持續感染(virus persistence),該狀態能夠在由於糖蛋白不表達或者表達有限而導致不存在成熟病毒顆粒產生的情況下，藉助由NP、RNA基因組和L聚合酶構成的病毒核糖核蛋白得以保持(van der Zeijst et al, J Virol48:249-61(1983) ;Buchmeier, 2003)。LCMV可以在各種各樣的來自不同物種的細胞類型中容易地建立持續性感染，在這些細胞中它並不幹擾重要的細胞功能，但是可調變非必需的表型特徵(Oldstone, Curr Top Microbiol Immunol.263:83-117 (2002) ; Peters et al,同上)。
[0131]由於LCMV與齧齒動物物種小家鼠關聯，因此在世界上廣泛分布。人一般通過直接或間接與被感染的嚙齒類動物或寵物接觸，而通過呼吸道感染(通過吸入被病毒汙染的動物唾液，尿液和糞便的氣溶膠)。在免疫功能正常的個體中，LCMV從輕度流感樣症狀到罕見嚴重腦炎(Jahrling and Peters, 1992, Buchmeier et al, 2007)的各種不同病狀。已經有人將懷孕期間的該種病毒感染與自然流產和畸形聯繫起來(Jamieson et al, 2006, Meritetet al，2009)。更引人注目的是，最近報導了從受感染的供體向免疫受損的受體通過器官移植傳播的LCMV感染導致死亡的案例，喚起了人們對這種看似無害病毒的更大關注(Fischer et al, 2006, Amman et al，2007)。
[0132]急性感染涉及產生成熟的GPl和GP2，而慢性/持續感染顯示產生不成熟的GPC，但是成熟形式的糖蛋白缺少或者降低，NP在急性和慢性/持續狀態下均產生，類似地，ZP在急性和慢性/持續狀態下均產生，但是其表達在被缺氧重新激活時提高(Buchmeier, 2003, Tomaskova et al,未公開數據)。這個事實在先前檢測LCMV的嘗試中被忽視了，但是最近我們的研究數據重新喚醒了對它的注意:我們的數據顯示GP，NP和ZP的產生和感染病毒粒子的形成響應缺氧而相對提高，而缺氧與許多生理和病理狀態有關，包括胚胎發育、心臟和腦缺血、癌症等。而且，LCMV 「重新激活」已知會由於免疫抑制(出於移植目的，由於化療和其它情況下)而發生，並且也很可能與病毒GP，NP和ZP的表達提高有關。 [0133]迄今為止，沒有可靠的用於LCMV檢測、篩選和診斷LCMV急性和/或慢性感染的方法用於臨床實驗的常規應用，要進行篩選/診斷的目標(危險)人群還沒有得到確定，因為缺少全面的流行病學數據。現有的測定法(包括例如免疫螢光、ELISA、補體結合反應和RT PCR測定)沒有顯示足夠的靈敏性和可重複性，不能區分急性和慢性/持續感染，並且僅在暴發疫情或當其它病毒不能檢出時才偶爾採用。而且，現有測定一般不會組合NP，GP, ZP(或GCP和GPl)和ZP衍生的寡核苷酸或多肽檢測病毒和/或病毒特異性抗體，因此很可能無法檢出許多LCMV感染病例，即使當感染已通過其他方式被證明時也是如此。因此，非常需要獲得精確、靈敏和可重複的常規測定方法。
[0134]用於檢測LCMV的組合物
[0135]本公開包含的組合物包括能夠特異檢測生物樣品中的一種或多種LCMV標記的生物和合成材料。
[0136]LCMV的標誌物包括，例如，一種或多種或至少一種(例如1、2、3、4、5或更多種，包括2、3、4或5種的組合)LCMV核酸(例如LCMV mRNA和/或LCMV基因組DNA/RNA，例如編碼一種或多種LCMV肽(例如LCMV GP(1和/或2)、Z蛋白、NP和/或L蛋白)的LCMV DNA),和/或LCMV蛋白或肽(例如I, 2，3，4，5或更多種，包括2、3、4或5種LCMV GP (I和/或2)、Z蛋白、NP和/或L蛋白的組合)。例如，在一些情況下，LCMV的標誌物可以包括LCMV GP和/或LCMV NP核酸和/或蛋白。在一些情況下，LCMV的標誌物可以包括標誌物的部分，或者可以通過靶定標誌物的部分加以檢測。在一些情況下，LCMV標誌物的部分可以包括，例如，在一種或多種LCMV病毒株或分離株中保守的核酸區域。例如，用於檢測的合適部分可以包括在圖2-4中被鑑定為保守的區域(例如在SEQ ID NO: 1-57的一個或多個中)。或者/並且，合適的部分可以包括與一種或多種LCMV病毒株的區域有至少50%同一性(例如，50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%,或 100% 同一性)的 LCMV 核苷酸區域(例如在 SEQID NO: 1-57的一個或多個中)。在一些情況下，合適的部分可以包括與由SEQ ID NO: 1-57的一個或多個編碼的蛋白區域有至少50%同一性(例如，50%，60%, 70%, 80%, 85%，90%, 95%，98%，99%，或100%同一性)的LCMV蛋白區域。在一些情況下，合適的部分可以包括與SEQID NO: 52-57的一個或多個內的區域有至少50%同一性(例如，50%，60%, 70%, 80%, 85%, 90%,95%，98%，99%，或100%同一性)的LCMV蛋白區域。
[0137]適合於特異檢測這些一種或多種或者至少一種LCMV核酸或其部分的組合物可以包括，但不僅限於，核酸探針或引物。用於設計和合成合適探針或引物的方法是本領域已知的。在一些情況下，能夠用於檢測一種或多種或者至少一種LCMV標誌物的核酸探針或引物可以包括含有例如10種或更多種核酸(例如10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，45，50，55，60，70，75，80，85，90，95，100，200，300，400，500，600, 700, 800, 900, 1000，或更多種核酸)核酸探針或引物，例如，其中該10種或更多種核酸與一種或多種LCMV標誌物內(例如在SEQ ID NO: 1_51的一個或多個內)的靶區域具有至少 50% 同一性(例如 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%,或 100% 同一性)，從而使該核酸探針或引物與靶區域(例如在SEQ ID NO: 1-51的一個或多個內)特異性結合。在一些情況下，該探針或引物能夠在嚴格結合條件(例如低嚴格性、中嚴格性或高嚴格性)下結合(例如特異性結合)靶區域。符合低、中和高嚴格雜交條件的雜交條件在本領域是已知的。本領域中理解的是，能夠特異性雜交的互補的核酸序列不需要與其靶核酸100%互補。當本發明的互補核酸序列或其部分與靶序列發生結合，從而使得靶部分的擴增能夠發生時，則本發明的互補核酸序列是能夠特異雜交的。在一些情況下，可以使用多種探針或引物檢測樣品(術語「樣品」或「 生物樣品」是指從受試者(人或動物)獲得的組織或體液樣品)中的同一 LCMV核酸，所述包括但不僅限於，血液、血清、血漿、活組織檢查和手術樣品、唾液、尿液、腦脊液等。生物樣品還包括體外培養細胞和培養基。樣品可以在分析之前通過加熱、離心、沉澱等加以處理)中的相同LCMV核酸。在這些情況下，探針能檢測同一 LCMV核酸的重疊部分，或者它們能夠檢測同一 LCMV核酸的非重疊部分。或者/並且，可以使用多種探針或引物檢測樣品中的不同LCMV核酸。在一些情況下，可用於檢測一種或多種或至少一種LCMV標誌物的核酸探針或引物可以包括，例如，如下的一種或多種或至少一種:SEQ ID NO:58, SEQID N0:59(例如 SEQ ID N0:58 和 59 的組合，其檢測 LCMV NP), SEQ ID NO:60, SEQ IDNO: 61 (例如 SEQ ID NO:60-61 的組合，其檢測 LCMV GP)，SEQ ID NO: 62，SEQ ID N0:63(例如 SEQ ID N0:62-63 的組合，其檢測 LCMV ZP)，SEQ ID NO:66, SEQ ID N0:67(例如 SEQ IDN0:66-67 的組合，其檢測LCMV NP)，SEQ ID NO:68, SEQ ID N0:69(例如 SEQ ID NO:68-69的組合，其檢測 LCMV GP), SEQ ID NO: 70，SEQ ID NO: 71 (例如 SEQ ID NO: 70-71 的組合，其檢測 LCMV L), SEQ ID NO: 72，SEQ ID NO: 73 (例如 SEQ ID NO: 72-73 的組合，其檢測 LCMVZ)。在一些情況下，可用於檢測一種或多種或至少一種LCMV標誌物的核酸探針或引物可以包括與如下的一種或多種具有至少50%(例如50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%，98%, 99%和100%)序列同源性或同一性的核酸探針或引物:SEQ ID NO: 58和59的組合，其檢測 LCMV NP) ；SEQ ID NO:60, SEQ ID N0:61(例如 SEQ ID N0:60_61 的組合，其檢測LCMV GP) ；SEQ ID NO:62, SEQ ID N0:63(例如SEQ ID N0:62_63 的組合，其檢測LCMV ZP)；SEQ ID NO:66, SEQ ID N0:67(例如 SEQ ID NO:66-67 的組合，其檢測 LCMV NP), SEQ IDNO:68, SEQ ID N0:69(例如SEQ ID N0:68_69 的組合，其檢測LCMV GP) ；SEQ ID NO:70, SEQID N0:71(例如SEQ ID N0:70_71 的組合，其檢測LCMV L) ；SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73(M如SEQ ID NO: 72-73的組合，其檢測LCMV Z)。在一些情況下，可用於檢測一種或多種或至少一種LCMV標記的核酸探針或引物可以包括本文實施例21中描述的探針或引物中的一種或多種。
[0138]在一些情況下，適合於檢測一種或多種或至少一種LCMV核酸或其部分的方法可以包括例如RT-PCR和/或RLM-RACE (例如如本文實施例2中所述)。
[0139]或者/並且，LCMV的標誌物可以包括一種或多種LCMV肽(例如包括多肽或蛋白)，並且用於檢測LCMV的方法可以包括例如檢測一種或多種LCMV肽。
[0140]術語「多肽」和「蛋白」是指胺基酸殘基的聚合物或寡聚體，包括全長蛋白、片段、肽、寡肽、多聚體等。該術語還包括翻譯後修飾(糖基化、磷酸化、乙醯化等)，以及對天然序列(自然突變體和變異體)的缺失、添加、替換、突變)，例如只要該產物保持期望的活性即可),例如本文中公開的一種或多種LCMV肽。
