提高貯存馬鈴薯質量的方法

2023-11-07 03:17:32 2

專利名稱：：提高貯存馬鈴薯質量的方法馬鈴薯的長期貯存特性代表著塊莖質量的一個主要因素。保持馬鈴薯質量的關鍵是休眠期(收穫後和發芽前的這段時間)。商業上，馬鈴薯在加工前要放很長時間(長至10個月或更長)，溫度一般在2-10℃。與在7～12℃下貯存相比，冷卻貯存(2-6℃)具有最好的長期環境降低呼吸、減少水份損失和微生物侵染，需要的化學發芽抑制劑也較少(Burton，1989)。可見，低溫產生冷誘導的甜化作用，所產生的高糖值導致在炸制產品中將出現不能接受的褐色(Coffin等人，1987，Weaver等人，1978)。積累的糖主要是葡萄糖、果糖和蔗糖，在各種烹煮包括炸制過程中，加熱時，主要是還原糖(主要是葡萄糖和果糖)與自由氨基通過美拉德反應(Maillardreactin)形成褐色素(Burton，1989，Sballenberger等人，1959)。另外，蔗糖在炸制中由於對焦糖化作用或焦化反應敏感而產生黑色素。還原糖量超過新鮮重量的0.2％就足以形成褐色素。從而妨礙了某些型式的加工。如果糖量不是明顯高於限量0.2％，馬鈴薯加工者可通過昂貴且費時的漂燙方法降低糖量。在較高的溫度(18℃)下，可以對馬鈴薯進行重調節降低糖含量，但是經常在此溫度下糖量還沒有降到足夠低就開始發芽，所以要利用化學發芽抑制劑(Ryall和Lipton，1979，Hardenburg等人，1986)。然而，重調節需要增加貯存設備，這影響到產品的最後價格。此外，已有表明長期貯存後的重調節無效(Coffin等人，1987)。過多使用化學品對環境和身體感覺帶來不利的影響，以及目前的發芽抑制劑不久可能被禁用，因此，現在需要具有以下特點的馬鈴薯品種在不用化學品的情況下經得起長期冷貯存，沒有還原糖的積累，較大程度地保留澱粉量。貯存較長時間後，發芽的馬鈴薯塊莖帶來以下問題大量的發芽降低了市場價值，塊莖中生物鹼的量可能提高。通過基因工程的方法已經獲得澱粉量明顯提高的馬鈴薯塊莖。參見91年6月7日申請的WO91/19806(Kishore)和U.S.S.N.07/709,663，所述專利申請併入本文作為參考文獻。在這些塊莖中表達了一種基因，這種基因編碼ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADPGPP)，此酶催化澱粉和糖原的生物合成中的一個關鍵步驟。優選的基因來自E.coli，所得的酶不好調節，這是高活性的變異體。以塊莖特異性方式如由I類貯存蛋白(patatin)啟動子表達這種基因的突變體glgC16時，澱粉量比收穫時非轉基因對照塊莖的澱粉量高。在作物細胞中，碳水化合物代謝是一個複雜的過程。在冷貯存中，人為幹預許多不同的反應可能影響還原糖的積累，例如，糖類可以重新合成澱粉，由此影響游離糖發生還原反應。其它的方法是通過降低糖含量也能提高馬鈴薯的冷貯存性能，包括抑制澱粉水解，通過糖原酵解去除糖，或把糖轉變成不參與美拉德反應的其它形式。這些方法的難點是要確定達到希望結果的活性，獲得低溫性能，還要保留馬鈴薯種植者，加工者和消費者都滿意的產品質量。有人提出磷酸果糖激酶(PFK)在冷誘導甜化過程中起重要的作用(Kruger和Hammond，1988，apRees等人，1988，Dixon等人，1981，Claassen等人，1991)。apRees等人(1988)指出，冷處理對碳水化合物代謝中不同途徑的影響不平衡，因為PFK的冷不穩定性使糖原酵解急劇降低。PFK活性的降低提高了蔗糖產生中磷酸己糖的獲得量。另外，支持這一觀點的理由還來自對含有冷穩定PFK的馬鈴薯新繁殖克隆的觀察，在冷卻情況下沒有明顯糖量的積累。最近，歐洲專利申請0438904披露在貯存中通過去除糖原酵解和進一步代謝中的己糖，提高PFK活性降低了糖的積累。來自E.coli的PFK酶在馬鈴薯塊莖中表達，報告聲稱提高了PFK活性，降低了收穫時受試塊莖中的蔗糖含量。但是，已經表明在低溫下焦磷酸果糖6-磷酸磷酸轉移酶(PFP)保持活性(Claassen等人，1991)。PFP活性正如PFK一樣為糖原酵解提供了果糖6-磷酸，因為這兩個酶催化相同的反應。因此，這種方法在提高馬鈴薯冷貯存質量方面的有效性還令人懷疑。此外，去除糖原酵解和進一步代謝中的糖不是提高馬鈴薯塊莖貯存性能的優選方法，因為通過呼吸作用損失了有效乾物質的含量。糖重新合成澱粉或減慢澱粉的破壞是優選的方法，因為保留了乾物質。本發明的一個目的是提供一種降低馬鈴薯塊莖中的糖量和提高貯存馬鈴薯質量的方法。本發明的另一個目的是提高經低溫貯存後改善了再調節速度和程度的馬鈴薯。本發明還有一個目的是提供在環境溫度或降低的溫度下延長貯存馬鈴薯的體眠期的方法。發明概述本發明提供一種提高低溫下貯存馬鈴薯質量的方法，包括在貯存期間在降低的溫度下提高馬鈴薯塊莖中的ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADPGPP)的活性。本發明還提供一種方法即在冷貯存過程中通過提高ADPGPP酶活性來降低貯存在降低溫度下的馬鈴薯塊莖中的糖量。還提供了一種延長貯存馬鈴薯的休眠期的方法，包括提高貯存期間所述ADPGPP酶活性。本方法優選通過以下步驟完成(a)將重組的雙鏈DNA分子插入到馬鈴薯作物細胞的基因組，所述雙鏈DNA分子包括(i)一個作用於作物的啟動子，其在靶作物組織中引導產生一個RNA序列，(ii)引導產生RNA序列的一個結構DNA序列，此RNA序列編碼包括氨基端質體傳輸肽和ADP葡萄糖焦磷酸化酶的融合多肽，(iii)一個作用於作物細胞的3′非轉譯DNA序列，引導轉錄終止和聚腺苷酸化的核苷酸加到RNA序列的3′端；(b)獲得轉化的作物細胞；和(c)由轉化過的作物細胞再生經遺傳轉化成具有改善冷貯存性能的馬鈴薯作物。本發明提供了新的重組體DNA分子、作物細胞和再生的馬鈴薯作物，其中(a)(i)的啟動子是冷誘導的啟動子，例如來自馬鈴薯或擬南芥屬(Arabidopsis)。這些再生的馬鈴薯作物用於本發明的所有方法中。優選的ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADPGPP)來自E.coli，稱作glgC，其基因序列以下表示為SEQIDNO1，其胺基酸序列表示為SEQIDNO2。更優選的ADPGPP酶是突變體ADPGPP，即glgC16，其基因序列以下表示為SEQIDNO3，其胺基酸序列以下表示為SEQIDNO4。在缺少激活劑果糖1，6-二磷酸(FBP)時發現此突變體對底物有較高的親和性，降低FBP濃度能達到1/2最大量的活性。本發明所用的術語「提高貯存馬鈴薯質量」，或其變化說法，是指提供這樣的馬鈴薯貯存後糖量降低、極少或不損失澱粉、降低發芽的發生率和/或加強再調節的速度或程度。本發明所用的術語「冷貯存」或「在降低溫度下貯存」，或它們的變化說法是指保持在小於或等於15℃的溫度下，這可以通過致冷或環境溫度達到。本發明所用的術語「冷誘導啟動子」是指這樣一個DNA鹼基序列在溫度等於或小於15℃時用一條DNA鏈作為模板啟動mRNA的轉錄產生相應互補的一條RNA鏈。本文所用的術語「延長休眠期」或其變化的說法是指延緩呼吸的啟動和塊莖發芽。本文所用的術語「glgC16馬鈴薯」、「glgC16塊莖」、「glgC16品系」或它們的變化說法是指這樣的馬鈴薯品系或其產生的塊莖它們是用下述的一個質體終端傳輸肽的融合體優選CTP轉化了的。附圖簡要說明圖1表示作物轉化載體pMON17316的質粒圖譜。圖2表示作物轉化載體pMON17279的質粒圖譜。本發明的詳細說明澱粉磷酸化酶和澱粉分解酶決定著冷貯存期間澱粉的降解，它們作用的結果是由澱粉形成1-磷酸葡萄糖和/或葡萄糖。葡萄糖可轉化成1-磷酸葡萄糖，並作為ADPGPP酶的一種底物，因而也是在表達這一酶的塊莖中生物合成澱粉的底物。利用轉化酶或蔗糖合成酶從蔗糖的降解產物也可以形成1-磷酸葡萄糖。由於轉化酶的作用，在貯存期間主要積累還原糖而不是蔗糖(Pressey，1966)。由活性轉化酶釋放的葡萄糖和果糖也可以作為生物合成澱粉底物的前體。ADPGPP的表達是衡量冷誘導甜化作用的有效方法。假設在冷貯存期間維持澱粉的生物合成，就會對己糖量有連續的要求，這樣，糖的積累量減少，因此塊莖就適合於加工處理。但是，其它機制也影響ADPGPP的作用。另外，也可以通過保持低糖量以及延緩呼吸的啟動和發芽來完成貯存在任何溫度下的馬鈴薯休眠期的延長。為實施上述方法，在馬鈴薯作物的基因組中摻入一個表達ADPGPP的基因。這個基因可以和調節馬鈴薯中澱粉和/或糖代謝/分解代謝的其它基因結合(有意義或反義方向)，例如磷酸果糖激酶(EPO438904)、α-和β-澱粉酶、蔗糖磷酸合成酶、己糖激酶、澱粉磷酸化酶、脫支酶或葡糖磷酸變位酶。這些其它的基因可以來自作物、微生物或動物。另一方面，誘變馬鈴薯克隆可以使貯存塊莖中的ADPGPP量提高，由此提高ADPGPP酶活性水平。選擇這種塊莖的基礎是顯示比活性增加、Vmax提高、負效應物(Pi)的抑制作用降低或為達到最大活性而對激活劑(3-PGA)產生的依賴性降低。表達以雙鏈DNA形式存在的作物基因包括，藉助RNA聚合酶從一條DNA鏈轉錄信息RNA(mRNA)，然後在核中進行mRNA初級轉錄物的後續加工。這個加工過程涉及3′端非轉譯區域，聚腺苷酸化的核苷酸由此加到RNA的3′端。DNA到mRNA的轉錄由常被稱作「啟動子」的DNA區域調節。該啟動子區含有一段鹼基序列，其發出信號使RNA聚合酶與所說DNA相聯繫，並啟動用一條DNA鏈作為模板的mRNA轉錄，得到一條相應互補的RNA鏈。文獻中已經記載了許多在作物細胞中有活性的啟動子。這些啟動子包括胭脂鹼合酶(NOS)和章魚鹼合酶(OCS)啟動子[由根癌土壤桿菌腫瘤誘導性質粒攜帶]，花椰菜花葉病毒啟動子例如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S和玄參花葉病毒35S-啟動子，來自小亞基的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO，大量的作物多肽)的光誘導性啟動子和葉綠素a/b結合蛋白質基因啟動子等。