一種共焦的光聲螢光同時成像方法與裝置的製作方法

2023-12-10 02:06:36

專利名稱：一種共焦的光聲螢光同時成像方法與裝置的製作方法
技術領域：
本發明屬於無損測試測量技術領域，特別涉及一種共焦的光聲螢光同時成像方法
與裝置。
背景技術：
光聲成像技術利用短脈衝雷射激發產生光聲信號，可重建出組織的光吸收分布圖像，它結合了純光學成像的高對比度和純聲學成像的高解析度特性。光聲成像技術不僅能夠有效的刻畫生物組織結構，還能夠精確實現無損功能成像，為研究生物組織的形態結構，生理、病理特徵，代謝功能等提供了全新手段。而螢光共焦顯微鏡由於其高解析度，高靈敏度以及獨特的軸向層析成像能力幾乎適用於細胞生物學、細胞生理學、神經生物學和神經生理學等所有涉及細胞研究的醫學和研究領域。它不僅可以通過對獲得或固定的細胞以及組合i幀進行無損傷的「光學切片」獲取精細的細胞骨架、染色體、細胞器和細胞膜系統的三維圖像，並同時進行單標記或雙標記細胞以及組織標本的螢光穩定性定量分析，還可以用於活細胞的生理信號諸如電位等。將以上兩種成像技術結合在一起，同時對組織進行成像，實現組織的光聲和螢光互補成像，可以獲取組織或細胞的更多的信息。

發明內容
為解決上述現有技術的不足，本發明的首要目的在於提供一種共焦的光聲螢光同時成像方法。本發明的另一目的在於提供採用上述方法進行成像的裝置。本發明的目的通過以下技術方案來實現一種共焦的光聲螢光同時成像方法，包括以下操作步驟(I)光聲螢光激發光源發出的脈衝雷射經過顯微鏡物鏡聚焦後的點光斑落在樣品上，同時激發產生光聲信號和螢光信號；(2)光聲信號穿過超聲耦合液後被碗狀中空聚焦超聲探測器接收，螢光信號經過分光鏡和濾光片濾光後被光電倍增管接收，兩路信號被雙通道並行採集卡同時採集，再將數據傳輸並儲存到帶有採集控制軟體和圖像重建軟體的計算機中；(3)樣品與盛放超聲耦合液的超聲耦合杯一起放置於二維電動平臺上，由裝有電機控制軟體的計算機控制其移動，每採集完一次光聲信號和螢光信號，電動平臺移動一步，以對樣品進行逐點掃描，用於重建二維圖像；(4)採集完全部的信號後，通過最大值投影的算法重建出樣品的光聲和螢光圖像。所述步驟(I)中的光聲螢光激發光源為短脈衝雷射器，輸出激發波長可為400 2500nm，脈寬範圍為5ns 50ns，重複頻率為20 200kHz。所述步驟(2)中的超聲耦合液為水。所述步驟⑵中的碗狀中空聚焦超聲探測器的主頻為I 100MHz。
所述步驟(3)中的光聲螢光激發光源發生器輸出的脈衝雷射經顯微鏡物鏡聚焦後形成的點光斑直徑範圍為0. 3 2微米,該光斑由於衍射的限制,一般最小達到0. 2iim。所述碗狀中空聚焦超聲探測器的聲焦點與脈衝雷射經顯微聚焦後的點光斑重合，即碗狀中空聚焦超聲探測器與顯微鏡物鏡共焦點。
一種光聲螢光同時成像的裝置，是根據上述成像方法進行成像的，該裝置包括光聲螢光激發光源發生器、碗狀中空聚焦超聲探測器、光電倍增管、反射鏡，分光鏡，顯微鏡物鏡、超聲耦合杯、樣品臺、二維電動平臺、避光筒、濾光片、雙通道並行採集卡和帶有採集控制軟體、圖像重建軟體和電機控制軟體的計算機；所述顯微鏡物鏡固定於碗狀中空聚焦超聲探測器內部，並保證顯微鏡物鏡與碗狀中空聚焦超聲探測器共焦點；所述盛放超聲耦合液的超聲耦合杯位於樣品正上方，碗狀中空聚焦超聲探測器和光電倍增管置於超聲耦合杯的正上方，其中光電倍增管在碗狀中空聚焦超聲探測器的上方；所述光聲螢光激發光源發生器、碗狀中空聚焦超聲探測器、光電倍增管、二維電動平臺、雙通道並行採集卡與帶有採集控制軟體、圖像重建軟體和電機控制軟體的計算機依次電氣相連。