[0141]在一些情況下，LCMV肽可以是全長LCMV肽或LCMV肽的片段，例如本文中公開的LCMV肽的片段(見例如由SEQ ID NO: 1_51的一種或多種編碼的肽或肽片段，和/或SEQ IDNO: 52-58的一種或多種，或者SEQ ID NO: 52-58的一種或多種的片段/部分)。合適的片段可以包括在一種或多種LCMV病毒株或分離株之間保守的胺基酸區域。例如，合適的片段可以包括被鑑定在圖5-7或SEQ ID NO: 1-58(包括例如由SEQ ID NO: 1_51的一個或多個編碼的肽)中保守的區域。或者/並且，合適的片段可以包括與在一種或多種不同LCMV病毒株中的區域有至少 50% 同一性(例如 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%,或 100% 同一性)的LCMV胺基酸內的區域。在一些情況下，合適的片段可以包括至少3個胺基酸(例如3-10個胺基酸)。或者/並且，合適的片段可以包括3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，I6，17，18，19，20，25，30，40，50，60，70，80，90，100或更多個胺基酸。在一些情況下，合適的片段可以包括抗原或表位。術語「抗原」指各種LCMV多肽或其片段(天然、重組或合成的)，其含有一個或多個與LCMV抗體結合的表位，並且來自於任何LCMV分離物/病毒株。而且，抗原可以是參考LCMV抗原分子(全長或其片段)與另一種不會干擾LCMV抗原反應性的抗原/蛋白/肽的融合蛋白。抗原可以是免疫原組合物的一部分，其是指一種樣品(包括但不僅限於被感染細胞、全細胞裂解物`、`蛋白提取物)，可以是或者可以不是基本上純化的(包含超過50%的內部存留樣品)，或者可以是分離的(處於分離或離散的形式)。
[0142]術語NP抗原是指來自LCMV (例如包括任何LCMV病毒株和分離株)核衣殼蛋白的抗原。LCMV各種NP抗原的核苷酸或相應胺基酸序列是已知的(圖2和5，SEQ ID NOSil-1l和31-40)。其他的序列已經保存在Genbank中，如在先前出版物中具體說明的(見下文)。可用於本發明的測定的一種代表性的免疫反應性NP抗原是一種來自LCMV MX病毒株的融合蛋白。它包括數個表位，並且與該抗原結合的抗體與來自Armstrong病毒株的NP抗原具有交叉反應性。
[0143]術語「核糖核蛋白」或「RNP」是指被NP抗原覆蓋的病毒基因組RNA節段(S和/或L)的複合體。這些RNP在LCMV感染期間在被感染細胞內形成，並也被釋放到細胞外空間。
[0144]術語「GP抗原」是指來自LCMV (包括任何LCMV病毒株或分離株)糖蛋白的抗原。LCMV各種GP抗原的核苷酸或相應胺基酸序列是知的(見例如圖3和6，SEQ ID N0S: 12-23和41-51)。其他序列已經保存在Genbank中，如在先前出版物中具體說明的(見下文)。可用於本發明的測定的一種代表性的免疫反應性NP抗原是一種來自LCMV MX病毒株的融合蛋白。它包括數個表位，並且與該抗原結合的抗體與來自Armstrong病毒株的GP抗原交叉反應。
[0145]術語GPC抗原是GP抗原的一種前體、未成熟形式，並且以持續或異常感染為典型特徵。它包含跨越GPC切割成GPl和GP2的切割區域(片段)的表位，該表位僅對GPC的特異識別有意義。LCMV各種GPC抗原的序列是已知的(見圖3和6，SEQ ID N0S: 12-23和41-51)。
[0146]術語GPl抗原是包膜抗原的成熟的外部亞單位，包膜抗原是急性感染的典型特徵。它包括GPl的C端區域(片段)的表位，該表位在GPC中是不暴露的。LCMV各種GPC抗原的序列是知的。
[0147]術語「ZP抗原」是指來自LCMV Z蛋白的抗原。LCMV的各種ZP抗原的核苷酸和相應胺基酸序列是知的(見圖4和7，SEQ ID NOS:24-30和52-57)。其他序列已經保存在Genbank中，如在先前出版物中具體說明的(見下文)。可用於本發明的測定的一種代表性免疫反應ZP抗原是一種來自LCMV MX病毒株的融合蛋白。它包括數個表位,而且與該抗原結合的抗體同來自Armstrong病毒株的ZP抗原有交叉反應性。
[0148]術語「表位」是指抗原上的這樣的位點:特異B細胞和/或T細胞應答於該位點，且該位點與生物樣品中存在的LCMV抗體反應並刺激抗體產生。該術語可以和「抗原決定位點或抗原位點」互換使用。表位可以包含3-10個或更多個組織成獨特的構象或線性形式的
胺基酸。
[0149]術語「免疫原性組合物」是指至少一種免疫原性多肽(例如NP，GP, ZP和/或核糖核蛋白(RNP))。
[0150]在一些實施方案中，LCMV的肽標誌物可以用作診斷劑，例如用來檢測生物樣品中的針對LCMV的抗原。
[0151]抗原還可以用於產生診斷用的多克隆和單克隆抗體。多克隆抗體可以通過向哺乳動物，例如小鼠、大鼠、家兔、山羊、綿羊、駝羊、馬等，施用LCMV抗原來產生，LCMV抗原可以是分離的或者基本上純化的LCMV抗原，或者可以是免疫原性組合物的一部分(即處於被感染細胞的形式)。可以從被免疫的抗原收集血清，並可以進一步純化抗體。用於產生和處理多克隆抗體的技術是本領域已知的。
[0152]術語「抗體」使用其最廣泛的意義，具體包括例如單克隆抗體(包括激動性抗體、拮抗性抗體和中和性抗體，去免疫化(de-1mmunized)抗體、鼠抗體、嵌合或人源化抗體),具有多表位特異性的抗體組合物，單鏈抗體，雙抗體，三抗體、免疫偶聯物和抗體片段。
[0153]這裡所使用的術語「單克隆抗體」是指從基本上均質的抗體群體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體是相同的，除了可能存在少量的自然發生的突變體。單克隆抗體是高度特異的，靶向針對單個抗原位點。而且，與包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體不同，每個單克隆抗體指定針對抗原上的單個決定簇。除了其特異性之外，單克隆抗體的優點還在於，它們的合成不被其他抗體的汙染。修飾語「單克隆」指示了抗體是從基本上均質的抗體群體獲得的這一特徵，而不是意味著要求抗體通過任何特殊的方法產生。例如，根據本發明使用的單克隆抗體可以通過雜交瘤(鼠或人)方法製備，其首先由Kohler et al.，Nature, 256:495 (1975)介紹，或者可以通過重組DNA方法(見例如美國專利N0.4，816，567)製備。「單克隆抗體」還可以使用例如Clackson etal., Nature, 352:624-628 (1991)和 Marks et al.，J.Mol.Biol.，222:581-597 (1991)介紹的技術從噬菌體展示文庫分離。
[0154]「抗體片段」或「抗體結合片段」包括完整抗體的一部分，優選地包括其抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括短於全長的抗體，Fab, Fab'，F(ab' )2，和Fv; 二價抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；單鏈抗體；單結構域抗體分子；融合蛋白；重組蛋白和由抗體片段形成的多特異性抗體。
[0155]與興趣抗原(例如LCMV抗原或標誌物)「結合」的抗體是一種能夠以足夠的親和性結合抗原的抗體，從而使抗體可用作治療或診斷劑，靶定表達抗原的細胞。當抗體是結合LCMV抗原或標誌物的抗體時，與其它抗原相比，它通常優先結合LCMV抗原或標誌物，並且不包括偶然的結合，例如非特異性Fe接觸，或者與和其它抗原共用的翻譯後修飾結合，並可以是不與其它蛋白有顯著交叉反應的抗體。用於檢測與興趣抗原結合的抗體的方法是本領域公知的，可以包括，但不僅限於，FACS、細胞ELISA和Western印跡等測定法。
[0156]「人源化」和/或「嵌合」形式的非人(例如鼠)免疫球蛋白是指含有特定嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv，Fab, Fab』，F(ab』)2或抗體其它抗原結合序列)的抗體，其與原始抗體相比，可導致人抗小鼠抗體(HAMA)、人抗嵌合抗體(HACA)或人抗人抗體(HAHA)的響應降低，並且含有來自所述非人免疫球蛋白的、對於再現期望效果而言必需的必要部分(例如CDR、抗原結合區、可變區等)，同時保持與所述非人免疫球蛋白相當的結合特徵。對於大多數部分，人源化抗體是如下的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體抗體互補決定區(CDR)的殘基被來自非人物種(供體抗體)例如小鼠、大鼠、家兔的CDR的殘基代替，並具有期望的特異性、親和性和能力。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區(FR)殘基被相應的非人FR殘基代替。而且，人源化抗體可以包含在受體抗體和導入的CDR或FR序列中均無發現的殘基。進行這些修飾可以進一步調整和優化抗體性能。一般地，人源化抗體包括至少一個、典型地2個，可變結構域的基本上全部，其中與非人免疫球蛋白⑶R區相應的全部或基本上全部的CDR區和全部或基本上全部的FR殘基是人免疫球蛋白共有序列。人源化抗體還最佳地包含至`少一部分免疫球蛋白恆定區(Fe)，通常是人免疫球蛋白。在一些情況下，本文中公開的抗體可以是人源化的。
[0157]在整個本專利申請中，雜交瘤細胞系以及由其產生的單克隆抗體用它們的國際名稱，例如 M59, M87, M166,和 MJ3,或其保藏地名稱 LMBP9216CB (M166)和 LMBP9217CB (MJ3)，來指稱。
[0158]如這裡所使用的，「免疫偶聯物」是指與報告部分地化學或生物學地連接的任何分子，例如抗體或抗體片段。抗體可以在分子的任何位置與報告部分連接，只要它能夠結合其靶標即可。
[0159]單克隆抗體可以在用如上所述的LCMV抗原或其片段免疫之後產生。被免疫動物含有正常B細胞的脾臟可以和骨髓瘤細胞融合，基本上通過Kohler和Milstein (1975)開發的程序，並且所產生的雜交瘤可以用各種免疫檢測方法篩選以產生特定抗體。特定的單克隆抗體可以用雜交瘤培養基的形式中或者通過在蛋白A/G葡聚糖上通過親和色譜加以純化而獲得。抗體分子片段，例如F(ab' ) 2，Fv和sFv分子可以用已知技術產生。或者，可以利用噬菌體展示系統在體外鑑定和擴增單克隆抗體分子群體和/或提高抗體的免疫性倉泛。[0160]適合於特異檢測一種或多種LCMV肽或LCMV肽片段的組合物可以包括，但不僅限於，抗體和/或抗體片段。在一些情況下，術語「抗體」是指如下所述的分子，其片段(Fab' 2，Fab, Fv, sFv,微型抗體和任何其它功能片段)、其雜合體(嵌合)或雙特異性變異體:其特異性結合目標抗原和/或表位。該術語同時包括從多克隆和單克隆製備物獲得的抗體。在一些情況下，抗體或抗體片段可以是人源化的。