所有這些啟動子已用來產生在作物中表達的各種DNA構建體，例如參見PCT公開WO84/02913。用於下面實施例1和2中的I類貯存蛋白啟動子已表現出高活性和塊莖特異性(Bevan等人，1986；Jefferson等人，1990)。已知具有塊莖特異性或增強表達的許多其它基因，包括馬鈴薯塊莖ADPGPP基因、大或小亞基(Muller等人，1990)、蔗糖合酶(Salanoubat和Belliard，1987，1989)、主要塊莖蛋白質包括22kd蛋白質複合體和蛋白酶抑制劑(Hannapel，1990)顆粒結合的澱粉合酶基因(GBSS)(Rohde等人，1990)和其它I類和II類貯存蛋白(RochaSosa等人，1989；Mignery等人，1988)。能考慮用於本發明的其它啟動子包括那些在馬鈴薯塊莖中顯示增強或特異表達的啟動子，常和表達澱粉生物合成或修飾酶基因相關的啟動子，或在馬鈴薯塊莖中顯示不同表達模式的啟動子，它們具有例如在皮層或髓或表皮增強的表達，例如或是在塊莖發育過程的不同時間表達。這些啟動子的例子包括以下酶基因的啟動子粒結合的和其它澱粉合酶、分支酶(Kossmann等人，1991；Blennow，A.和Joharsson，G.，1991；WO92/14827；WO92/11375)；歧化酶(Takeha等人，1993)、脫支酶、澱粉酶、澱粉磷酸化酶(Nakano等人，1989；Mori等人，1991)、果膠酯酶(Ebbelaar等人，1993)，和40kD糖蛋白；泛激素，天冬氨酸蛋白酶抑制劑(Sukerli等人，1990)，羧肽酶抑制劑，塊莖多酚氧化酶(Shahar等人，1992；GenBankAccessionNumbersM95196和M95197)，推斷的胰蛋白酶抑制劑和其它塊莖cDNA(Stiekema等人，1988)和β-澱粉酶和sporamins(來自Ipomoeabatatas；Yoshida等人，1992；Ohta等人，1991)。由各種馬鈴薯啟動子表達細菌ADPGPP的方法已由Kishore公開在PCT申請WO91/19806中，結果提高了馬鈴薯塊莖中的澱粉含量。本發明不需要以澱粉含量高的塊莖來達到在冷貯存期間降低還原糖積累的目的。在馬鈴薯中glgC16基因可以由一個冷誘導性啟動子表達，因此glgC16酶僅存在於貯存條件下。這種酶的存在保持貯存期間澱粉的生物合成，從而防止糖積累。有很多包括作物啟動子的冷誘導性啟動子例子(Yamaguchi-Shinozaki等人，1993；Qoronfleh等人，1992；Miner等人，1992；Houde等人，1992；White等人，1992；Huang等人，1987；Murata等人，1992；Gilmour等人，1992；Hajela等人，1990；和Kurkela等人，1990)。分離馬鈴薯塊莖中的冷誘導性蛋白質已被證實(vanBerkel等人，1991；vanBerkel等人，1994)。引發冷誘導性表達這些蛋白質的啟動子能用現有技術中的方法分離。一種方法是由冷刺激的塊莖產生cDNA文庫，然後通過與非冷刺激的文庫的不同雜交反應來鑑定冷特異的克隆。利用扣除文庫可以更有效地運用這種方法，其中在構建過程從文庫中去除以非冷特異性方式表達的克隆。對從這些調節的轉錄物衍生的cDNA核苷酸序列進行檢測這也將促使相應的啟動子區域分離。作為大量馬鈴薯塊莖冷調節的轉錄物，這些cDNA序列是已知的(vanBerkel等人，1994)，然後用鑑定為冷特異性的cDNA探針從基因組克隆鑑定啟動子片段。這些冷調節的啟動子已被鑑定並測序(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，1994，和Baker，1994)。啟動子片段可用來指導以冷調節方式表達E.coliglgC16基因。幾種其它ADPGPP酶中的一種可以由這種啟動子表達，以影響冷貯存馬鈴薯塊莖的糖濃度，由此提高塊莖質量。利用雜合啟動子或不同啟動子調節元件的融合體也能提高冷調節啟動子的表達水平，或對所需要作物器官的表達更具特異性。現在已經描述過冷調節的基因，其中的表達優先在不同的組織中(Zhu等人，1993)或其中的基因經冷調節比經其它刺激作用調節更具有特異性(Wilhelm和Thomashow，1993；Nordin等人，1993)。另外，長度從9個鹼基對到幾百個鹼基對的特異限定的序列表現出控制啟動子對不同冷作用和其它刺激作用如脫落酸水平和乾旱刺激的反應性(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，1994)。優先在塊莖中表達的啟動子是已知的，這一優先表達所必要的這些啟動子的區域也已確定(Jefferson等人，1990；Liu等人，1990)。這些技術資料使得能在來自啟動子的小的冷反應元件如來自coF78、cor15a或cor15b的元件和貯存蛋白啟動子間構建融合體。融合發生在貯存蛋白啟動子的-500～-2000bp區域。當今的分子遺傳技術包括聚合酶鏈反應和定位誘變和便利地合成寡核苷酸，這些技術使上述融合成為可能。與ADPGPP基因一起使用氨基端質體傳輸肽需把酶傳輸到發生澱粉合成反應的質體上。另外，可以省略這個傳輸肽，而將所述基因插入到存在於質體中的DNA。用Svab等人(1990)描述的方法可完成葉綠體的轉化。經誘變製備改變的ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因本領域的技術人員將認識到，在不是絕對需要時，利用ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因可以得到增強的效果，在保持足夠的催化活性情況下，這種基因受到降低的變構調節作用(「去調節的」)且較優選不受顯著水平的變構調節作用(「不調節的」)。在E.coli或其它合適的宿主中可對細菌或作物ADP葡萄糖焦磷酸化酶的結構編碼序列進行誘變，再對提高了糖原產量，如對所述的E.coli的glgC16基因進行篩選。應意識到，利用編碼ADP葡萄糖焦磷酸化酶的基因無需進行酶(基因)修飾，該ADP葡萄糖焦磷酸化酶僅接受以不顯著抑制催化活性的水平存在於被選擇作物中調節劑(激活劑/抑制劑)的作用。然後，這些「不調節的」或「去調節的」ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因插入本文所述的作物中，得到澱粉含量提高的轉基因作物。例如，任何ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因能克隆到E.coliB菌株AC7OR1-504(Leung，1986)中。這個菌株有缺損的ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因，對於其它糖原生物合成酶去阻遏5-7倍。ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因/cDNA可以放在質粒上，位於E.coliglgC啟動子或任何其它細菌啟動子之後。然後，這個構建體進行定點或隨機誘變。誘變後，將這些細胞塗布於含1％葡萄糖的富集培養基上。培養集落後，用碘溶液(0.2w/v％I2、0.4w/v％KI溶於水，CreuzetSigal，1972)浸沒平板。與含有非突變E.coli的相似平板比較，藉助更暗的染色能檢測到產生較多糖原的集落。因為誘變方法能產生啟動子突變，所以，經第一輪篩選的任何推斷的ADP葡萄糖焦磷酸化酶突變體必然有再次克隆到非突變載體的ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因，以相同的方法篩選所得的質粒。通過兩輪篩選的突變體不論用和不用激活劑和抑制劑檢測都具有ADP葡萄糖焦磷酸化酶活性。比較非突變的酶和突變的ADP葡萄糖焦磷酸化酶對激活劑和抑制劑的反應性，能夠鑑定出新突變體的特徵。Plaxton和Preiss1987年的報告說明玉米胚乳ADP葡萄糖焦磷酸化酶具有與其它作物ADP葡萄糖焦磷酸化酶相似的調節特性(Plaxton和Preiss1987)。他們指出，較早的報告之所以說玉米胚乳ADP葡萄糖焦磷酸化酶在沒有激活劑(3-PGA)時活性提高並且對抑制劑(Pi)的敏感性降低，是因為分離操作過程中酶的蛋白水解性裂解。藉助改變ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因以產生蛋白水解性裂解的玉米胚乳ADP葡萄糖焦磷酸化酶的酶類似物，這將降低變構調節作用。為測定E.coli液體培養物的ADP葡萄糖焦磷酸化酶活性，在離心機中旋轉沉澱這些細胞，然後將每克細胞膏狀物重懸於約2ml的提取緩衝液中(0.05MN-甘氨醯甘氨酸pH7.0，5.0mMDTE，1.0mMEDTA)。通過兩次流經氟氏細胞壓碎機對這些細胞進行裂解。這些細胞提取物在微型離心機中旋轉5分鐘，上清液流經G-50旋轉柱脫鹽。測定合成ADP葡萄糖的酶是用已公開方法的改進方法(Haugen等人，1976)。每100μl試樣，含有10μmolHepespH7.7，50μgBSA，0.05μmol[14C]葡萄糖-1磷酸酯，0.15μmolATP，0.5μmolMgCl2，0.1μg結晶酵母無機焦磷酸酶，1mM鉬酸銨，酶，所需要的激活劑或抑制劑和水。在37℃保溫此反應混合物10分鐘，藉助沸騰60秒停止反應。該試樣在微離心機中旋轉，40μl上清液注入SynchromSynchropakAX-100陰離子交換HPLC柱。用65mMKPipH5.5洗脫樣品。在約7-8分鐘洗脫出來反應的[14C]葡萄糖-1-磷酸酯，在約13分鐘洗脫[14C]ADP葡萄糖。藉助ADP葡萄糖峰中的放射活性量確定酶活性。藉助正效應子(3-磷酸甘油酸鹽；3-PGA)和負效應子(無機磷酸鹽；Pi)(Ghosh和Preiss，1966；Copeland和Preiss1981；Sowokinos和Preiss1982；Morell等人，1987；Plaxton和Preiss，1987、Preiss，1988)嚴密調節作物ADPGPP酶活性；3-PGAPi比值通過調整ADPGPP活性而在調節澱粉的生物合成中起很重要的作用(Santarius和Heber，1965；Heldt等人，1977；Kaiser和Bassham，1979)。