所述顯微鏡物鏡的放大倍數為I倍，2倍，4倍，10倍以及20倍，成像質量只與放大倍數有關，倍數越高則質量越好。所述雙通道並行採集卡的型號可以為PCI2400(NI公司生產)，但其他型號的也可用；所述採集控制軟體和圖像重建軟體均為Labview軟體。所述二維電動平臺由轉動電機和移動平臺構成，通過電機旋轉帶動移動平臺前後移動，二維電動平臺由兩個這種電動平臺組成，可以實現前後左右四個方向移動；所述電機控制軟體為Labview軟體。所述最大值投影的算法是通過Matlab軟體自行編寫的。所述光聲螢光同時成像裝置的光聲和螢光成像解析度可以達到0. 3 2微米。所述解析度由顯微鏡物鏡的點光斑的直徑決定，計算公式為0. 51 A /NA，其中\為脈衝雷射的波長，NA為顯微鏡物鏡的數值孔徑。該裝置操作簡單，檢測精度高，能夠同時實現光聲螢光雙成像。本發明的作用原理是光聲激發光源產生脈衝雷射(波長、脈寬和重複頻率可根據需要選擇)，經過顯微鏡物鏡聚焦之後照射樣品，樣品所產生的光聲信號和螢光信號被碗狀中空聚焦超聲探測器和光電倍增管接收；二者接收的信號被雙通道信號採集卡同時採集，傳輸到帶有採集控制軟體和計算軟體的計算機做後處理；本發明採用信號激發源與信號接收器共焦點，並且光聲信號和螢光信號同時採集，適用於待測樣品的光聲螢光同時雙成像。與現有技術相比，本發明具有如下優點(I)本發明在同一激發光源作用下同時激發出光聲和突光信號,二者被碗狀中空聚焦超聲探測器和光電倍增管同時接收，通過雙通道並行採集系統同時採集，實現了光聲和螢光的同時雙成像。比起單一的模式，該裝置能夠同時重建光聲圖像和螢光圖像，實現雙成像，給出待測樣品的雙參數。(2)本發明的碗狀中空聚焦探測器、光電倍增管與脈衝雷射通過顯微鏡物鏡聚焦後所形成的點光斑共焦點，能夠實現光聲螢光的共焦成像，其解析度比旋轉掃描的光聲成像方式解析度高，旋轉掃描的解析度約為100微米。


圖I為實施例I的光聲螢光同時成像裝置的結構示意圖，其中I為帶有採集和控制軟體的計算機，2為二維電動平臺，3為光聲螢光激發光源發生器，4為反射鏡，5為放置樣品的樣品臺，6為超聲耦合杯，7為碗狀中空聚焦超聲探測器，8為顯微鏡物鏡，9為避光筒，10為分光鏡，11為濾光片 ，12為光電倍增管。圖2為實施例2得到的光聲圖像和螢光圖像，其中，(a)為頭髮絲的光聲圖像；(b)為羅丹明的螢光圖像。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。實施例I :光聲螢光同時成像裝置的結構示意圖如圖I所示；該裝置包括帶有採集和控制軟體的計算機1，二維電動平臺2，光聲螢光激發光源發生器3，反射鏡4，放置樣品的樣品臺5，超聲耦合杯6，碗狀中空聚焦超聲探測器7，顯微鏡物鏡8,避光筒9,分光鏡10,濾光片11,光電倍增管12 ;其中,光聲突光激發光源發生器3、碗狀中空聚焦超聲探測器7、光電倍增管12、帶有採集組件和控制軟體的計算機I依次電氣相連；碗狀中空聚焦超聲探測器7和顯微鏡物鏡8共焦點。