[0161]在一些情況下，用於檢測一種或多種LCMV肽或片段的組合物可以包括(例如可以由其構成，基本上由其構成，或可以包括)例如本文中公開一種或多種抗體(例如M87，M59，M166，和/或MJ3中的一種或多種)的重鏈和/或輕鏈可變區，或其部分。例如，組合物可以包括M87，M59，M166，和MJ3的重鏈和輕鏈可變區或其部分。或者，組合物可以包括M87，M59, M166,和MJ3的重鏈可變區或其部分，和M87，M59, M166,和MJ3的輕鏈可變區或其部分，其中該重鏈可變區和輕鏈可變區不是來自相同抗體。在一些情況下，組合物可以包括M87, M59, M166,和/或MJ3的一個或多個互補決定區(⑶R)(例如CDRl, CDR2和/或⑶R3的一個或多個)。例如，可以組合來自不同抗體的⑶R。
[0162]在一些情況下，用於檢測一種或多種LCMV肽或片段的組合物可以包括(例如可以由其構成，基本上由其構成，或可以包括)例如抗體M87的重鏈可變區(即SEQ ID N0:74)或與 SEQ ID NO: 74 具有至少 50% 同一性(例如 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%,或100%同一性)的胺基酸序列。在一些情況下，用於檢測一種或多種LCMV肽或片段的組合物可以包括(例如可以由其構成，基本上由其構成，或可以包括)例如抗體M87的重鏈可變區(即 SEQ ID N0:74)，其含有至少 I 個(例如 I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，少於30，少於40，少於50，或少於100個)保守胺基酸替換，如下文所述。例如，在一 些情況下，用於檢測一種或多種LCMV肽或片段的組合物可以包括(例如可以由其構成，基本上由其構成，或可以包括)例如抗體M87的重鏈可變區(即SEQ IDN0:74)，其中相應於CDRl, CDR2和/或CDR3的區域可以含有至少I個(例如I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，少於 30，少於 40，少於 50，或少於100個)保守胺基酸替換，而相應於CDR1，CDR2和/或CDR3的區域之外的區域(例如框架區(即FR1，FR2和/或FR3))與SEQ ID NO:74中相應的區域具有至少50%同一性(例如 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%,或 100% 同一性)。在一些情況下，用於檢測一種或多種LCMV肽或片段的組合物可以包括(例如可以由其構成，基本上由其構成，或可以包括):M87重鏈可變區的⑶R3 (例如SEQ ID NO: 78)，和/或M87重鏈可變區的⑶R2 (例如SEQ ID N0:77)，和/或M87重鏈可變區的CDRl (例如SEQ ID NO:76)，其中CDR3、2和I的任一個可以任意地包含至少I個(例如I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，少於30，少於40，少於50，或少於100個)保守胺基酸替換。
[0163]在一些情況下，用於檢測一種或多種LCMV肽或片段的組合物可以包括(例如可以由其構成，基本上由其構成，或可以包括)LMBP9216CB (M166)和/或LMBP9217CB (MJ3)。
[0164]如這裡所使用的，表達語「細胞」、「細胞系」和「細胞培養物」可以互換使用，並且所有這些名稱均包括後代。還應當理解，所有後代可能由於故意或不經意的突變而在DNA內容上是不精確相同。許多具有與最初的轉化細胞所篩選的功能或生物活性相同的功能或生物活性的後代均包含在內。可以從上下文清楚地看出何處意圖指定不同名稱。
[0165]適合於特異檢測一種或多種LCMV肽或LCMV肽片段的其它組合物可以包括抗原結合肽。這些肽特異性結合一種或多種LCMV肽或LCMV肽片段。在一些情況下，這些肽可以包括本文所公開的抗體的互補決定區(⑶R)(例如⑶R1，⑶R2，⑶R3的一個或多個)。
[0166]在一些情況下，一種或多種抗體或其抗原結合片段可以通過插入一個或多個保守的胺基酸替換進行修飾。
[0167]「非必要」胺基酸殘基是在多肽野生型序列中可以被改變的殘基(不會消除或基本上改變其活性)。「必要」胺基酸殘基是這樣的殘基，當相對於多肽的野生型序列改變該胺基酸時，會導致多肽活性消失或基本上消失 。
[0168]「保守胺基酸替換」是胺基酸殘基被具有相似側鏈的胺基酸殘基替換。具有相似側鏈的胺基酸殘基家族在本領域中已有定義。這些家族包括具有鹼性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側鏈(例如天冬氨酸、穀氨酸)，不帶電極性側鏈(例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、絲氨酸)，非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、
[0169]脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，貝塔分支側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的胺基酸。
[0170]在一些情況下，本文所用的術語「必要」胺基酸包括必要胺基酸的保守替換。一般地，「必要」胺基酸殘基出現在α螺旋的相互作用面。
[0171]α螺旋的「相互作用面」包括與其它胺基酸殘基相互作用的胺基酸殘基。在這種情況下，相互作用面包括與LCMV相互作用的胺基酸。用於鑑定肽的相互作用面的方法是本領域已知的(見例如Broglia et al., Protein sc1., 14(10):2668-81, 2005;Hammond et al., J.Pharm.Sc1., 98 (I): 4589-603, 2009 ; Ng and Yang, J.Phys.Chem.B.，111(50):13886-93, 2007;和 Bird et al., PNAS USA, 197:14093，2010)。在一些實施方案中，本文公開的任何肽的胺基酸序列可以改變，只要相互作用表面的殘基與SAH-p53-8的相同或者是其保守替換即可。
[0172]在一些情況下，適合於特異檢測一種或多種LCMV肽或LCMV肽片段的組合物可以被修飾，從而包括例如氨基和/或羧基端標誌物或基團(例如可檢測基團)。基團的實例包括，但不僅限於，螢光基團(例如螢光探針(如螢光素或若丹明))、金屬螯合基團、放射性同位素、或能夠螯合反射性同位素的基團(例如與放射性同位素Re、In或Y螯合的巰基乙醯三甘氨酸或1，4，7，10-四氮雜環十二烷-N，N』，N」，N」』 -四乙酸(DOTA))，尋靶基團、生物素模塊、tat蛋白、親和標記、脂肪酸來源的醯基，和任何其它原本不存在於肽和/或任何其它肽(例如自然發生的肽)中，也不存在於在本文所公開方法中要使用的肽(例如LCMV肽或其片段，或用於檢測LCMV肽或其片段的肽)中的可檢測的基團。用於製備具有氨基和/或羧基端基團的肽的方法是常規的並且是本領域中已知的。術語「標籤」是指一種能夠檢測的分子，例如放射性同位素、螢光染料、化學發光染料、發色團、金屬離子、金屬鹽、酶、酶底物、酶輔助因子、酶抑制劑、適配子(生物素、親和素、鏈親和素、異羥洋地黃毒苷配基)等。
[0173]本領域的技術人員會容易地理解如何確定兩個核酸或胺基酸的同一性。例如，可以在將兩個序列比對從而使同一性處於最高水平後計算同一性。例如，核酸同一性可以用 Zuker, Science244:48-52 (1989);Jaeger et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:7706-10 (1989) ; and Jaeger et al.,Methods Enzymo 1.183:281-306(1989)中公開的算法加以確定，本文通過提述併入這些參考文獻中至少與核酸比對相關的材料。應當理解，任何這些方法通常都可使用，並且在一些情況下這些不同方法的結果可能會不同，但是本領域技術人員會理解，如果使用這些方法中的至少一種發現了所需水平的同一性，就可以稱這些序列具有規定的同一性並且被申請所公開。
[0174]本發明的肽可以通過本領域技術人員公知的化學合成方法加以製備。見例如Fields 等，第三章，Synthetic Peptides: A User’s Guide, ed.Grant, ff.H.Freeman&C0., NewYork, N.Y., 1992, p.77。因此，肽可以在 Applied Biosystems 月太合成儀 Model430A 或 431上使用側鏈被保護的胺基酸通過t-Boc或Fmoc化學保護a -NH2,使用自動化的Merrif ield固相合成技術加以合成。
[0175]本文所述的製造肽的一種方式是使用固相肽合成(SPPS)。C端胺基酸通過與接頭分子形成酸不穩定的鍵附著在交聯的聚苯乙烯樹脂上。該樹脂在用於合成的溶劑中不可溶，從而能夠相對簡單而快速地洗去多餘的試劑和副產品。N端用Fmoc基團保護,該基團在酸中穩定，但是可以用鹼除去。任何側鏈功能基團均用鹼穩定、酸不穩定的基團加以保護。
[0176]更長的肽可以通過使用自然化學連接(native chemical ligation)將單獨的合成肽共同連接起來加以製備。或者，更長的合成肽可以通過公知的重組DNA技術加以合成。這些技術在公知的標準手冊中有提供，並具有詳細的操作規程。為了構建編碼本發明肽的基因，將胺基酸序列逆翻譯，從而獲得編碼胺基酸序列的核苷酸序列，優選地核苷酸序列具有適應待表達該基因的生物體的優化密碼子。接著，製備合成基因，典型地通過合成編碼該肽(以及，如果需要的話，任何調節元件)的寡核苷酸。將該合成基因插入到合適的克隆載體中並轉染進入宿主細胞 。然後肽在適合於所選表達系統和宿主的合適條件下表達。通過標準方法對肽進行純化和表徵。
[0177]肽可以通過高通量的組合方式加以製備,例如可以從Advanced Chemtech獲得的高通量多通道組合合成儀。
[0178]肽還可以在廣泛的系統和宿主細胞中表達(例如重組表達)，包括昆蟲、哺乳動物、細菌、病毒和酵母表達系統和細胞，所有這些都是本領域公知的。
[0179]許多可用於上述系統的合適宿主細胞也是已知的。例如，哺乳動物細胞系包括可以從細胞培養物中心獲得的永生化細胞系，例如但不僅限於，CHO, HeLa, COS, MDCK等。
[0180]製備之後，可以用常規方法對肽進行測定，例如確定其序列、結合親和力和穩定性(體外和體內)。
[0181]在一些實施方案中，本文中公開的一種或多種組合物可以安置在固體支持物上。術語「固體支持物」是指可以附著大分子例如蛋白、多肽、肽、多核苷酸等的固體表面，包括但不僅限於，微孔板孔、sepharose/瓊脂糖基質、磁珠、玻璃片、尼龍、聚丙烯醯胺、硝酸纖維素膜、二氧化矽板等。而且，固體支持物的代表可以是培養物或組織樣品中的被感染細胞，其含有暴露在細胞表面或存在於細胞質中的LCMV抗原。