作物ADPGPP酶是兩個大/「收縮」(Shrunken)和兩個小/「脆」(Brittle)亞基的異四聚體(Morell等人，1987；Lin等人，1988a，1988bHrishnan等人，1986Okita等人，1990)，有充足的證據表明異四聚體是ADPGPP最活化的形式。支持這一結論的論據在於分離出缺乏任一個亞基的作物「不含澱粉」的突變體(Tsai和Nelson，1966；Dickinson和Preiss，1969；Lin等人，1988a，1988b)以及發現小亞基的「ADPGPP」均四聚體僅有低酶活性的特徵(Lin等人，1988b)。另外，對於兩個亞基，所提及的效應子相互作用的殘基已確定(Morell等人，1988)。酶的活化形式的直接論據和對純化馬鈴薯酶所報告的動力學數據的進一步支持源於在E.coli中表達馬鈴薯ADPGPP活性和比較這種酶物質和來自馬鈴薯塊莖酶的動力學特性(Iglesias等人，1993)。鑑定和描述作物ADPGPP來調節酶變異體之特徵的方法與分離E.coliglgC16和相關突變體(例如glgC-SG5和CL1136)的方法相似。對於大的亞基和小亞基而言，很多作物ADPGPPcDNA或這些cDNA的部分已由單子葉作物和雙子葉作物克隆(Anderson等人，1989a；Olive等人，1989；Muller等人，1990；Bhave等人，1990；duJardin和Berhin，1991；Smith-White和Preiss，1992)。由作物cDNA以及所述的細菌cDNA編碼的蛋白質表現出高度保守性(Bhave等人，1990)。特別是，已經鑑定出一個高保守區，也含有一些在酶功能和效應子互相反應中相關的殘基(Morell等人，1988；duJardin和Berhin，1991)。現在已分離出馬鈴薯塊莖ADPGPP亞基基因的克隆。這些包括一個完整的小亞基基因和一個幾乎完整的大亞基基因，其中小亞基基因是由用將近全長的相同基因的cDNA克隆加入來自基因組克隆的第一外顯子的序列組裝起來的。裝配的小亞基基因的核苷酸序列(SEQIDNO7)和胺基酸序列(SEQIDNO8)記載於下文。這裡提到的核苷酸序列不同於以下述方法最初分離到的基因，這些方法是利用寡核苷酸引物序列GTTGATAACAAGATCTGTTAACCATGGCGGCTTCC(SEQIDNO11)藉助定位誘變在ATG密碼子處引入BglII＋NcoI位點以促使所述基因克隆進E.coli和作物表達載體。用寡核苷酸引物序列CCAGTTAAAACGGAGCTCATCAGATGATGATTC(SEQIDNO12)在終止密碼子處引入SacI位點。SacI位點作為3′克隆位點。用寡核苷酸引物序列GTGTGAGAACATAAATCTTGGATATGTTAC(SEQIDNO13)除去內部BglII位點。在PrecA-gene10L表達盒中，在recA啟動子控制下，於E.coli中表達這個裝配的基因(Wong等人，1988)，產生可測量水平的蛋白質。利用寡核苷酸引物序列GAATTCACAGGGCCATGGCTCTAGACCC(SEQIDNO14)藉助定位誘變放置一個起始蛋氨酸密碼子以表達成熟的基因。幾乎完整的大亞基基因的核苷酸序列(SEQIDNO9)和胺基酸序列(SEQIDNO10)如下文所示。利用寡核苷酸引物序列AAGATCAAACCTGCCATGGCTTACTCTGTGATCACTACTG(SEQIDNO15)藉助定位誘變在成熟的N端上放置一個起始蛋氨酸密碼子。起始蛋氨酸的作用是促使E.coli中的這個大亞基基因表達。HindIII位點位於終止密碼子後的103bp處，且作為3′克隆位點。用5′RACE方法(RapidAmplificationofcDNAEnds；Frohman，1990；Frohman等人，1988；Loh等人，1989)分離完整的大ADPGPP基因。用於這種方法的寡核苷酸引物表示如下1)GGGAATTCAAGCTTGGATCCCGGGCCCCCCCCCCCCCCC(SEQIDNO16)；2)GGGAATTCAAGCTTGGATCCCGGG(SEQIDNO17)；and3)CCTCTAGACAGTCGATCAGGAGCAGATGTACG(SEQIDNO18).前兩個分別等同於Loh等人(1989)的ANpolyC和AN引物，第三個引物反向互補於大ADPGPP基因中的序列。EcoRI/HindIII/BamHI-PstI片段被克隆PCR5′序列產物，它們容易用現有的基因部分裝配。鑑定ADPGPP弱調節的酶突變體，先對來自顯示糖原合成增加的誘變E.coli培養物的集落劃線，在含有1％葡萄糖的Luria-瓊脂平板上用碘染集落24-48小時，然後再確定來自這些分離物的ADPGPP酶對這一活性的正負效應物的反應性特徵(Cattaneo等人，1969；Preiss等人，1971)。採用相似的方法分離作物ADPGPP酶的這類變異體。而給出每一個亞基基因的表達系統對含有所述基因的培養物或純化的DNA藉助任一種已知的化學或物理方法(Miller，1972)分別進行每個基因的誘變。另一個方法是在有抑制性Mn++離子存在的情況下對一個完整基因採用PCR法(Ehrlich，1989)，條件是產生大量摻入錯誤的核苷酸。PCR法也可以利用與剛好是所述基因的一個特異區鄰接的引物，然後將這個誘變過的片段重新克隆進未誘變的基因段。隨機合成寡核苷酸的方法也可以在合成反應中藉助混合核苷酸用以產生基因的高度誘變短區，結果是在這一區的所有位置上發生摻入錯誤。這個小區的兩側是限制性位點。為的是把這一小區重新插入到基因的剩餘部分。藉助標準的碘方法篩選所得培養物或轉化體，它們顯示出糖原值比對照物高。優選的篩選方法是在僅有ADPGPP活性缺損的E.coli株中進行，其為表型上的糖原-，用glgC使與糖原+互補。E.coli菌株應保留產生糖原所需的其它活性。在相同的E.coli宿主中，通過把所述基因放在具有不同選擇標記基因的相容性質粒上而使兩種基因被一起表達。這些質粒在細菌宿主中有相似的拷貝數以最多地形成異四聚體。這種表達系統的一個例子是pMON17335和pMON17336的結合(Iglesias等人，1993)。使用不同的質粒能篩選一種基因的一種誘變群體，或在該基因轉化到表達第二種基因的感受態宿主中後篩選兩種基因的一種誘變群體，也可在相同宿主中將其結合之後篩選兩種誘變群體。在碘染色增強的集落中重新分離質粒DNA之後，將ADPGPP編碼序列再次克隆到表達載體中，檢驗表型並測試ADPGPP活性和其對效應物分子的反應。改進的變異體表現出Vmax提高，負效應子(Pi)的抑制作用降低或為達到最大活性而對激活劑(3-PGA)產生的依賴性。測定這些改進的特徵包括Pi以0.045mM(I0.5＝0.045mM)存在時或3-PGA以0.075mM(A0.5＝0.075mM)存在時檢測ADPGPP活性。有用的變異體在此濃度的Pi下表現出小於40％的抑制作用或在此濃度的3-PGA下表現出大於50％的活性。在分離改良的變異體並測定有反應的一個或多個亞基後，通過核苷酸測序檢測突變體。藉助定位誘變重新產生這一變化，並在激活或抑制劑存在下重新測定ADPGPP活性以證實所說的突變。然後，將該突變轉移至相當的完整ADPGPPcDNA基因中，藉助把含有來自被改變的細菌表達形式的變化之區域重新克隆到含有澱粉質體靶序列的作物形式，或藉助於對完整的天然ADPGPP作物基因的定位誘變可完成上述轉移。實施例1構建用於glgC16表達的DNA載體為在作物細胞中表達E.coliglgC16基因，且為使酶擊靶到質體，所說基因需被融合至一個編碼質體-擊靶傳輸肽的DNA中(下文稱作CTP/ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因)，並被融合至合適的作物調節區中。完成的方法是把glgC16基因克隆至一系列含有所需序列的質粒載體中。質粒pLP226在HincII片段上含有glgC16，其在HincII位點克隆至pUC8載體中(Leung等人，1986)。pLP226來自密什根州立大學的JackPreiss博士，它被轉化到用氯化鈣方法(Sambrook等人，1989)製備的冷凍感受態E.coliJM101細胞中。將已轉化的細胞在含有100μg/mlα-氨基苄青黴素的2XYT(infra)平板上進行平板培養。從5ml過夜培養基中藉助快速鹼提取法(RAE)純化質粒pLP226(Birnhoim和Doly，1979)。為把glgC16基因融合到編碼葉綠體傳輸肽的DNA中，在基因的5′端上需要一個NcoI位點。還需要終止密碼子下遊的SacI位點以把CTP/ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因移到下一個載體中。為了導入這些位點，利用大約20ng快速鹼提取純化的質粒pLP226作為模板進行PCR反應(#13)。反應是根據生產者(PerkinElmerCetus)的建議完成的。引物是QSP3和QSP7。QSP3用於導入包括glgC16基因起始密碼子的NcoI位點。將QSP7引物在glgC16基因的3′非轉譯區雜交並加入SacI位點。將熱循環計設定(TheThermalCycler)為30個循環，每個循環包括94℃變性步驟1分鐘，50℃退火步驟2分鐘，72℃延伸步驟3分鐘。每一循環後延伸步驟增加15秒。QSP3引物5′GGAGTTAGCCATGGTTAGTTTAGAG3′(SEQIDNO19)QSP7引物5′GGCCGAGCTCGTCAACGCCGTCTGCGATTTGTGC3′(SEQIDNO20)將PCR產物克隆至載體pGEM3zf+(Promega，Madison，WI)中，其已用SacI和HindIII酶切，並含有連接在HindIII位點的已經修飾的擬南芥屬(Arabidopsis)小亞基CTP的DNA。該CTP的DNA序列和胺基酸序列分別表示在SEQIDNO5和SEQIDNO6中。