顯微鏡物鏡8裝在碗狀中空聚焦超聲探測器7內部；超聲耦合杯6位於放置樣品的樣品臺5上方，兩者為一個整體，固定在二維電動平臺2上，二維電動平臺2帶動放置樣品的樣品臺和超聲耦合杯一起移動並掃描；超聲耦合杯6中裝入超聲耦合液水用於光聲信號傳播；所述光聲突光激發光源發生器3發出的脈衝雷射由反射鏡4和分光鏡10反射,然後經過顯微鏡物鏡8聚焦後照射在樣品上，即脈衝雷射經過聚焦後形成的點光斑落在樣品上，產生的光聲信號先經過超聲耦合液以後被碗狀中空聚焦超聲探測器7和光電倍增管12接收，產生的螢光信號經過分光鏡10和濾光片11後被光電倍增管12接收，接收的螢光信號和光聲信號同時被帶有採集控制軟體和圖像重建軟體Labview的計算機I採集。二維電動平臺2由帶有電機控制軟體Labview的計算機控制移動，每採集完一次光聲信號和螢光信號，電動平臺移動一步，採集完全部的信號後，通過最大值投影的算法(為通過Matlab軟體自行編寫)重建出樣品的光聲圖像和螢光圖像。實施例2 :應用實施例I所述裝置實現光聲螢光同時成像的方法如下(I)將滴有羅丹明(該物質為螢光染料，用於螢光成像)，並且埋有頭髮絲的瓊脂塊放在樣品臺上；(2)光聲突光激發光源發生器米用Nd:YAG泵浦的雷射器,輸出雷射波長為532nm,脈寬為10ns，重複頻率是20Hz ;上述雷射器產生的脈衝雷射經聚焦物鏡聚焦後的點光斑落在樣品上，產生光聲信號和突光信號；(3)頭髮絲被脈衝雷射照射後產生光聲信號,光聲信號穿過超聲稱合液水後被碗狀中空聚焦超聲探測器(主頻為15MHz)接收；羅丹明被脈衝雷射照射後產生螢光信號，螢光信號經過分光鏡和濾光片濾光後被光電倍增管接收；兩路信號被雙通道並行採集卡同時採集，再將數據傳輸並儲存到帶有採集控制軟體和圖像重建軟體的計算機中；(5)對採集的數據進行處理，通過最大值投影的算法重建出樣品的光聲和螢光圖像，得到如圖2所示的圖像，其中，(a)為頭髮絲的光聲圖像；(b)為羅丹明的螢光圖像。可見，通過本發明的裝置可以同時獲得樣品的光聲圖像和螢光圖像，即可以對有光學吸收但不發出螢光的物質進行光聲成像，也可以對有光學吸收又會發出螢光的物質進 行螢光成像，最終通過一次掃描對樣品同時進行光聲螢光雙成像。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種共焦的光聲螢光同時成像方法，其特徵在於包括以下操作步驟 (1)光聲螢光激發光源發出的脈衝雷射經過顯微鏡物鏡聚焦後的點光斑落在樣品上，同時激發產生光聲信號和突光信號； (2)光聲信號穿過超聲耦合液後被碗狀中空聚焦超聲探測器接收，螢光信號經過分光鏡和濾光片濾光後被光電倍增管接收，兩路信號被雙通道並行採集卡同時採集，再將數據傳輸並儲存到帶有採集控制軟體和圖像重建軟體的計算機中； (3)樣品與盛放超聲耦合液的超聲耦合杯一起放置於二維電動平臺上，由裝有電機控制軟體的計算機控制其移動，每採集完一次光聲信號和螢光信號，電動平臺移動一步； (4)採集完全部的信號後，通過最大值投影的算法重建出樣品的光聲圖像和螢光圖像。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述步驟(I)中的光聲螢光激發光源為短脈衝雷射器，輸出激發波長可為400 2500nm，脈寬範圍為5ns 50ns，重複頻率為20 200kHz ο