[0182]術語「免疫複合體」是指在測定環境中通過抗體與抗原結合形成的分子組合物。它還指生物樣品中天然出現的含有病毒核糖核蛋白和免疫球蛋白的多分子組合物。
[0183]診斷方法
[0184]本公開還描述了用於檢測樣品中LCMV的方法，例如使用一種或多種本文公開的用於檢測LCMV的組合物(例如一種或多種探針或引物，和/或一種或多種LCMV肽或LCMV肽片段，和/或一種或多種用於檢測一種或多種LCMV肽或LCMV肽片段的組合物(例如一種或多種抗體或抗體片段)檢測樣品中LCMV的方法。
[0185]針對LCMV抗原/表位的抗體可以用於檢測生物樣品中LCMV蛋白或核糖核蛋白的存在，例如使用不同的免疫測定方法或者與分子方法組合的免疫測定方法。免疫測定可以使用一種或多種抗體，且操作規程可以具有不同的形式，包括直接反應、三明治式、競爭、免疫沉澱、免疫印跡等。它們還可以和擴增程序組合呈免疫-PCR形式，其中擴增模板是病毒RNA或與抗體/抗體或檢測物連接的寡核苷酸。這些程序是本領域已知的。
[0186]診斷測定可以檢測病毒抗原或抗病毒抗體。測定可以包括免疫沉澱(IP)、免疫印跡(IB)、IP和IB的組合、酶標誌物的免疫測定、生物素/親和素型測定、PCR、免疫-PCR等。檢測一般包括顯示標記物，例如螢光、化學發光、放射性、酶標誌物或染料分子，或者用於擴增產生帶標記的產物的寡核苷酸。
[0187]測定一般地涉及將液相中的未結合抗體或抗原與抗原-抗體複合體所結合的固體支持物(有或者沒有捕捉物)分離。然後，用與標記物相互作用或偶聯的檢測物檢測抗原-抗體複合體。
[0188]典型地，首先令固體支持物與捕捉物反應。然後通過衝洗除去任何未固定的組分，然後在合適的條件下使固體支持物結合的組分與生物樣品接觸。在清洗除去任何未結合材料之後，可以在合適的結合條件下添加第二結合模塊，即檢測物。然後可以使用本領域公知的技術檢測檢測物的存在。或者，檢測物可以和帶標記的競爭分子同時添加，競爭的程度可以揭示樣品中存在的 檢測物的量。
[0189]該測定可以進行幾種不同的變化形式，如圖8和9所示。圖8顯示了採用LCMV抗原或抗體的免疫檢測試驗實例的組合物。
[0190]在A系列的測試中，單獨的病毒抗原或它們的混合物作為捕捉物，與來自生物樣品的抗-LCMV抗體結合，然後用各種檢測物或其組合進行檢測。在Al變化形式中，檢測物是直接偶聯標記物的蛋白A/G。在A2變化形式中，檢測物是直接偶聯標記物的第二抗人(或抗小鼠或其它動物物種特異性的)IgG或IgM。在A3變化形式中，檢測物抗體與生物素偶聯，生物素進一步結合親和素/鏈親和素，然後用標記物偶聯的生物素加以顯示。在A4變化形式中，第二抗體與寡核苷酸連接，寡核苷酸可以在帶標記的三核苷酸存在下通過相應的引物進行擴增。在A5變化形式中，第二抗體與生物素偶聯，其然後用親和素/鏈親和素和與寡核苷酸連接的生物素進行反應，該寡核苷酸能夠在帶標記的三核苷酸存在下通過相應的引物進行擴增。
[0191]在B系列的測定中，特異針對NP，GP (例如GPC，GPl)和/或ZP的抗體附著在固相上，並充當結合來自生物樣品的LCMV抗原的捕獲物，然後用非競爭性抗體或抗體/締合的檢測物加以檢測。在BI變化形式中，檢測物是與標記物直接偶聯的LCMV抗原特異性抗體。在B2變化形式中，檢測物是與標記物直接偶聯的抗人(或抗小鼠或其它動物物種特異性的)IgG或IgM。在B3變化形式中，檢測物抗體與生物素偶聯，生物素進一步結合親和素/鏈親和素，然後用標記物偶聯的生物素加以顯示。在B4變化形式中，第二抗體與寡核苷酸連接，該寡核苷酸可以在帶標記的三核苷酸存在下通過相應的引物進行擴增。在B5變化形式中，第二抗體與生物素偶聯，其然後用親和素/鏈親和素和與寡核苷酸連接的生物素進行反應，該寡核苷酸能夠在帶標記的三核苷酸存在下通過相應的引物進行擴增。[0192]在一些實施方案中，所述方法包括選擇受試者(術語「受試者」在整個說明書中用於描述動物，包括人或非人類。人和獸醫應用均被涵蓋。該術語可以包括例如哺乳動物，例如人、其它靈長動物、豬、齧齒動物例如小鼠和大鼠、家兔、豚鼠、倉鼠、牛、馬、貓、狗、綿羊和山羊)。例如，可以選擇具有LCMV感染危險的受試者或被懷疑具有LCMV的受試者。或者/並且，可以選擇具有會導致受試者更易於被LCMV造成損害的病症或疾病的受試者。這些受試者可以包括計劃懷孕或已經懷孕的受試者，免疫受損的受試者，移植接受者，和具有癌症發生危險或患有癌症的受試者。在一些實施方案中，如果受試者患有已知會在受試者體內產生缺氧的病症，則選擇該受試者。
[0193]在一些實施方案中，在篩選之後，可從受試者獲得樣品。然後可以使該樣品與一種或多種用於檢測本文中公開的LCMV的組合物(例如一種或多種探針或引物，和/或一種或多種LCMV肽或LCMV肽片段，和/或一種或多種用於檢測一種或多種LCMV肽或LCMV肽片段的組合物(例如一種或多種抗體或抗體片段))接觸。在一些情況下，方法可以包括如果在受試者體內檢測到LCMV，則治療LCMV感染或推薦受試者進行LCMV感染治療。
[0194]該方法還可包括在治療期間和之後對受試者進行監測或評估，以確定治療的效力，並且如果必要，調整治療以提高治療的效力。
[0195]試劑盒
[0196]本公開還描述了包含一種或多種用於檢測本文所公開LCMV的組合物的試劑盒。試劑盒還可以包括與組合物和使用組合物的方法有關的信息材料。信息材料可以是描述性的、指導性的、銷售或者其它與這裡所述組合物和方法有關的材料。
[0197]試劑盒的信息材料並不受其形式的限制。在許多情況下，信息材料(例如使用說明書)被提供為印刷材料，例如印刷的文本、圖片和/或照片，例如標籤或印刷冊頁。然而，信息材料也可以用其它格式提供，例如盲文、計算機可讀材料、視頻記錄或聲音記錄。當然，信息材料還可以用任何組合形 式提供。
[0198]除了化合物之外，試劑盒的組合物可以包括其它組分，例如溶劑或緩衝劑、穩定化劑、防腐劑、和/或用於治療本文中所述病症或疾病的第二藥劑。或者，試劑盒中可以包含其它成分，但是處於與化合物不同的組合物或容器內。在這些實施方案中，試劑盒可以包括用於混合試劑和其它成分的使用說明，或者用於和其它成分一起使用一種或多種化合物的使用說明。
[0199]本文中公開的序列是公共可得的，例如在美國國家生物技術信息中心(NCBI)網站上(見ncb1.nlm.nih.gov),和在文獻中，如下:
[0200]LCMV 病毒株MX GPC 基因，NCBI 登錄號 EU195888 (EU195888.1)和 Tomaskova, J etal., Virus Genes, 37:31-38(2008);
[0201]LCMV 病毒株 MX NP 基因，NCBI 登錄號 Y16308 (Y16308.1)和 Reiserova, L.etal.，Virology257:73-83(1999);
[0202]LCMV 病毒株 MX Z 基因，NCBI 登錄號 AJ131281 (AJ131281.1)和 Gibadulinova, A.et al., Acta Virol.，42:369-374(1998);
[0203]LCMV 病毒株 Armstrong53b - S 節段，NCBI 登錄 M20869 (M20869.1)和 Salvato, M.et al.,Virology, 164:517-522(1988);
[0204]LCMV 病毒株 Armstrong53b - LS 節段，NCBI 登錄 AY847351 (AY847351.1)和Grande-Perez, A.et al., J.Virol., 79:10451-10459 (2005);
[0205]LCMV 病毒株 CH-5692 - S 節段，NCBI 登錄號 AF325214 (AF325214.1);
[0206]LCMV 病毒株 CH-5692 - L 節段，NCBI 登錄 DQ868484 (DQ868484.1);
[0207]LCMV 病毒株 CH-5871-S 節段，NCBI 登錄號 AF325215 (AF325215.1)和 Asper, M.etal.,Virology, 284:203-213(2001);
[0208]LCMV 病毒株 Traub - S 節段，NCBI 登錄號 DQ868487 (DQ868487.1);
[0209]LCMV 病毒株 Traub - L 節段，NCBI 登錄號 DQ868488 (DQ868488.1)和 Emonet, S.etal., Genetic comparisons and evolution of6LCMV strains;
[0210]LCMV 病毒株 LE GPC 基因，NCBI 登錄號 EF164923 (EF164923.1)和 Meritet, J.F.eta1., Human Fetal Lymphocytic Choriomeningitis Virus Infection with a New GenomicVariant;
[0211]LCMV 病毒株 Ml - S 節段，NCBI 登錄號 AB261991 (AB261991.1);
[0212]LCMV 病毒株 M2- S 節段，NCBI 登錄號 AB261990 (AB261990.1)和 Ike, F.etal.，Comp.Med.57:272-281 (2007);
[0213]LCMV 分離物 Marseille#12 - S 節段，NCBI 登錄號 DQ286931 (DQ286931.1);
[0214]LCMV 分離物 MarseiIle#12 _ L 節段，NCBI 登錄號 DQ286932 (DQ286932.1)和Emonet, S.et al., Emerging Infect.Dis., 13:472-475 (2007);
[0215]LCMV 病毒株 WE- S 節`段，NCBI 登錄號 M22138 (M22138.1)和 Romanowski, V.etal.,Virus Res.,3:101-114(1985);
[0216]LCMV 病毒株 WE-S 節段，NCBI 登錄號 AF004519 (AF004519.1)和 Djavani, M.etal.,Virus Genes, 17:151-155(1998);
[0217]LCMV 病毒株 Bulgaria - S 節段，NCBI 登錄號 GQ862982 (GQ862982.1);
[0218]LCMV 病毒株 Bulgaria-S 節段，NCBI 登錄號 GQ862981 (GQ862981.1)和Palacios, G.et al., Genetic diversity of Lymphocytic choriomeningitis viruses;
[0219]LCMV 病毒株 Y-S 節段，NCBI 登錄號 DQl 18959 (DQl 18959.1)和 Compton, S.R., Lymphocytic choriomeningitis virus 病毒株 Y;和