在56℃，用5單位的小牛腸鹼性磷酸酶處理線性化的載體30分鐘。將載體和具有含新NcoI和SacI位點的glgC16基因的PCR#13片段放在瓊脂糖凝膠上電泳，藉助與DEAE膜的結合純化這些片段。用DEAE膜純化所說片段的方法是由Schleicher和Schuell提供的，標題為「BindingandRecoveryofDNAandRNAUsingSandSDEAEMembrance」。連接物#5用pGEM3zf+將glgC16基因融合至已經修飾的擬南芥屬SSU.CTP的DNA上。所說連接物含有3μl已用NcoI和SacI酶切的載體，以及3μl已用NcoI和SacI酶切並在凝膠上再純化的PCR#13產物。將總量為20μl中的5μl的連接物#5轉化到冷凍感受態JM101細胞中，將轉化的細胞鋪在含有α-氨基苄青黴素的2XYT平板上(16g/l細菌胰化腖，10g/l酵母提取物，10g/lNaCl，pH7.3，用1.5％瓊脂固化)進行平板培養。過夜生長後從平板上挑選出樣品1。將該樣品接種到4ml2XYT介質中，在37℃生長過夜。經快速鹼提取方法分離質粒，分別用EcoRI、NcoI以及EcoRI和NcoI酶切DNA。在瓊脂糖凝膠上分離酶切物，觀察到預期的片段。由樣品1分離的質粒表示為pMON20100，由pGEM3zf+、已經修飾的擬南芥屬SSUCTP的DNA和glgC16基因組成。融合是以允許其從SP6聚合酶的啟動子進行轉錄的方向進行的。為檢測把ADP葡萄糖焦磷酸化酶引入到已分離的萵苣葉綠體中的構建體，需要將CTP/ADP葡萄糖焦磷酸化酶融合體轉錄和翻譯，以製備[35S]標記的ADP葡萄糖焦磷酸化酶。為製備藉助SP6聚合酶進行轉錄的DNA模板，將pMON20100的CTP/ADP葡萄糖焦磷酸化酶區經PCR擴增產生大量的線性DNA。為此，將藉助快速鹼提取法純化的大約0.1μl的pMON20100用作PCR反應#80的模板。引物是商業上可得到的SP6啟動子引物(Promega)和OligoQSP7(SEQIDNO20)。將SP6引物雜交至載體中SP6啟動子上，且包括完整的SP6啟動子序列。因此，用此寡核苷酸引導的PCR產物將含有SP6聚合酶的識別序列。QSP7(SEQIDNO20)引物將在glgC16基因的3′非轉譯區雜交。這和用來在glgC16終止密碼子下遊導入SacI位點的引物相同。設定熱循環計(ThermalCycler)為30個循環，每個循環包括於94℃變性1分鐘、55℃退火2分鐘和72℃延伸3分鐘。每一循環後，增加15秒的延伸步驟。SP6啟動子引物5′GATTTAGGTGACACTATAG3′(SEQIDNO21)將5μl的PCR反應物#80在瓊脂凝膠上電泳，並經與DEAE膜結合純化。洗脫所說DNA，將其溶解在20μlTE中。將2μl凝膠純化的PCR#80產物用於SP6RNA聚合酶體外轉錄反應中。反應條件是提供人(Promega)描述的合成大量RNA(100μl的反應物)的條件。藉助兔子網織紅細胞溶胞系統(Promega)用PCR反應#80DNA製得RNA進行體外翻譯。如上所述，用來自pMON20100的35S標記的蛋白質(即PCR反應物#80)進行體外葉綠體導入測定。處理葉綠體導入測定中的樣品後，用3-17％聚丙烯醯胺梯度，在SDS-PAGE凝膠上對樣品進行電泳。將凝膠在含40％甲醇和10％乙酸的溶液中固定20-30分鐘。然後，將凝膠浸泡在EN3HNCETM中20-30分鐘，接著在凝膠乾燥器上乾燥。利用增感屏以及使凝膠過夜曝光，通過放射自顯影使凝膠顯像，結果表明融合蛋白質被導入到分離的葉綠體中。下一步將pMON20100中的構建體操作融合到增強CaMV35S啟動子(Kay，R.1987)和由pMON999分離的NOS3′端(Bevan，M.1983)上。PCR反應物114含有作為模板的質粒pMON20100並應用了引物QSM11和QSM10。QSM11退火至已經修飾的擬南芥屬(Arabidopsis)SSUCTP的DNA上，形成了從ATG起始密碼子的上遊7bp處的一個BglII位點。QSM10退火至glgC16基因的3′端，緊接在終止密碼子後加上一個XbaI位點，在終止密碼子後5bp處加入一個SacI位點。早已加入到glgC16基因的SacI位點大約是在終止密碼子下遊100bp處。設定熱循環計為25個循環，每個循環包括於94℃變性1分鐘、55℃退火2分鐘和72℃延伸步驟3分鐘。每一循環後，增加15秒的延伸步驟。QSM11引物(SEQIDNO22)5′AGAGAGATCTAGAACAATGGCTTCCTCTATGCTCTCTTCCGC3′QSM10引物(SEQIDNO23)5′GGCCGAGCTCTAGATTATCGCTCCTGTTTATGCCCTAAC3′將95μl(來自總體積100μl的)PCR反應物#114經乙醇沉澱，並在20μlTE中重新懸浮。在37℃，用BglII(4單位)和SacI(10單位)過夜酶切5μl的上述物質。用同樣的方法酶切5μl(5μg)含有增強CaMV35S啟動子和NOS3′端的載體pMON999。用限制酶酶切後，將DNA於瓊脂糖凝膠上電泳，經與DEAE膜結合純化。將每種DNA溶解在20μlTE中。在20μl的總體積中將1μlPCR114與3μl載體連接。在14℃溫育連接混合物7小時。將10μl連接物轉化到冷凍感受態的MM294細胞中，且鋪板於含100μg/mlα-氨基苄青黴素的LB平板上(10g/l細菌胰化腖、5g/l酵母提取物、10g/lNaCl和1.5％固化用瓊脂)。挑選克隆，接種到含100μg/mlN-氨基苄青黴素的有5mlLB介質的試管中，生長過夜。用5ml過夜培養物進行快速鹼提取以分離質粒DNA。用EcoRI酶切DNA，分離的等分試樣用NotI酶切。在瓊脂糖凝膠上分析這些樣品後，證實質粒pMON20102含有具有glgC16基因特徵的497bpEcoRI片段，該質粒還含有具有增強CaMV35S啟動子已經修飾的擬南芥屬SSUCTP的DNA、glgC16基因和NOS3′端的2.5kbNotI片段。然後，用pMON20102質粒構建將以塊莖特異性方式表達glgC16基因的DNA載體，該載體還將被用來轉化馬鈴薯。這種構建導致了在馬鈴薯塊莖中ADPGPP的特異表達，並提高了塊莖中的澱粉含量。用於馬鈴薯轉化的載體是土壤桿菌介導作物轉化載體pMON886的一個衍生物。pMON886質粒由以下已清楚表徵的DNA片段組成。一個由轉位子Tn7分離出的0.96kb片段，Tn7編碼細菌放線壯觀素/鏈黴素(Spc/Str)抗性，並且是在E.coli和根癭土壤桿菌中篩選的決定因子(Fling等人，1985)。這個片段連接到遺傳工程操作得到為進行作物表達的一個嵌合卡那黴素抗性基因上，以能夠選擇已轉化的組織。這個嵌合基因的組成是0.35kb花椰菜花葉病素355啟動子(P-35S)(Odell等人，1985)，0.83kb新黴素磷酸轉換酶II型基因(NPTII)和0.26kb胭脂鹼合酶基因的3′-非轉譯區(NOS3′)(Fraley等人，1983)。下一個片段是來自RK2質粒的複製起始點0.75kb(ori-V)(Stalker等人，1981)。它連接到pBT322的3.1kbSalI至PvuI片段上，該片段提供用於在E.coli中維持的複製起始點ori-322和用於接合轉入到根癭土壤桿菌細胞的bom位點。再下一個片段是pTiT37質粒的0.36kbPvuI片段，其含有胭脂鹼型T-DNA右界區(Fraley等人，1985)。通過將glgC16基因置於塊莖特異啟動子控制之下的基因操作，使之在塊莖中得到初步表達。glgC16蛋白質定向到作物細胞中的質體中，因為它作為C-末端與N-末端蛋白質部分的融合體合成，其編碼來自擬南芥屬thalianaSSU1A基因序列的葉綠體擊靶序列(CTP)(Timko等人，1989)。在導入過程中，去除CTP部分以釋放glgC16酶。其它作物表達信號還包括3′-聚腺苷酸化的序列，其由位於表達盒的編碼部分下遊的NOS3′序列提供。這個表達盒按如下方法裝配作為HindIII-BamHI片段馬鈴薯貯存蛋白(patatin)啟動子從pBI241.3質粒切下(pBI241.3質粒含有包括從1323處的AccI位點到2289處的DraI位點的馬鈴薯貯存蛋白(patatin)-1啟動子片段[位置參見Bevan等人的序列，1986]且帶有在前一位置加入的HindIII接頭和在後一位置加入的BamHI接頭；Bevan等人，1986)，並且與CTP1-glgC16融合體(pMON20102的BglII-SacI片段)和用HindIII同SacI消化的pUC-型質粒載體(載體中的這些克隆位點側面有NotI識別位點)連接在一起。然後，作為pMON886中的NotI位點，這個表達盒被導入，從而使glgC16基因表達方向與NPTII(卡那黴素)基因表達的方向相同。這個衍生物稱為pMON20113，在KishoreWO91/19806的圖7中得到說明。作物轉化再生用輔助質粒pRK2013，藉助三親株結合系統，把pMON20113載體移到解除抵禦能力的根癭土壤桿菌株中(Ditta等人，1980)。所用的解除抵禦能力的菌株ABI載有Ti質粒，其藉助去除引起根癭病的作物激素基因而解除抵禦能力。ABI株是載有解除抵禦能力的pTiC58質粒pMP90RK的A208根癭土壤桿菌(Koncz和Schell，1986)。解除抵禦能力的Ti質粒提供在連入ABI株後自發複製pMON載體所需要的trfA基因功能。當作物組織與ABI∷pMON結合物一起培育時，藉助由解除抵禦能力的pMP90RKTi質粒編碼的vir功能，將載體轉至作物細胞中。按下述方法，把編碼細菌ADPGPP基因(SEQIDNO1)的pMON20113構建體轉化入RussetBurbank馬鈴薯品種Williams中。為了轉化RussetBurbank馬鈴薯，將無菌RussetBurbank枝條培養物保持在聖代杯中，其中含有補充有25ml/L抗壞血酸的8mlPM培養基(Murashige和SkoogMS無機鹽、30g/l蔗糖、0.17g/lNaH2PO4H2O、0.4mg.1硫胺素-HCl和100mg/l肌醇，在pH6.0用2g/lGelrit固化)。