3.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述步驟(2)中的超聲耦合液為水。
4.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述步驟(2)中的碗狀中空聚焦超聲探測器的主頻為I IOOMHz ;所述碗狀中空聚焦超聲探測器的聲焦點與脈衝雷射經過顯微鏡物鏡聚焦後形成的點光斑重合，即碗狀中空聚焦超聲探測器與顯微鏡物鏡共焦點；所述點光斑與超聲探測器和光電倍增管均在樣品的同一側。
5.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述步驟(3)中的光聲螢光激發光源發出的脈衝雷射經顯微鏡物鏡聚焦後形成的點光斑直徑範圍為O. 3 2微米。
6.一種根據權利要求I所述方法進行成像的裝置，其特徵在於該裝置包括光聲螢光激發光源發生器、碗狀中空聚焦超聲探測器、光電倍增管、反射鏡、分光鏡、顯微鏡物鏡、超聲耦合杯、樣品臺、二維電動平臺、避光筒、濾光片、雙通道並行採集卡和帶有採集控制軟體、圖像重建軟體和電機控制軟體的計算機；所述顯微鏡物鏡固定於碗狀中空聚焦超聲探測器內部，並使顯微鏡物鏡與碗狀中空聚焦超聲探測器共焦點； 所述盛放超聲耦合液的超聲耦合杯位於樣品正上方，碗狀中空聚焦超聲探測器和光電倍增管置於超聲耦合杯的正上方，其中光電倍增管在碗狀中空聚焦超聲探測器的上方； 所述光聲螢光激發光源、碗狀中空聚焦超聲探測器、光電倍增管、二維電動平臺、雙通道並行採集卡與帶有採集控制軟體、圖像重建軟體和電機控制軟體的計算機依次電氣相連。
7.根據權利要求6所述的裝置，其特徵在於所述採集控制軟體和圖像重建軟體均為Labview軟體；所述最大值投影的算法是通過Matlab軟體自行編寫的。
8.根據權利要求6所述的裝置，其特徵在於所述二維電動平臺由轉動電機和移動平臺構成，通過電機旋轉帶動移動平臺前後移動，二維電動平臺由兩個這種電動平臺組成，實現前後左右四個方向移動；所述電機控制軟體為Labview軟體。
9.根據權利要求6所述的裝置，其特徵在於通過所述裝置得到的光聲圖和螢光圖像的解析度達到O. 3 2微米。
全文摘要
本發明屬於無損測試測量技術，公開一種共焦的光聲螢光同時成像方法與裝置。該方法包括光聲螢光激發光源發出的雷射經過顯微鏡物鏡聚焦後照射在樣品上，激發出光聲信號和螢光信號，分別被碗狀中空聚焦超聲探測器和光電倍增管接收，樣品由電動平臺帶動掃描後，通過最大值投影算法重建出光聲圖像和螢光圖像。該裝置包括光聲螢光激發光源發生器、碗狀中空聚焦超聲探測器、光電倍增管、反射鏡、分光鏡、顯微鏡物鏡、超聲耦合杯、樣品臺、二維電動平臺、避光筒、濾光片、雙通道並行採集卡和帶有採集控制軟體和電機控制軟體的計算機。本發明的光聲螢光同時成像裝置能夠實現高對比度以及高解析度的光聲及螢光成像，解析度可以達到0.3～2微米。
文檔編號G01N21/17GK102621115SQ201210046300
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月27日 優先權日2012年2月27日
發明者楊思華, 袁毅, 邢達 申請人:華南師範大學