[0220]NCBI 登錄號 FJ607019-FJ607038, 13-JUL-2010，Albarino, C.G.et al.，EmergingInfect.Dis., 16:1093-1100(2010)。
[0221]實施例
[0222]本發明進一步在下列實施例中進行介紹，其不會限制權利要求中所述的本發明的範圍。
[0223]實施例1:在多種LCMV病毒株/分離株之間存在保守的序列區域
[0224]新近對從多個地理和時間來源收集的29個LCMV病毒株的基因組分析顯示，這些病毒是多樣性的。存在數個截然不同的世系，但是它們與分離的時間和地點幾乎沒有關聯(Albarino et al, 2010) 0所有已知LCMV分離物的S和L節段序列分布在3個(L節段)或4個(S節段)不同的遺傳群體或世系中。在S節段世系之間觀察到了最高達25%的核苷酸分歧，在L節段世系之間最高有28%的分歧。這種核苷酸分歧導致Z，L, GPC和NP蛋白中的分別為18%, 13%, 10%,和6%的分歧(Albarino et al, 2010)。然而，在不同病毒株/分尚株之間存在具有可觀的序列同一性的區域(見圖2-7)，並且衍生的抗原與LCMV特異性抗體顯示交叉反應性。
[0225]這些觀察支持多種LCMV病毒株和/或分離株可以用合適的分子和免疫檢測方法加以檢測。
[0226]實施例2:缺氧從持續感染中重新激活LCMV
[0227]被LCMV MX株持續感染的HeLa細胞(HeLa-MX)在正常氧(21%02)或缺氧(2%02)條件下溫育48h。將另一 HeLa-MX細胞群體也在正常氧條件下用ImM DMOG (一種缺氧模擬劑)處理24小時。
[0228]RT-PCR
[0229]用InstaPure試劑根據製造商的使用說明提取總細胞RNA。用M-MuLV逆轉錄酶使用隨機七聚體引物實施逆轉錄。在StepOneTM實時PCR系統(Applied Biosystems, FosterCity, CA, USA.)上用POWER SYBR? Green PCR主混合物和如下的基因特異性引物進行定
量實時PCR，來分析病毒基因的表達水平:
[0230]NP (246 鹼基對(bp) PCR 產物):
[0231]正向:5，--GATCAGAAACAGTTCAAACAGGACT-3，(SEQIDNO:58)[0232]反向:5』 --GTCCCACACTTTGTCTTCATACTCT-3，(SEQIDNO:59)[0233]GP (25 Ibp PCR 產物):[0234]正向:5，--AACCAGTGCAGAACTTTTAGAGGTA-3』(SEQIDNO:60)[0235]反向:5』 --GCAAGTCTTCTAGTGAGGAACTTTG-3，(SEQIDN0:61)[0236]ZP (272bp PC·R 產物):[0237]正向:5，--CCTGTGAGAGTACAGAGACAAACCT-3』(SEQIDNO:62)[0238]反向:5』 --GATATCTTCAGCTTGGTTGGTAATG-3』(SEQIDNO:63)
[0239]β -肌動蛋白(236bp PCR 產物):
[0240]正向:5，-CCAACCGCGAGAAGATGA-3』(SEQ ID NO:64)
[0241]反向:5，-GATCTTCATGAGGTAGTCAGT-3，(SEQID NO:65)
[0242]對於每個基因，使用β -肌動蛋白作為內源對照，通過與來自正常氧對照的數值進行比較確定倍數誘導。
[0243]如圖1OA和IOB所示，如RT-PCR所評估地，與正常氧相比,缺氧與DMOG相似地增加了編碼所有的受測LCMV蛋白(即NP, ZP和GP)的mRNA的表達。對照(β _肌動蛋白)沒有觀察到改變。
[0244]為了證明缺氧在轉錄水平上影響病毒基因，使用GeneRacer方法進行RNA連接酶介導的快速5』 cDNA末端擴增(RLM-RACE)，其允許選擇性擴增5』加帽的轉錄本，並清除未加帽的基因組/反基因組LCMV RNA模板。
[0245]MX LCMV的5 』加帽轉錄本的選擇性擴增用GeneRacerTM試劑盒根據製造商(Invitrogen, Life Technologies)的使用說明來進行。對從正常氧和缺氧HeLa-ΜΧ細胞分離的RNA進行的RLM-RACE中採用的LCMV-MX基因特異性引物如下:
[0246]NP 基因
[0247]5』 RACE 反向引物:CAAGGTCGGCAGCGAGAGACATCA(SEQ ID NO:66)
[0248]5』 RACE 巢式反向引物:AGAAGGCTAGTTGCGTCCTTGATG(SEQ ID NO:67)
[0249]GP 基因[0250]5』 RACE 反向引物:GGCTGAACATGCATTGGGCATTGT(SEQ ID NO:68)
[0251]5』 RACE 巢式反向引物:TAGGAGAAGGAAGCTGACCAATGC(SEQ ID NO:69)
[0252]L 基因
[0253]5』 RACE 反向引物:TCCTGGACACACAACTCCGGACTCTA(SEQ ID NO:70)
[0254]5』 RACE 巢式反向引物:ACAGCCACTTTTGTCTGCACTGTC(SEQ ID N0:71)
[0255]Z 基因
[0256]5』 RACE 反向引物:CTTCGTAGGGAGGTGGTGGGCTTG(SEQ ID NO:72)
[0257]5』 RACE 巢式反向引物:AGTTCAGTGGACCGAGATAGGTGGT (SEQ ID NO: 73)[0258]β -肌動蛋白用作內部標準和RLM質量控制，使用試劑盒中附帶的引物。所得的PCR片段在1.5%瓊脂糖凝膠上分離，並通過測序和用獨立的基因特異性引物重擴增來檢驗其特異性。相應於各個PCR產物的條帶強度用Syngene的GeneTools軟體進行評估。基因特異性PCR產物的量半定量地表示為每個LCMV特異性條帶的強度與相應β -肌動蛋白內部標準的強度的比值。試劑盒中附帶的市售HeLa總RNA用於β _肌動蛋白擴增，作為CIP和TAP酶活性的對照。
[0259]如圖1OD所示，對從缺氧(2%02)和正常氧HeLa-ΜΧ細胞分離的總RNA實施的RLM-RACE半定量評估結果，與上述RT PCR數據一致(見圖10Α)，提示缺氧影響病毒轉錄。
[0260]免疫印跡
[0261]將I百萬個HeLa-MX種植到培養皿中，使之貼壁過夜，然後在正常氧和缺氧條件下溫育 48h。將細胞在裂解緩衝液(50mM Tris, ρΗ7.5，150mMNaCl, l%Triton X-100, 0.1% 脫氧膽酸鈉和Ix完全蛋白酶抑制劑雞尾酒[Roche，曼海姆，德國]，溶於PBS中)中破裂，用BCA測定系統(Pierce, Rockford, IL, USA)根據製造商的使用說明測定總蛋白濃度。將總蛋白提取物(100 μ g/泳道)在還原條件下通過SDS/PAGE進行分離，印跡到PVDF膜(ImmobilonTM, Millipore, Billerica, MA, USA)上，並通過使用針對NP (小鼠單克隆抗體M59)，Z蛋白(小鼠單克隆抗體MJ3)，GPl (抗-肽多克隆抗體)，HIF-1alpha或alpha-肌動蛋白的特異抗體，通過與辣根過氧化物酶偶聯的合適的第二抗體加以檢測。所有的免疫印跡用ECL檢測系統進行顯影。
[0262]如圖1OC所示，與正常氧條件相比，缺氧提高了所有受測的LCMV蛋白的表達水平。對照(肌動蛋白)沒有觀察到變化。
[0263]實施例3:被缺氧重新激活的LCMV是感染性的
[0264]使用來自在正常氧和缺氧條件下培養了 48h的HeLa-MX的過濾培養基感染未被感染的HeLa細胞。然後在正常氧條件下培養這些細胞，傳代，然後評估病毒複製。
[0265]通過RT-PCR方法確認了來自正常氧(NO)和缺氧(HY)條件下培養的HeLa-MX細胞的培養基中LCMV基因組的存在(見圖11A)。此外，通過RT-PCR分析在最先五代和第十代中跟蹤了用指定培養基感染的HeLa群體中感染的擴散(見圖11B)。還通過在20x放大倍數下通過免疫螢光檢測受體細胞內的病毒核糖核蛋白來監測感染的進展(見圖11C)。實驗重複2次，每次均顯示相似的結果。如圖11A-11C所示，缺氧可提高LCMV的感染性。
[0266]實施例2和3顯示的數據證明，缺氧能夠提高培養中病毒NP，Z和GP(包括GPl的出現)基因和蛋白的表達(實施例1)，並能夠觸發感染性病毒顆粒的形成(實施例2)。
[0267]這些數據支持了用缺氧病毒基因、抗原、針對這些抗原的抗體和其組合診斷性檢測具有缺氧危險的受:試者體內的LCMV的原理。
[0268]實施例4:特異性結合LCMV NP的抗體的產生
[0269]小鼠單克隆抗體M59、M166和M87特異針對LCMV NP。這些抗體用雜交瘤技術(Kohler and Milsteinl975)加以製備。
[0270]BALB/c小鼠用三劑5xl06個HeLa-MX細胞免疫，然後將其脾細胞與NS-O骨髓瘤細胞融合。在含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的DMEM-HAT培養基中篩選雜交瘤，然後使用HeLa和HeLa/MX細胞的細胞提取物作為抗原，通過差異ELISA篩選對NP具有特異反應性的雜交瘤。陽性雜交瘤培養物通過有限稀釋法進行克隆，擴展和用於單抗的生產。
[0271]所有M59，M166和M87均結合來自LCMV MX的NP，並與其它LCMV病毒株的NP具有交叉反應。
[0272]實施例4A:M166的保藏
[0273]將表達小鼠單克隆抗體M166的雜交瘤細胞繫於2011年12月2日保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM) (Universiteit Gent, VakgroepMoleculaire Biolgie-Plasmidicollectie (BCCM?/LMBP))，保藏號為 LMBP9216CB。
[0274]實施例4B:M87可變區序列的表徵
[0275]確定了 M87重鏈的胺基酸序列，如下所示，同時示於圖12A。從I百萬個M87細胞中分離RNA，並使用隨機七聚體引物進行反轉錄。從所得的cDNA擴增重鏈可變區，其中使用設計成與信號肽/前導序列互補的簡併正向引物(見圖12)和與恆定域CHl區互補的反向引物(見圖12)。擴增使用高保真聚合酶，通過電泳分離預期大小(大約400bp)的PCR產物，並從凝膠將其分離 。將線性PCR擴增子連接到pjetl.2載體內，然後轉化感受態大腸桿菌。對所得的轉化細胞進行篩選，並通過限制性酶切和測序對選定的菌落進行核實。M87重鏈可變區的序列被確定如下:
[0276]mdsrlnlvflvlilkgvqcdvqlvesggglvqpggsrklscaasgftfssfgmhwvrqapekglewvay issgsstlhyadtvkgrftisrdnpkntlflqmklpslcyglIgsrnlshrIlsqndtpirlsigpwklgi(SEQID NO:74)