每個枝條大約長5cm時，切出3-5mm莖節間段，並用來自4天陳舊平板培養物的根癭土壤桿菌過夜培養物1∶10稀釋液進行接種。於20℃，在載於1/10P培養基的1.5ml菸草細胞餵養層上放置的無菌濾紙上(1/10P培養基1/10濃度MS無機鹽和有機附加物且無酪蛋白Jarret等人，1980，30g/l蔗糖和8.0g/l瓊脂)共同培養莖外植體2天。共同培養後，外植體轉入全濃度P-1培養基以進行愈傷組織誘導，培養基包括MS無機鹽、Jarret等人(1980)的有機附加物，除去酪蛋白，5.0mg/l玉米素核糖核苷(ZR)和0.10mg/l萘乙酸NAA(Jarret等人，1980a、1980b)。還含有羧苄青黴素(500mg/l)和頭孢氨噻肟(100mg/L)以抑制細菌生長，且加入100mg/l卡那黴素以選擇轉化的細胞。4星期後，外植體轉到相同組分的培養基中，但用0.3mg/l赤黴酸(GA3)代替NAA(Jarret等人，1981)，目的是促使枝條形成。在轉移至枝條誘導培養基後約2星期，枝條開始發育。切下這些枝條，移到PM培養基小瓶中生根。在生根培養基上約4星期後，把此作物轉入土壤，其漸漸變得耐寒。檢測枝條的新黴素磷酸轉移酶II所給的卡那黴素抗性，通過將枝條放在含有50mg/l卡那黴素的PM生根培養基上，以選擇轉化的細胞。在培養物中再生的RussetBurbankWilliams作物移植到6英寸(～15.24cm)盒中，在溫室條件下生長至成熟。收穫塊莖，在室溫下檢化2天。收集長度大於2cm的全部塊莖，在3℃、高溼度下貯存。貯存塊莖的特異性比重和澱粉測定冷貯存(3℃)3和4個月之後，測定每種作物最大的2個或3個塊莖的特異性比重(SG)，每個塊莖的一般重量是20～40克。在測定特異性比重前幾個小時，塊莖可以被升溫到室溫，但是不允許重複調節。特異性比重的計算是通過空氣中重量/水中重量的方法進行的，其中SG＝空氣中重量/(空氣中重量－水中重量)。按照下面的式子(VonScheete，1937)計算以SG為基礎的澱粉百分數和乾物質百分數澱粉％＝17.546＋(199.07)(SG－1.0988)乾物質％＝24.182＋(211.04)(SG－1.0988)按Lin等人，1988所描述的方法對新鮮的、貯存塊莖組織的中心部分進行澱粉分析。在收穫取組織前，塊莖不可以升溫。簡單地說，切取大約100mg中心部分，稱重，放入1.5ml離心管中，在乾冰上冷凍。然後，在SavantSpeed-VacConcentrator中乾燥組織至恆重，測定最後的乾重。首先除去可溶性糖在70℃下，用1ml80％乙醇提取三次，每次處理時間20分鐘。在最後一次溫育後，在Speed-VacConcentrator中乾燥去除所有的剩餘乙醇。將固體物質重新懸浮在400μl0.2M氫氧化鉀中，磨碎，然後在100℃保溫30分鐘以溶解澱粉。冷卻溶液，加入80μl1N乙酸進行中和。在37℃用，14.8單位的胰腺α-澱粉酶(SigmaChemical，St.Louis)處理30分鐘，隨後在55℃用10單位澱粉葡糖苷酶(SigmaChemical，St.Louis)處理60分鐘，使澱粉降解成葡萄糖。用Sigma(St.Louis)己糖激酶藥盒測量經酶消化釋放的葡萄糖，這些數值用來計算澱粉含量。糖分析試驗塊莖貯存在3℃下，在糖分析前不允許於室溫下重複調節。獲取從貯存塊莖中心切下的部分，測定鮮重，在SavantSpeed-VacConcentrator中乾燥前，在乾冰上冷凍該組織。每個樣品鮮重約100mg。粗磨幹的塊莖物質，在70℃，用0.5ml80％乙醇提取糖，提取三次，每次20分鐘。每次保溫後，不溶物在微離心機中旋轉沉澱2分鐘，收集上清液。混合全部三次提取物的上清液，乾燥，在1ml100mMTris緩衝液，pH7.5中重新懸浮。每次糖分析試驗，用10μl樣品。對於每個樣品，按照製造者的方法，用葡萄糖[HK]診斷藥盒(SigmaChemical，Co.，St.Louis，MO)測量葡萄糖含量。簡單地說，1mL重組試劑與10μl樣品在室溫下保溫10分鐘，測定樣品的濃度的方法是在340nm的吸收值減去水中10μl樣品的吸收值。然後，經如下公式計算葡萄糖百分數葡萄糖％＝[(A340×2.929)/mg·鮮重]×100％往上述測定葡萄糖的反應物中加入1μg磷酸葡糖異構酶，從葡萄糖百分數中減去所得的葡萄糖＋果糖的百分數，測定果糖含量。測定蔗糖含量的方法是在葡萄糖HK試驗中加入1μg磷酸葡糖異構酶和100μg酵母轉化酶，在室溫下延長保溫時間至30分鐘。如上所述，減去所得的葡萄糖和果糖含量測定出蔗糖百分數。貯存塊莖的Westernblot分析在分離組織進行分析前，不允許對貯存於3℃下的塊莖升溫。為了Westernblot分析，從乾燥的塊莖組織粗粉中提取蛋白質方法是在100mMTrispH7.5、35mMKCl、5mM二硫蘇糖醇、5mM抗壞血酸、1mMEDTA、1mM苄脒和20％甘油中以1∶1研磨塊莖組織粗粉。用PierceBCA方法測定提取物的蛋白質的濃度，在3-17％SDS聚丙烯醯胺凝膠上分離蛋白質(Laemmli，1970)。檢測E.coliADPGPP的方法是利用抗純化的E.coliADPGPP的山羊抗體和鹼性磷酸酶結合的兔抗山羊抗體(Promega，Madison，WI)。測定炸制顏色在Parma，Idaho田間條件下生長以下馬鈴薯品系八種表達E.coliglgC16基因的轉基因馬鈴薯品系；和20個對照品系，它們的組成是來自不表達E.coliglgC16基因的pMON20113轉化品系和幾個非轉基因RussetBurbank對照品系的混合品系。收穫塊莖，在40℃貯存兩個月。測定全部馬鈴薯系的炸制顏色的方法是從每一品系的代表樣品中切取中心部分，在375°F豆油中炸制3分30秒鐘。經光電壓測量測定炸制顏色，根據USDA冷凍炸薯條顏色等級圖報告所測值。結果所有收穫的塊莖來自相同品種、同齡、在一樣的生長條件下挨著生長的作物RussetBurbankWilliams，82)。Westernblot分析表明E.coliADPGPP水平和收穫時測定的水平基本相等(表1)，這說明在冷貯存期間E.coliADPGPP蛋白質的水平是穩定的。分析在3℃、高溼度條件下貯存的塊莖表明，表達E.coliglgC16基因的塊莖與對照塊莖相比，積累的還原糖減少5-6倍(表2、3、4、5和6)。在對照的和轉基因的塊莖之間少糖水平基本相當，而在轉基因的塊莖中澱粉水平明顯提高。這些結果說明，在表達E.coliglgC16基因的塊莖中，由於澱粉在貯存期間降解，所形成的糖重新合成為澱粉，相反，在對照塊莖中糖趨於積聚。表達E.coliglgC16基因的轉基因馬鈴薯作物在野外條件下成長，glgC16馬鈴薯系的塊莖連同幾種不同對照系的塊莖貯存在4Q°FG(4℃)下。冷貯存兩個月後，測定與糖含量直接相關的炸制顏色。與貯存在相同條件下的對照塊莖炸制色(較暗的顏色)相比，轉基因馬鈴薯塊莖的平均炸制色得到顯著地改善(較淺)(表7)，這表明在表達E.coliglgC16基因的塊莖中糖水平較低。於3℃下貯存14星期的田間生長的塊莖樣品中，還原糖含量的直接測量值支持了炸制色結果，因為表達E.coliglgC16基因的塊莖含有比對照塊莖顯著減少的還原糖(表8)。測定轉基因馬鈴薯作物塊莖在冷貯存後的再調節速度和程度。與對照系相比，塊莖特異性比重大於1.083的轉基因系的炸制顏色表明在65°F下再調節速度和程度得到提高(表9)。表1在收穫時和冷貯存三個月後馬鈴薯塊莖中E.coliADPGPP的表達。通過與已知標準相比，從Westernblot分析中估算E.coliADPGPP水平，數值表示為GlgC16(ng)/50μg提取的塊莖蛋白質。GlgC16ng品系收穫時3個月353c20-2520-25535c25-3020-25448a25-3025-30182a20.5-1199a20-2520-25288c20-2520-25194a15-2015-20524a1015-20表2冷貯存三個月塊莖中的糖和澱粉含量(乾重計算值)。還原糖是葡萄糖和果糖，且總糖是還原糖加蔗糖。數值(百分乾重)代表9個glgC16+高澱粉馬鈴薯系和11個對照(glgC16-)馬鈴薯系在3℃下貯存三個月的平均值。還原糖蔗糖總糖澱粉glgC16+1.51.22.659.5對照7.00.87.853.7表3冷貯存4個月塊莖中的糖和澱粉含量(鮮重計算值)。還原糖是葡萄糖和果糖，總糖是還原糖加蔗糖。數值(百分鮮重)表示9個glgC16+高澱粉馬鈴薯系和11個對照(glgC16-)馬鈴薯系在3℃下貯存4個月的平均值。還原糖蔗糖總糖澱粉glgC16+0.10.10.39.9對照0.80.21.06.0表4冷貯存4個月後的馬鈴薯塊莖的還原糖含量。記錄所含糖值在所示範圍內的作物品係數目。百分數以鮮重計。還原糖百分數0-0.20.2-0.40.4-0.60.6-0.80.8-1.01.0+對照系020423glgC16系630000表5冷貯存4個月後馬鈴薯塊莖的總糖含量。記錄所含糖值在所示範圍內的作物品係數目。百分數以鮮重計。總糖含量0-11-22-33-44-55+對照系000236glgC16系342000表6冷貯存4個月後的馬鈴薯塊莖的澱粉含量。記錄所含澱粉值在所示範圍內的作物品係數目。百分數以鮮重計。澱粉百分數2-44-66-88-1010-1212-14對照系163100glgC16系002331表7在40°F冷貯存2月後的田間生長塊莖的平均炸制顏色。根據USDA公布的冷凍炸馬鈴薯的顏色標準確定炸制色值。在這些分級中，0＝很淺顏色，4＝很深的顏色。記錄炸制顏色在所示範圍內的作物品係數目。炸制顏色分級2-2.492.5-2.993.0-3.493.5-4.0對照系00416glgC16系1160表8在3℃下貯存14星期後的田間生長的馬鈴薯塊莖的還原糖含量。記錄所含糖值在所示範圍內的作物品係數目。百分數以鮮重計。還原糖百分數0.5-11-1.51.5-22-2.5對照系0422glgC16系4220實施例2低溫貯存後，由於糖含量上升，經常不能接受馬鈴薯用於炸制。經過處理例如漂燙或再調節可以改善這些貯存的馬鈴薯；前一種處理用熱水處理馬鈴薯片去除糖，後一種處理是在較高溫度(～65°F)下貯存塊莖期間使糖代謝。