[0277]在M87 重鏈可變區(SEQ ID NO: 74)中，mdsrInlvflvlilkgvqc (SEQ ID NO: 75)是信號妝序列；gftfssfgmhwv (SEQ ID NO:76)是CDRl ；issgsstlhyadtvkgrft (SEQ ID NO: 77)是 CDR2 ；hrllsqndtpirlsigp(SEQ ID NO:78)是 CDR3。圖 12B-12C 提供了 SEQ ID NO:74)的帶注釋的變化形式。
[0278]實施例5:特異性結合LCMV GPl的抗體的產生
[0279]如下產生了針對LCMV MX GPl的多克隆抗體。使用數種可用的程序利用GPC LCMVMX的完整序列鑑定了潛在的B細胞表位。選擇定位於GPl區域內的肽RSGWGWAGSDGKTT (SEQID NO:41的aa205-218) (SEQ ID NO:89)用於產生GPl特異的多克隆抗體。親和純化的兔多克隆抗體通過免疫沉澱和Western印跡加以測試。
[0280]實施例6:特異性結合LCMV ZP的抗體的產生
[0281]小鼠單克隆抗體MJ3特異性結合LCMV ZP0抗體用雜交瘤技術(Kohler andMilstein,上文)產生。簡而言之，用兩個劑量的5xl06HeLa-MX細胞免疫BALB/c小鼠，並用100 μ g與穀胱甘肽Sepharose4B結合的GST-Z蛋白進行強化免疫(boosted)。3天後，進行脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞的融合。雜交瘤在DMEM-HAT培養基中進行篩選，並對於雜交瘤產生的抗體，通過ELISA和免疫印跡篩選它們針對GST-Z中(相對於GST)和HeLa-MX中(相對於未感染的HeLa細胞)對Z蛋白的特異反應性。雜交瘤培養物(MJ3)通過有限稀釋進行亞克隆，擴增，並用於單抗的產生。
[0282]用不同的檢測方法均顯示單抗MJ3與Z蛋白反應。
[0283]實施例6A:MJ3的保藏
[0284]將表達小鼠單克隆抗體MJ3的雜交瘤細胞繫於2011年12月2日保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM) (Universiteit Gent, VakgroepMoleculaire Biolgie-Plasmidicollectie (BCCM?/LMBP))，保藏號為 LMBP9217CB。
[0285]實施例7:在人類受試者中檢測抗LCMV NP抗體
[0286]從(i)發生了自發流產但沒有診斷出原因的婦女；(ii)具有足月妊娠的婦女；和(iii)患有腎細胞癌(RCC)腫瘤的癌症患者獲得血清樣品。通過免疫沉澱並隨後用NP特異性單克隆抗體進行免疫印跡來分析人血清中的抗-LCMV抗體。 [0287]本實施例中使用的方法非常靈敏，並能夠檢測在急性和慢性/持續感染二者中產生的NP特異性抗體。簡而言之，將蛋白G-S印haroSe(50%漿液)用PBS清洗，並與來自HeLa-MX細胞的全細胞裂解物混合，以預清除非特異性結合蛋白。向100 μ I經過預清除的細胞提取物添加含有10%FCS的溶於190 μ I PBS中的10 μ I人血清。然後在4°C過夜以形成免疫複合體。所得的免疫複合體通過添加30 μ I經過清洗的蛋白G-Sepharose漿液，在4°C放置I小時來沉澱。然後將珠子在PBS中清洗5次，進行SDS-PAGE並轉移到聚偏氟乙烯膜上。膜用與辣根過氧化物酶偶聯的純化單抗進行探測。再經過一個清洗步驟後，用ECL檢測系統使免疫印跡可視化。
[0288]如表1A-1B所示，NP抗體在流產婦女中的血清陽性率(seroprevalence)比對照聞 19.4%ο
[0289]表1A:在經歷了自發流產的人類女性受試者中檢測的抗-LCMV NP抗體
[0290]
經流產婦女未流產婦女人數%人數 ％陽性血清3475,618 56,2陰性血清1124,414 43,8總計4510032 100
[0291]檢測到的抗體亦示於圖13中的免疫印跡。
[0292]如表4所示，在患有RCC腫瘤的患者中也觀察到了非常高的NP抗體血清陽性率。
[0293]表1B:在患有RCC腫瘤的受試者中檢測的抗-LCMV NP抗體
[0294]癌症患者人數 %陽性血清2589,3陰性血清310,7總計28100
[0295]實施例7B:通過串聯質譜在人血清中檢測NP特異性抗體
[0296]對一份通過免疫沉澱和隨後用NP特異性單克隆抗體進行免疫印跡顯示對NP陽性的人血清進行免疫沉澱，如實施例7所述。清洗之後，免疫複合體用檸檬酸鹽緩衝液(pH3)進行洗脫。通過添加IM Tris pH8.5對洗脫物的最終pH進行調節。隨後，對含有免疫複合體的洗脫物進行串聯質譜。簡而言之，將樣品還原(IOmM 二硫蘇糖醇)、烷基化(55mM碘乙醯胺)，並用含有20 μ g/ml胰蛋白酶(Promega, Madison, WI)的50mM碳酸氫銨在37°C消化過夜。將所得的肽轉移到微孔板並冷凍乾燥。將提取的肽混合物溶解在20 μ I添加有0.1%甲酸的2%乙腈水溶液中，如前人所述(Henrychova et al., 2008)通過nanoAcquity UPLC系統(Waters, Milford, MA)進行分離。在分離的全時間內以數據依賴的方式進行數據獲取，最高同時收集 3 個 MS/MS 事件。數據用 ProteinLynx Global Server v.2.4 (Waters)進行處理，其提供背景消減(5階多項式和閾值35%)、平滑(Savitzky Golay,兩次，對三個通道)和質心定位(centroiding)(頂，80%,半高為4的最小峰寬)。將所得的數據按照如下的標準在UniPix)t_LCMV資料庫中進行檢索:固定的Cys氨甲醯甲基化，可變的Met氧化，具有I個缺失切割的胰蛋白酶消化片段，肽質量容忍度50ppm，和片段質量容忍度0.05Dao通過鑑定來自相同系列的三個或更多個連續片段離子對結果進行驗證。與理論序列具有至少2個匹配肽的蛋白指派視為陽性鑑定。
[0297]如表2所示，在所分析的樣品中鑑定出了 LCMV NP。
[0298]表2:通過UPLC-MS鑑定免疫複合體中的NP
[0299]`
樣品登錄描述mW (Da)Pl (pH)PLGS Score肽MSH3C3WN3核蛋白OS淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒623998,661465,51042.processingQ9YPMI糖蛋白I片段OS淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒株WE155358,4294282,26IC3WN3核蛋白OS淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒623998,661466,5513MSE5Q86867S RNA產物蛋白片段OS淋巴細抱性脈絡叢腦膜炎病毒15966,2774250,47I
[0300] 該結果清晰地證明，被測試的人血清中含有NP特異性抗體。
[0301 ] 實施例8:在來自人RCC受試者的組織中免疫檢測LCMV抗原
[0302] 通過免疫化學檢測RCC樣品中的LCMV抗原。簡而言之，將切下的組織在4%中性緩衝的福馬林中固定，並根據標準的組織學程序包埋在石蠟中。將4μπι切片置於包被有多聚賴氨酸的載玻片上，脫臘，並復水。首先將載玻片在祀修復溶液(target retrievalsolution)中(Pascal 壓力室，DakoCytomation, Carpinteria, CA)在 125°C 5min 進行組織預處理程序。免疫染色程序剩餘部分使用Dako Cytomation EnVision (r) +系統-HRP (DAB)根據製造商的使用說明來進行:a)過氧化物酶和蛋白封閉海次10min);b)用NP特異的第一抗體M59 (未稀釋的雜交瘤培養基)或PBS (陰性對照)孵育Ih ;c)用過氧化物酶偶聯的山羊抗小鼠抗體孵育30min,抗體在抗體稀釋劑(DakoCytomation)中1:1000稀釋。染色用DAB溶液處理Imin進行可視化，以3，3』 - 二氨基聯苯胺作為發色底物。在步驟a後用
0.l%Tween-20的PBS清洗載玻片lOmin，在步驟b和c後進行2次IOmin清洗，在用DAB可視化後在蒸餾水中清洗三次。所有的孵育和清洗步驟均在室溫下進行。最後，用Mayer氏蘇木精對切片進行復染，清洗5min,並固定在DePeX (Serva, Heidelberg, Germany)中。染色的切片在Leica DM4500B顯微鏡下進行檢查，並用Leica DFC480相機照相。
[0303]如圖14A-B所示，在來自RCC受試者的組織中檢測到了 LCMV抗原。
[0304]此外，通過免疫沉澱和隨後用NP特異性抗體M87進行免疫印跡在RCC樣品中檢測到了 LCMV抗原。簡而言之，IOOmg冷凍組織樣品在含有蛋白酶抑制劑(Roche AppliedScience, Mannheim, Germany)的冰冷的裂解緩衝液(l%Triton X-100; 150mM NaCl; 50mMTris, pH7.5;0.5%Nonidet P-40; 50mM NaF)中勻漿。通過 4°C 12，OOOg 離心 15min 除去不溶的材料。將單抗M87 (I, 5ml經培養的培養基)與30 μ 150%蛋白G-S印harose PBS懸液在RT下結合2小時。組織蛋白提取物(200 μ I)用20 μ 150%蛋白G-S印harose懸浮物預清除，然後添加到已結合的單抗。然後4°C過夜令免疫複合體形成。隨後，將珠子在PBS中清洗6次，進行SDS-PAGE並轉 移到聚偏氟乙烯膜上。膜用偶聯辣根過氧化物酶的純化單抗M87進行探測。再進行一個清洗步驟後，用ECL檢測系統將免疫印跡可視化。
[0305]如圖14C所示，使用單抗M87在來自RCC受試者的組織中檢測到了 LCMV NP。
[0306]實施例9:NP特異性單克隆抗體的分析
[0307]通過雜交瘤技術(Kohler and Milsteinl975)製備了特異針對NP LCMV的小鼠單克隆抗體M59，M166，和M87。簡而言之，用三個劑量的5xl06HeLa_MX細胞免疫BALB/c小鼠，將其脾細胞與NS-O骨髓瘤細胞融合。雜交瘤在含有次黃嘌呤、氨甲喋呤和胸苷的DMEM-HAT培養基中進行篩選，並使用HeLa和HeLa/MX細胞的細胞提取物作為抗原通過差異ELISA篩選對NP具有特異反應性的雜交瘤。陽性雜交瘤培養物通過有限稀釋進行克隆，擴增，並用於產生單克隆抗體。每個單克隆抗體M59，M166，和M87均顯示與其它LCMV病毒株的NP交叉反應。
[0308]使用親和純化的兔抗小鼠IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA抗體(小鼠單克隆抗體分型試劑，Sigma),根據製造商的使用說明通過ELISA確定單抗同種型。發現M59和M166單抗是IgG2a同種型，而M87單抗是IgGl同種型。
[0309]進一步在不同的免疫檢測方法中對抗體進行測試。發現M59在ELISA、免疫沉澱和免疫組化中與NP反應；發現M166在ELISA、IFA和免疫沉澱中與NP反應；並發現M87在ELISA、免疫沉澱、IFA和免疫印跡中與NP結合。這些數據提示，抗體識別NP分子的不同表位,M59和M166定向於構象表位,M87結合線性表位。通過競爭結合試驗證實了這些抗體的不同表位特異性。[0310]簡而言之，首先通過在蛋白A/GSepharose上進行親和色譜來純化單抗，用NHS-LC-生物素(Pierce)根據製造商的使用說明對單抗進行標記。將來自HeLa-MX細胞的提取物吸附在微孔板的孔上，濃度相當於被標記的單抗最大結合的50%。清洗經包被的平板，用含10%FCS的PBS飽和。添加5倍系列稀釋於30 μ I中的純化單抗和恆定量的30 μ I生物素化單抗，並在4°C孵育過夜。清洗平板，並使用過氧化物酶標記的鏈親和素(Pierce)作為檢測劑。
[0311]結果如圖15A和15B所示。這些是顯示M87和M59單抗之間競爭結合的檢查結果的圖。使生物素標記的純化抗體(*)在遞增量的未標記的競爭抗體的存在下進行結合。將在未標記的競爭者的存在下標記的抗體的結合量表示為不存在競爭者時結合量的百分比。稀釋度O相當於10 μ g/孔的未標記的競爭抗體。結果顯示僅存在同源競爭，而沒有觀察到對標記的競爭者結合的異源幹擾，提示這些單抗結合於非重疊的表位。
[0312]實施例10:病毒對缺氧的響應:LCMV沙粒病毒作為範例
[0313]被病毒感染細胞的生理環境(context)可能顯著影響病毒後代的增殖與擴散。主要在持續感染期間，在此期間病毒強烈依賴宿主細胞並且通常不會干擾其維持生命所必需的功能，微環境脅迫(例如缺氧)可能打斷病毒-宿主的緊密關係並提高病毒的致病(pathogenesis)。越來越多的證據提示,受HIF轉錄因子調控的缺氧誘導的分子響應會調變如下所述的病毒的基因表達:經歷DNA階段、在其啟動子中含有HRE、並在細胞核中複製。我們首次顯示，缺氧還會影響持續細胞質RNA病毒感染的結果。作為模型，我們使用淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)，其能夠在不同細胞類型中持續存在而不會干擾這些細胞完整性，並其導致的感染大多不明顯。它因此被認為是無害的，儘管LCMV相關的流產和移植接受者的致死性LCMV感染警示它可能是有危險性的。LCMV複製物的MX病毒株在人HeLa細胞中以持續的模式複製，並在沒有細胞外感染病毒粒子存在的條件下以細胞_細胞的方式擴散。MX感染的HeLa細胞暴露於長期缺氧環境會導致病毒RNA轉錄增加，並通過HIF-1a依賴的機制提高病毒蛋白的水平。缺氧還會提高能夠通過無細胞的介質傳播LCMV感染的感染性病毒粒子的形成`。這種缺氧誘導的LCMV 「重新活化」可能造成對健康不利的後果，例如對於發育中的胎兒和接受來自無臨床症狀供體的移植物的人而言。
[0314]實施例11:重組LCMV-NP片段的克隆和表達
[0315]通過PCR使用質粒pBluescript-NP作為模板克隆了 LCMV (MX)-NPcDNA的三個重疊片段，圓括號中的數字顯示了相應於MX病毒株已公開的NP序列(GenBank登錄號Y16308, Reiserova et al.2001)的位置。
[0316]含有胺基酸1-205的片段I使用如下設計的引物進行擴增:NPMXF1S5, -CCGAATTCATGTCTCTGTCCAAGGAAGTCA-3; (46-67) (SEQ ID NO:79)和NPMXFIA5' -GGCTCGAGGTMAGCAGACCAAGGTCTGTG-3' (660-639)(SEQ ID NO:80);
[0317]含有胺基酸198-391的片段II使用如下引物進行擴增:NPMXF2S5, -GGGAATTCCTCACAGACCTTGGTCTGCTTT-3' (637-658)(SEQ ID N0:81)和NPMXF2A5' -CCCTCGAGCACTGGATCATTGAACCTACCC-3' (1218-1197)(SEQ ID NO:82);和
[0318]含有胺基酸384-558的片段III通過用如下引物擴增獲得:NPMXF3S5, -CCGAATTCGAGGGTAGGTTCAATGATCCAG-3; (1195-1226)(SEQ ID NO:83)和 NPMXF3A5' -CCTCGAGTTAGAGTGTCACAACATTTGGTC-3' (1722-1700) (SEQ ID N0:84)。所有引物均被設計成分別含有EcoRI和Xho I限制位點(下劃線)。PCR反應使用上面列出的引物和EXT DNA聚合酶(Finnzymes, Oy, Finland)進行。在最初的94°C 3min初始變性後,擴增程序設定如下:變性 940C 30s，退火 600C 40s，和延伸 72°C lmin20s,總共 35 個循環，最後 72°C 7min。PCR 產物在 1.2% 瓊脂糖凝膠上使用 Wizard? SV Gel&PCR 清理(clean-UP)系統(Promega, USA)進行純化，並亞克隆到用EcoRV線性化並用dT加尾用於T-A克隆的pBluescript SK(+)(Stratagene, USA)中，或 pG.EM?-T 載體(Promega, USA)中。接著，使用 EcoRI 和 XhoI限制酶將所有三個片段與穀胱甘肽S轉移酶對框地克隆到pGEX-4T-l (Amersham PharmaciaBiotech AB, Sweden)中。為了產生GST融合蛋白，將經驗證的質粒構建體(命名為pGEX_4T1-NPI, pGEX-4Tl-NPII, pGEX-4Tl_NPIII)轉化到大腸桿菌 BL21_CodonPlus (DE3)-RIPL (Stratagene, USA)感受態細胞中，並用 0.2mM IPTG(Sigma-Aldrich, USA, USA)誘導 3 小時。
[0319]實施例12:GST標誌物的融合蛋白的純化
[0320]大腸桿菌的誘導培養物通過離心沉澱，重懸浮在冰冷的裂解緩衝液STE(10mMNaCl, IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，溶於 Ix PBS), pH8 中，用終濃度為 0.4mg/ml 的溶菌酶(Serva, Germany)在冰上孵育15min。對細菌細胞進行超聲(2x30s)之前，向細胞懸液添加10%月桂醯基肌氨酸鈉(Sigma-Aldrich, USA, USA) STE溶液至終濃度為1.5%，以及IMDTT (Sigma-Aldrich, USA, USA)至終濃度為5mM。不溶的材料通過4°C 12, OOOg離心15min加以除去。向細菌裂解物添加合適體積的用STE, pH8平衡的穀胱甘肽Sepharose4B (AmershamPharmacia Biotech) 50%漿液，並在4°C通過溫和攪拌過夜孵育。第二天，用冰冷STE，pH8充分清洗結合在穀胱甘肽S印harose4B上的融合蛋白，並在室溫下用15mM溶於50mMTris-HCl, pH8.0的還原穀胱甘肽(Merck)將其洗脫。通過SDS-PAGE確定純化樣品中融合蛋白的產量，並與規定濃度的BSA進行目測比較。
[0321]實施例13 =NP-1gG ELISA-1
[0322]用稀釋於 0.05M碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液(pH9，6)中的純化蛋白GST-NP I, GST-NPI I, GST-NPI11 和 GST(50ng/ 孔)在 37°C 下過夜包被微孔板孔。用 10% 脫脂乳PBS溶液+0.1%吐溫20封閉後，用血清樣品(50ml等分)孵育經包被的孔，血清樣品用封閉溶液2倍稀釋，起始為1:20，室溫孵育I小時。平板用PBS-0，1%吐溫20清洗4次，並用1:35000稀釋於封閉溶液的過氧化物酶偶聯的山羊抗人IgG(Sigma)室溫孵育45分鐘。清洗後，向每個孔添加底物溶液(10ml Mc Ilweine緩衝液pH5, 5100mM Na2HPO4, 40mM檸檬酸，IOmg鄰苯二胺(Sigma), 10 μ I的30%Η202),在黑暗場合孵育5_10min。通過添加2MH2SO4終止反應，並用492nm吸光度測量光密度。用來自相應孔的OD減去陰性抗原包被孔的OD計算調整後的OD。
[0323]實施例14:通過陽性人血清對重組表達的GST-，NPI, GST-NPII,和GST-NPIII進行表位作圖
[0324]為了確定NP上被NP特異性血清抗體識別的表位，根據實施例所述的操作流程進行ELISA。使用15份通過免疫沉澱方法確認為陽性的血清樣品。
[0325]如圖16所示，抗NP血清抗體優先識別位於NP片段III (含有胺基酸384-558)上的表位，而少部分抗體還與位於片段II (胺基酸198-391)上的表位反應。
[0326]實施例15 =NP-1gG ELISA-2
[0327]核蛋白(NP)特異性血清Abs的檢測通過如下方法實施。96孔聚苯乙烯平板用濃度為6 μ g/ml稀釋在0，05M碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液(pH9，6)中的NP特異性單克隆抗體M87在4°C包被過夜。將平板用含0，1%吐溫20和10%牛奶(每孔200 μ I)的PBS溶液(PBS-T)封閉1.5h，之後用以1:300稀釋於封閉溶液中的細胞裂解物(用LCMV MX持續感染的HeLa細胞和未感染的HeLa)孵育lh。在一塊平行的平板上，將人血清樣品以1:20和1:60在封閉溶液中稀釋。將總共每孔50 μ I稀釋的血清樣品轉移到NP飽和的平板上，隨後孵育I小時。最後，平板用1:35000稀釋於封閉液中的HRP偶聯山羊抗人IgG (Fe-特異性)抗體(SIGMA)孵育45min。HRP通過OPD顏色反應加以檢測，通過添加50 μ 12Μ H2S04終止反應。光密度以492nm吸光度加以測量。所有步驟均在室溫下進行。每個步驟之間，平板用PBS-T清洗4次。通過用相應孔的OD減去陰性抗原包被孔的OD計算經調整的0D。
[0328]或者，抗原使用濃度為4 μ g/ml的純化重組LCMV NP。
[0329]為了發現合適的內部陽性和陰性對照，通過免疫沉澱並隨後用NP特異性單克隆抗體免疫印跡對人血清進行分析(見實施例7)。隨後，選擇一個血清作為陰性對照，選擇另一個作為陽性對照，用於隨後的測試。然後，將25個已經用免疫沉澱試驗證明是陰性的血清樣品在NP ELISA中進行分析，然後將獲得的經調整的OD值表達為內部陽性對照的百分比陽性(PP)，方法是用2次重複試驗的平均調整OD值除以內部陽性對照的4次重複試驗的調整OD值的中值，再乘以100。用這25個樣品獲得的平均PP值加上兩個標準差確定為ELISA的截止值，其用作陽性和陰性血清樣品之間的閾值。