漂燙主要使酶失活，但是當糖含量高時，這一步驟所用的次數延至通常處理次數的許多倍。這一步的延長導致產品回收較低、味道損失、浪費時間，它要求高能量供給並產生具有高生物氧需求的廢料因而在處理廢水上造成了額外的限制。再調節需要增加控制溫度的貯存設施，要求在不同溫度下進行多步處理以達到最佳效果。在較高的溫度和較長時間下將增加發芽和病變的機會。由冷貯存GlgC16塊莖炸制的馬鈴薯的顏色值經常比對照物低(較好)，在某些情況下，甚至3-4個月後其值仍低以至於不需要進行再調節。這些試驗擴展到50°F下貯存2個月再在38°F下貯存3個月的塊莖，也包括測量再調節速度。對用下列載體轉化的作物塊莖進行試驗pMON17316(具有貯存蛋白3.5啟動子)、pMON17279(具有馬鈴薯ADPGPP的小亞基)；可對含有前述貯存蛋白1.0啟動子/glgC16載體的作物塊莖也進行試驗。這些載體按如下方法構建由質粒pPBI240.7獲得貯存蛋白3.5啟動子(Bevan，1986)。3.5啟動子的大部分從pPBI240.7的HindIII位點(-3500)到XbaI位點(-337)切下，與啟動子的其餘部分即從XbaI位點到+22處BglII位點(在先是DraI位點)結合，以三重連接進入提供BglII位點以形成pMON17280的載體中。然後，後-質粒用作完整的3.5啟動子和pMON20102的質體擊靶肽-GlgC16融合體的三重連接載體，如上所述形成塊莖表達盒(在pMON17282中)。由貯存蛋白3.5啟動子、質體擊靶肽-GlgC16融合體和NOS3′序列組成的盒在NotI片段上導入到作物轉化載體pMON17227(為Ti質粒載體，它已由Barry等人在WO92/04449(1991)中公開和描述在此引作參考文獻)，以形成pMON17316。參見圖1。獲得馬鈴薯塊莖ADPGPP小亞基基因的啟動子(SEQIDNO24)作為基因組克隆1-2的XbaI-BglII片段，插入到BlueseriptIIKS-的XbaI和BamHI位點(Nakata等人，1992)。所用的啟動子片段由推斷的起始蛋氨酸5′端大約2.0kb處的ClaI位點延伸到位於這一ATG前12bp處的HindIII位點的部分組成。通過利用另一個pUC載體進行亞克隆，把BglII位點放在鄰近HindIII位點處，且通過後一位點連接到CTP擊靶和glgC16編碼序列的融合體上。將具有作物3′識別序列的此盒克隆進作物轉化載體中以形成pMON17279(還包括一個盒，其中E.coliuidA[GUS]基因由相同的小馬鈴薯ADPGPP啟動子表達)。參見圖2。這些載體由土壤桿菌屬菌轉化插入馬鈴薯細胞中，隨後進行草甘膦選擇。為了利用作為選擇試劑的草甘膦轉化馬鈴薯，使合適的土壤桿菌在2mlLBSCK中生長過夜。第二天，用MSO以1∶10稀釋細菌，或直到確定光密度讀數為0.2-0.33。將馬鈴薯作物在補充25mg/ml抗壞血酸的PM培養基上於無菌條件生長三個星期，除去馬鈴薯作物莖上的葉。把莖切成3-5mm的段，用上述的稀釋細菌培養。將外植體放在備好的共培養平板上。共培養平板含由溼潤濾紙覆蓋的1.5mLTxD細胞的1/10MSO。每個平板放有約50個外植體。共培養2天後，將外植體放存愈傷組織誘導培養基上2天，該培養基含有5.0mg/lZeatinRiboside、10mg/lAgNO3和0.1mg/lNAA。然後，將外植體轉入含有用於選擇的0.025mM草甘膦的愈傷組織誘導培養基上。4星期後，將外植體放在含有5.0mg/lZeationRiboside+10mg/lAgNO3和0.3mg/lGA3以及用於選擇的0.025mM草甘膦的枝條誘導培養基上。8星期時開始出現枝條。12星期中每4個星期，將外植體轉移到新鮮的枝條誘導培養基中。切取枝條，置於PM培養基上約2星期或直到它們長到能放在土壤中那麼大，GlgC16RussetBurbank系的數據，包括那些由貯存蛋白1.0(HS01；HS03；MT01)、貯存蛋白3.5(HS13)以及馬鈴薯ADPGPP(HS10)啟動子的小亞基表達GlgC16的品系，都表示在下面(表9)。很多GlgC16馬鈴薯(Atlantic品種)系也做了檢測(MT01；貯存蛋白1.0啟動子)。一般，生產者必須對等於或大於2.0分的產品進行漂燙以制出可接受的產品。很多剛從冷貯存拿出的RussetBurbankGlgC16系的炸制評分能給出小於2.0，因此它們能直接加工。大量品系在進行很短的再調節後能取得小於2.0的炸制顏色的評分。這種改善的再調節反應表現在具有固體成分增加的品系和比重未表現增加的GlgC16品繫上。改進之處還表現用以在塊莖中表達GlgC16的所有啟動子的情況下。所得的可以直接從貯存中取出即炸制的作物品系以及快速再調節的品系的效果也顯示在GlgC16Atlantic品種中。品系MT01-27還表明，無需在塊莖中提高澱粉量以獲得增強的冷貯存性能，因為這些所試驗的品系的特異性比重與對照的Atlantic品種相比沒有明顯的區別。表9含有GlgC16馬鈴薯的炸制顏色/再調節反應。(根據USDA圖評定炸制顏色，分級是0-4，最低-最高)。65°F下天新系036101317Control-RussetBurbankRB022.22.31.82.01.01.3RB033.53.32.51.72.32.5RB052.32.52.22.01.21.3GlgC16RussetBurbankHS13-47*3.02.50.70.71.31.3HS10-15*1.31.30.40.81.01.0HS13-50*3.21.00.51.01.20.8MT01-82*2.21.20.71.01.51.0HS13-36*2.21.30.71.21.20.8HS10-20*1.00.70.50.50.40.5*-特異性比重大於1.083HS01-58#2.82.51.30.71.51.8HS03-20#3.22.31.72.81.82.0HS03-18#2.01.81.70.71.31.3HS03-12A#3.32.52.72.22.20.8HS03-12B#3.03.22.02.71.32.0HS01-49#2.21.32.32.21.50.8HS13-30#3.22.32.02.81.73.0#-特異性比重小於1.083Control-AtlanticAT-12.32.32.31.51.51.8GlgC16AtlanticMT01-242.51.82.81.22.21.3MT01-271.00.51.30.30.80.7實施例3在貯存於60°F下的馬鈴薯塊莖上(這些塊莖先前已在38-40°F下貯存了3個月)，測試GlgC16對延緩發芽的影響。每隔一段時間檢則塊莖(4-6)，記錄出現的發芽＞0.5cm時的天數(表10)。發芽的延緩以50％發芽的天數表示，常在GlgC16系中有所提高，並在試驗的三個品種中能觀察到(RussetBurbankAtlantic和Norchip)；在由貯存蛋白1.0((HS01；HS03和MT01)、貯存蛋白、3.5(HS13)和馬鈴薯小ADPGPP(HS10)啟動子表達GlgC16的系中能觀察到；也能在提高了和未提高固體成分含量的品系中看到。這些延緩發芽的系一般種植在土壤中時發芽。表10品種品系50％發芽的天數Russet對照15Burbank對照14對照9HS01-2511HS01-4915HS01-5818HS03-312HS03-513HS03-1713HS03-2614HS03-2712HS03-4124HS10-1014HS10-1526HS10-20＞43÷HS13-211HS13-1316HS13-2323HS13-3015HS13-3425HS13-3712HS13-4721HS13-5019HS13-6813HS13-7024MT01-1014MT01-1113MT01-3014MT01-3719MT01-8216Atlantic對照6MT01-611MT01-79MT01-1510MT01-316Norchip對照8MT01-112MT01-513-觀察的持續時間；此系的塊莖種在土中時發芽。實施例4對在兩個不同的啟動子控制下，對用glgC16轉化的馬鈴薯進行另外的試驗。從兩個馬鈴薯品種分離馬鈴薯塊莖ADPGPP的大亞基啟動子RussetBurbank(SEQIDNO25)和Desiree(SEQIDNO26)。用來自ADP葡萄糖焦磷酸化酶的大亞基cDNA的5′端的探針進行噬菌斑雜交，鑑定克隆。藉助作物的共同序列，鑑定這些克隆的翻譯起始位點(ATG)(Lutcke等人，1987)。用PCR引物在ATG的下遊3′端導入BAMHI位點，在兩個啟動子的5′端導入HINDIII位點。所得的600bpRussetBurbank啟動子和1600bpDesiree啟動子分別連入pMON10098代替E35S啟動子，並與來自含有CTP-glgC16嵌合基因的pMON20102的BglII-SacI片段融合。從這些質粒中除去E35S-NPTII-Nos盒，用含有pMON17227的FMV-CTP-CP4-E9盒的NotI-SalI片段代替，如上所述，產生pMON21522(RussetBurbank-衍生的啟動子)和pMON21523(Desiree-衍生的啟動子)。pMON10098質粒含有以下的DNA區1)為了作物表達以選擇轉化的組織而經基因工程操作的嵌合卡那黴素抗性基因。嵌合基因的組成是0.35kb花椰菜花葉病毒35S啟動子(P-35S)(Odell等人，1985)，0.83kbNPTII基因，和0.26kbNOS3′的3′-非轉譯區；2)pTi15955章魚鹼Ti質粒ClaI至DraI的0.45kb片段，它含有T-DNA左界區(Barker等人，1983)；3)含有RK2質粒複製起始點(ori-V)的0.75kb片段(Stalker等人，1981)；4)提供在E.coli中維持的複製起始點(ori-322)和用於結合轉入根癭土壤桿菌細胞的bom位點的pBR322SalI至PstI的3.Okb片段；5)分離自編碼細菌放線壯觀素/鏈黴素抗性(SPC/Str)轉位子Tn7的0.93kb片段(Fling等人，1985)且它是在E.coli和根癭土壤桿菌中選擇的決定因子；6)含有胭脂鹼-型T-DNA右界區的pTiT37質粒PvuI至BclI的0.36kb片段(Fraley等人，1985)；和7)最後的片段是表達盒，其組成是；由啟動子序列(P-E35S)的複製增強的0.65kb花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子(Kay等人，1987)，具有幾個獨特克隆位點的合成多接頭，豌豆rbcS-E9基因(E93′)的0.7kb3′非轉譯區(Coruzzi等人，1984)。