[0330]使用這個方法，截止值被確定為4.2%，並用於隨後的計算。
[0331 ] 實施例16:通過NP-1gG ELISA-2檢測人樣品中的抗LCMV-NP抗體
[0332]從⑴發生過自發流產但未診斷出原因的婦女；(ii)有過足月妊娠的婦女；和
(iii)患有腎細胞癌(RCC)的癌症患者獲得血清樣品。在實施例15所述條件下測試人血清中的抗-LCMV抗體，確定PP值並 示於表3。
[0333]表3:在經歷過自發流產的人類女性受試者中檢測抗-LCMV NP抗體
[0334]
【權利要求】
1.一種用於評估受試者中的淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)感染狀態或活性的方法，該方法包括:選擇用於評估的受試者，其中該受試者曾經暴露於LCMV和/或具有LCMV活性增高的風險；從該受試者獲得樣品；使該樣品與至少一種用於檢測LCMV的組合物接觸；和確定所述至少一種用於檢測LCMV的組合物是否與來自該樣品的LCMV標誌物相締合，其中檢測到締合表明該受試者被LCMV感染和/或具有活性LCMV。
2.權利要求1的方法，其中確定包括向該受試者和/或與該受試者有關的醫療從業者報告該受試者被LCMV感染和/或具有活性LCMV。
3.權利要求1的方法，其中確定還包括檢測被LCMV感染和/或具有活性LCMV的受試者中的LCMV的水平和/或活性。
4.權利要求3的方法，進一步包括向該受試者和/或與該受試者有關的醫療從業者報告檢測到的LCMV水平和/或活性。
5.權利要求1的方法，其中具有LCMV活性增高風險的受試者具有與缺氧相關的狀況的風險。
6.權利要求5 的方法，其中該受試者是懷孕的、免疫受損的、移植接受者、具有癌症發生風險，或者患有癌症。
7.權利要求1的方法，其中所述用於檢測LCMV的組合物包括至少一種與一種或多種LCMV核酸特異性結合的引物。
8.權利要求7的方法，其中所述至少一種引物包含10個或更多個核酸，其中該10個或更多個核酸與SEQ ID NO: 1-51中任一個之內的靶區域具有至少80%的同一性，從而使所述引物與該靶區域特異性結合。
9.權利要求7或8中任一項的方法，其中該引物選自下組:SEQID NO:58, SEQ IDNO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:66, SEQ IDNO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72,和 SEQID N0:73。
10.權利要求9的方法，其中該引物與編碼LCMVNP的核酸結合。
11.權利要求10的方法，其中該引物包括與SEQID N0:58和SEQ ID N0:59具有至少80%同一性的核酸序列對，或者與SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67具有至少80%同一性的核酸序列對。
12.權利要求9的方法，其中該引物與編碼LCMVGP的核酸結合。
13.權利要求12的方法，其中該引物包括與SEQID NO:60和61具有至少80%同一性的核酸序列對，或者與SEQ ID NO:68和69具有至少80%同一性的核酸序列對。
14.權利要求9的方法，其中該引物與編碼LCMVZP的核酸結合。
15.權利要求14的方法，其中該引物包括與SEQID NO:62和63具有至少80%同一性的核酸序列對，或者與SEQ ID NO:72和73具有至少80%同一性的核酸序列對。
16.權利要求9的方法，其中該引物與編碼LCMVL的核酸結合。
17.權利要求16的方法，其中該引物包括與SEQID NO:70和71具有至少80%同一性的核酸序列對。
18.權利要求9的方法，其中該引物與編碼LCMVNP, LCMV GP, LCMV ZP和LCMV L中兩種或更多種的核酸結合。
19.權利要求1的方法,其中所述用於檢測LCMV的組合物包括至少一種分離的LCMV蛋白或其片段。
20.權利要求1的方法,其中所述用於檢測LCMV的組合物包括至少一種分離的單克隆抗體或抗體片段。
21.權利要求20的方法，其中所述抗體或片段包括由保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)的LMBP保藏號9217CB的雜交瘤MJ3產生的抗體。
22.權利要求20的方法，其中該抗體或片段包括由包括由保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)的LMBP保藏號9216CB的雜交瘤M166產生的抗體。
23.權利要求20的方法，其中該抗體或片段包括由保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)的LMBP保藏號9217CB的雜交瘤MJ3產生的抗體，和由保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)的LMBP保藏號9216CB的雜交瘤M166產生的抗體。
24.權利要求20的方法，其中該抗體或片段包括單克隆抗體M87的重鏈可變區的CDR3(SEQ ID NO:78)，其包含一個或多個保守胺基酸替換。
25.權利要求24的方法，其·中抗體或片段包括單克隆抗體M87的重鏈可變區的CDR2(SEQ ID NO:77)，其包含一個或多個保守胺基酸替換。
26.權利要求25的方法，其中抗體或片段包括單克隆抗體M87的重鏈可變區的CDR1(SEQ ID NO:76)，其包含一個或多個保守胺基酸替換。
27.權利要求20的方法，其中抗體或片段包括單克隆抗體M87的重鏈可變區的CDR3(SEQ ID NO:78)。
28.權利要求27的方法，其中抗體或片段包括單克隆抗體M87的重鏈可變區的CDR2(SEQ ID NO:77)。
29.權利要求28的方法，其中抗體或片段包括單克隆抗體M87的重鏈可變區的CDRl(SEQ ID NO:76)。
30.權利要求20的方法，其中該抗體或片段包括與SEQID NO: 74具有同一性的抗原結合肽，其中:胺基酸序列內對應於SEQ ID NO:74內的互補決定區的區域包括一個或多個保守胺基酸替換；胺基酸序列內對應於SEQ ID NO: 74內的框架區的區域與SEQ ID NO: 74的相應區域具有至少80%的同一性；且該抗原結合肽與LCMV NP結合。
31.權利要求30的方法，其中該抗原結合肽是抗體或抗體片段。
32.一種用於評估樣品中淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)感染狀態或活性的診斷試劑盒，其中該試劑盒包括:至少一種與一種或多種LCMV核酸特異性結合的引物；至少一種LCMV蛋白或其片段；至少一種分離的LCMV結合抗體或抗體片段；或上述的任意組合。
33.權利要求32的試劑盒，其中該試劑盒包括至少一種與一種或多種LCMV核酸特異性結合的引物。
34.權利要求33的試劑盒，其中所述至少一種引物包含具有10個或更多個核酸的至少一種核酸引物，其中所述10個或更多個核酸與SEQ ID NO: 1-51中任一個之內的靶區域具有至少80%的同一性，從而使所述引物與所述一個或多個靶區域特異性結合。
35.權利要求33的試劑盒，其中所述引物選自下組:SEQID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72,和 SEQ ID N0:73。
36.權利要求33的試劑盒，其中該引物與編碼LCMVNP的核酸結合。
37.權利要求33的試劑盒，其中該引物與編碼LCMVGP的核酸結合。
38.權利要求33的試劑盒，其中該引物與編碼LCMVZP的核酸結合。
39.權利要求33的試劑盒，其中該引物與編碼LCMVL的核酸結合。
40.權利要求33的試劑盒，其中該引物與編碼LCMVNP, LCMV GP，LCMV ZP和LCMV L中兩種或多種的核酸結合。
41.權利要求32的試劑盒，其中該試劑盒包括至少一種分離的LCMV結合抗體或抗體片段。
42.權利要求41的試劑盒，其中所述抗體或片段包括由保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)的LMBP保藏號9217CB的雜交瘤MJ3產生的單克隆抗體。
43.權利要求41的試劑盒，其中該抗體或片段包括由包括由保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)的LMBP保藏號9216CB的雜交瘤M166產生的單克隆抗體。
44.權利要求41的試劑盒，其中該抗體或片段包括由保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)的LMBP保藏號9217CB的雜交瘤MJ3產生的單克隆抗體，和由保藏在位於比利時Ghent大學的比利時微生物保藏中心(BCCM)的LMBP保藏號9216CB的雜交瘤M166產生的單克隆抗體。
45.權利要求41的試劑盒，其中該抗體或片段包括單克隆抗體M87的重鏈可變區的CDR3(SEQ ID NO:78)，其包含一個或多個保守胺基酸替換。
46.權利要求45的試劑盒，其中該抗體或片段包括單克隆抗體M87的重鏈可變區的CDR2(SEQ ID NO:77)，其包含一個或多個保守胺基酸替換。
47.權利要求46的試劑盒，其中該抗體或片段包括單克隆抗體M87的重鏈可變區的CDR1(SEQ ID NO:76)，其包含一個或多個保守胺基酸替換。
48.權利要求41的試劑盒，其中該抗體或片段包括單克隆抗體M87的重鏈可變區的CDR3(SEQ ID NO:78)。
49.權利要求48的試劑盒，其中該抗體或片段包括單克隆抗體M87的重鏈可變區的CDR2(SEQ ID NO:77)。
50.權利要求49的 試劑盒，其中該抗體或片段包括單克隆抗體M87的重鏈可變區的CDRl(SEQ ID NO:76)。
51.權利要求41的試劑盒，其中該抗體或片段包括與SEQID NO: 74具有同一性的抗原結合肽，其中:胺基酸序列內對應於SEQ ID NO:74內的互補決定區的區域包含一個或多個保守胺基酸替換；胺基酸序列內對應於SEQ ID NO:74內的框架區的區域與SEQ ID N0:74的相應區域具有至少80%的同一性；且該抗原結合肽與LCMV NP結合。
52.權利要求51的試劑盒，其中該抗原結合肽是抗體或抗體片段。
【文檔編號】C12Q1/70GK103597098SQ201280012143
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年1月6日 優先權日:2011年1月7日
【發明者】J.託馬斯科瓦, J.科帕塞克, J.帕斯託雷克, S.帕斯託雷科瓦 申請人:斯洛伐克生物科學公司