利用三親株交配系統把質粒配入根癭土壤桿菌株ABI中，用以轉化RussetBurbank系Williams82。以pMON22152和pMON21523轉化的RussetBurbank也表現出改進的貯存特性，其中GlgC16是由馬鈴薯塊莖ADPGPP的大亞基啟動子表達的。收穫田間生長的塊莖，在50°F下放1個月然後在40°下冷貯存放4個月。在一項試驗中，藉助檢測所炸材料的反射值估算這些直接來自貯存的塊莖製成的炸製品的炸制顏色；優選較低的值。在第二項試驗中，將冷貯存塊莖的一部分移到55°F下，以測試再調節中的反應。這些對於塊莖的莖和頭端(bud)的計算數據表示在表11中。在這兩個試驗中，無論直接炸制的還是經重調節後的，很多品系比對照品系的色值要好。例如，pMON21522-144、pMON21523-79和很多其它的品系都表現出在對照物之上的驚人的改善。表11pMON21522炸薯條的反射值1.240°F貯存340°F貯存21d.@55°F4LINE#頭端5莖部5頭端莖部14424.322.134.625.420922.820.131.423.214927.122.430.727.517825.321.134.929.319423.720.830.623.520421.314.733.923.021822.818.933.320.7對照/平均值619.716.831.025.1pMON21523炸薯條的反射值1.240°F貯存340°F貯存21d@55°F4LINE#頭端5莖部5頭端莖部.3322.116.529.823.13421.218.232.127.33824.023.228.323.64024.415.331.526.24722.015.634.927.74823.019.331.124.97924.419.735.829.78021.820.532.725.59320.717.431.123.29919.817.130.623.43122.121.630.224.73520.016.834.528.43720.618.534.227.23918.015.833.124.44219.215.131.924.14323.920.732.122.06020.716.332.420.36422.316.130.023.07121.820.933.124.77622.821.528.525.08116.516.029.122.79215.315.030.323.5對照/平均值619.716.831.025.11從每4-6個塊莖中切取四條中心部分，在375°F下炸制。2用PHOTOVOLT577反射儀測量反射值。3從野生的塊莖中製取薯條，塊莖已在50°F下貯存1個月，然後在40°F下貯存4個月(冷貯存)。4從野生的塊莖中製取薯條，塊莖已在50°F下貯存1個月，在40°F下貯存4個月(冷貯存)，然後在55°F下再調節21天。5分別在炸後的薯條的頭端和莖部測定反射值。6為比較，計算22個對照RussetBurbank品系的平均值。綜上所述，可以看到本發明很適合於達到上述所有的結果和目的，並且具有明顯的和本發明所固有的優點。應理解到，某些特點和局部組合是有用的，很多內容在不考慮其它特點和局部組合情況下可以被利用。這些已被考慮到並寫入權利要求範圍中。因為本發明可以形成很多可能的實施例而不脫離其範圍，所以應理解本文所說明的或附圖所顯示的所有內容都作為說明性的解釋而沒有限制的意思。參考文獻Anderson，etal.(1989a)J.Biol.Chem.264(21)12238-12242.Anderson，etal.(1989b)FirstInternationalSymposiumontheMolecularBiologyofthePotato，BarHarbor，Maine.apRees，etal.(1988)Symp.Soc.Exp.Biol.42377-393.Baker，S.S.，etal.(1994)PlantMol.Biol.24701-713.Barker，etal.(1983)PlantMol.Biol..2335-350.Bevan，etal.(1983)Nature(London)304184-187.Bevan，etal.(1986)NucleicAcidsRes.14(11)4625-4638.Bhave，etal.(1990)PlantCell2581-588.Birnboim，etal.(1979)NucleicAcidsRes.71513-1523.Blennow，etal.(1991)Phytochemistry30437-444.Burton，W.G.(1989)ThePotato.LongmanScientificandTechnical，Harlow，England，pp365-522Cattaneo，etal.(1969)Biochem.Biophys.Res.Commun.34(5)694-701.Chang，etal.(1978)J.Bacteriol.134；1141-1156.Claassen，etal.(1991)PlantPhysiol.951243-1249Coffin，etal.(1987)J.FoodSci.52639-645.Copeland，L.andJ.Preiss(1981)PlantPhysiol.68996-1001.Coruzzi，etal.(1984)EMBOJ.3(8)1671-1679.Creuzet-Sigal，etal.(1972)「GeneticAnalysisandBiochemicalCharacterizationofMutantsImpairingGlycogenMetabolisminEscherichiacoliK12」inBiochemistryoftheGlycosidicLinkageAnIntegratedView.EditedbyR.PirasandH.G.Pontis.647-680.NewYorkAcademicPressInc.Dickinson，D.B.andJ.Preiss(1969)PlantPhysiol.441058-1062.Ditta，etal.(1980)ProcNatlAcadSciUSA77，7347-7351.Dixon，etal.(1981)Phytochemistry20969-972.duJardin，P.andBerhin，A.(1991)PlantMol.Biol.16349-351.Ebbelaar，etal.(1993)Int.Symp.onGen.Manip.ofPlantMetabolismandGrowth，29-31March，NorwichUKAbstract#9.Ehrlich，H.A.(1989)Ed.PCRTechnology-PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification.StocktonPress，NewYork.Fling，etal.(1985)NucleicAcidsResearch13no.19，7095-7106.Fraley，etal.(1983)ProcNatlAcadSciUSA80，4803-4807.Fraley，etal.(1985)Bio/Technology3，629-635.Frohman，M.A.(1990)InPCRProtocols.Innis，M.A.，Gelfand，D.H.，Snincky，J.J.，andWhite，T.J.，eds.AcademicPress，SanDiego，CA.pp.28-38.Frohman，etal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA858998-9002.Ghosh，etal.(1966)J.Biol.Chem.241(19)4491-4504.Gilmour，etal.(1992)PlantMol.Biol.1813-21.Hajela，etal.(1990)PlantPhysiol.931246-1252.Hannapel，D.J.(1990)PlantPhysiol.94919-925.Hardenburg，etal.(1986)USDAAgric.HandbookNo66，pp66-68Haugen，etal(1976)J.Biol.Chem.251.(24)7880-7885Heldt，etal.(1977)PlantPhysiol.591146-1155.Houde，etal.(1992)PlantPhysiol.99(4)1381-1387.Huang，R.C.，etal.(1987)FEDProc.46(6)2238.Iglesias，etal.，(1993)J.BiolChem.2681081-1086.Jarret，etal.(1980a)Physiol.Plant.49177-184.Jarret，etal.(1980b)J.Amer.Soc.Hort.Sci.105238-242.Jarret，etal.(1981)InVitro17825-830.Jefferson，etal.1990.PlantMol.Biol.14995-1006.Kaiser，W.M.andJ.A.Bassham(1979)PlantPhysiol.63109-113.Kay，etal.(1987)Science2361299-1302.Koncz，C.andSchell，J.(1986)Mol.Gen.Genet.204383-396.Kossmann，etal.(1991)Mol.Gen.Genet.23039-44.Krishnan，etal(1986)PlantPhysiol.81642-645.Kruger，N.J.andHammond，J.B.W.(1988)PlantPhysiol.86645-648.Kurkela，etal.(1990)PlantMol.Biol.15137-144.Laemmli，U.K.(1970)Nature(London)227680-685.Leung，etal.(1986)J.Bact.167(1)82-88.Lin，etal.(1988a)PlantPhysiol.861131-1135.Lin，etal.(1988b)PlantPhysiol.881175-1181.Liu，X.J.，etal.(1990)Mol.Gen.Genet.223401-406.Loh，etal.(1989)Science243217-220.Lutckeetal.(1987)EMBOJ.6(1)43-48.Mignery，etal.(1988)GeneGene6227-44.Miller，J.H.(1972)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分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQIDNO20GGCCGAGCTCGTCAACGCCGTCTGCGATTTGTGC34(2)SEQIDNO21的信息(i)序列特徵(A)長度19鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQIDNO21GATTTAGGTGACACTATAG19(2)SEQIDNO22的信息(i)序列特徵(A)長度42鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQIDNO22AGAGAGATCTAGAACAATGGCTTCCTCTATGCTCTCTTCCGC42(2)SEQIDNO23的信息(i)序列特徵(A)長度39鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQIDNO23GGCCGAGCTCTAGATTATCGCTCCTGTTTATGCCCTAAC39(2)SEQIDNO24的信息(i)序列特徵(A)長度2196鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQIDNO24ATCGATTATTGGTTTATCGGGTTTTGATCGTTATCGGTTCGGTTTAACCGTTAAAATTTG60ACACAAAAATAAAAATTGAAAAGCACTTAGAAACAAGGTGACAAACCTAATAAACCATGC120ACATGAGTTCACAAGTTACATCTTGCTAAAAAACAAACACTTTTACATTGTAGAATAACC180AAGTGTCTGGGACAACCAAAAATGAAAGTAGGAAACCAAACTCTAAGTCAAGGACTTTAT240ATACAAAATGGTATAACTATAATTATTTAATTTACTATTGGGTTATCGGTTAACCCGTTA300AGAACCGATAACCCGATAACAAAAACAATCAAAATCGTTATCAAAACCGCTAAACTAATA360ACCCAATACTGATAAACCAATAACTTTTTTTTTATTCGGGTTATCGGTTTCAGTTCGGTT420TTGAACAATCCTAGTGTCCTAATTATTGTTTTGAGAACCAAGAAAACAAAAACTGACGTC480GCAAATATTTCAGTAAATACTTGTATATCTCAGTGATAATTGATTTCCAAGATGTATAAT540TATCATTTACGTAATAATAGATGGTTTCCGAAACTTACGCTTCCCTTTTTTCTTTTGCAG600TCGTATGGAATAAAGTTGGATATGGAGGCATTCCCGGGCCTTCAGGTGGAAGAGACGGAG660CTGCTTCACAAGGAGGGGGTTGTTGTACTTGAAAATAGGCATTTATTCCGTTCGCAAACC720TATCATGTTCCTATGGTTGTTTATTTGTAGTTTGGTGTTCTTAATATCGAGTGTTCTTTA780GTTTGTTCCTTTTAATGAAAGGATAATATCTCGTGCCAAAAATAAGCAAATTCGGTACAT840AAAGACATTTTTTTTCTTTCGTGGATTTTCTGTTTATGGAGTTGTCAAATGTGGAATTTA900TTTCATAGCATGTGGAGTTTCCTCCTCTCCTTTTTCATGTGCCCTTGGGCCTTGCCTGTT960TCTTGCACCGCAGTGTGCCAGGGCAGTCGGCAGATGGACATAAATGGCACACCGCTCGGC1020TCGTGGAAAGAGTATGGTCAGTTTCATTGATAAGTATTTACTCGTATTCGGCGTATACAT1080CAAGTTAATAGAAAGTAAACACATATGATATCATACATCCATTAGTTAAGTATAAATGCC1140AACTTTTTACTTGAATCGCTGAATAAATTTACTTACGATTAATATTTAGTTGTGTGTTCA1200AACATATCATGCATTATTTGATTAAGAATAAATAAACGATGTGTAATTTGAAAACCAATT1260AGAAAAGAAGTATGACGGGATTGATGTTCTGTGAAATCACTGGCAAATTGAACGGACGAT1320GAAATTTGATCGTCATTTAAACATATCAACATGGCTTTAGTCATCATCATTATGTTATAA1380TTATTTTCTTGAAACTTGATACACCAACTCTCATTGGGAAAGTGACAGCATAATATAAAC1440TATAATATCAATCTGGCAATTTCGAATTATTCCAAATCTCTTTTGTCATTTCATTTCATC1500CCCTATGTCTGCCTGCAAGTACCAATTATTTAAATACAAAAATCTTGATTAAACAATTCA1560TTTTCTCACTAATAATCACATTTAATAATAAACGGTTCATACACGTGCGTCACCTTTTTT1620TCGATTTTCTCTCAAGCGCATGTGATCATATCTAACTCTTGTGCAAACAAGTGAAATGAC1680GTCCATTAATAAATAATCTTTTGAATACCTGTTCATTTTAATTTATTTGGATTTGCTAAG1740GATTTTTTTTAGTTTTTGAGATTTTTTATAATTTTAAATTAAAAAAAATAAGTTAAATAT1800ATCGAAAATGTCTTTTAATCTTATTTTTGAAAAAGATAATTAGCTCAAACAAATTAAAAT1860TGGTAACTATTTTTCGGAAAAATAATGATTCTTATTGTACATTCTTTTTCATCGATTAGA1920TATTTTTTTTAAGCTCAAGTACAAAAGTCATATTTCAATCCCCAAAATAGCCTCAATCAC1980AAGAAATGCTTAAATCCCCAAAATACCCTCAATCACAAAAAGTGTACCAATCATAACTAT2040GGTCCTCTGTAAATTCCAACAAAATCAAGTCTATAAAGTTACCCTTGATATCAGTACTAT2100AAAACCAAAAATCTCAGCTGTAATTCAAGTGCAATCACACTCTACCACACACTCTCTAGT2160AGAGAAATCAGTTGATAACAAGCTTGTTAACAATG2196(2)SEQIDNO25的信息(i)序列特徵(A)長度591鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQIDNO25AAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCTCCTTAAAACTTTTTCTGAATTACT60TTTCAAGATTCTTGATTCTGCACCACTAGCAATTTCCATTTTTCTTTCAGTGATTTTGGT120TACTTATTTGACATTCTTGTTTTCAAGATCCAACATCATCACTTTCCAGGTTCAAAATCT180TGTTTTTTTTCTTTTTTCTTTTAATGCTCTATATTGTGGAAGTCCACAGGTGAATTTTTA240CGATATGGGTTTACCACTTAGCTTTCTTGTAATATTTTATCAATTTTAGAAAATATATGT300GTGAAATACCTAATTTTACGTAGAGATCATGGGTTCATATGCGTAAAGATTCATGTTTTT360GTGGTAATGCTATGAGGTATTAGTACTGAGCATATAGCTAGCTTGGGTTTTGGGTTTACC420GACCAAAAAAAAAAATTAGTGATATTTTCTTTATGTAAATTATACTTTTCTTGGTTGCTA480AAAGATAACATATACTTTATTGAGATTTGAATAAATCTATTTGATTTAGATCCATTGATA540AATCTTAATCTTATGGGATTACTGATTTGTTGATTGGCTGCAGAAGGATCC591(2)SEQIDNO26的信息(i)序列特徵(A)長度1705鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述$EQIDN026ACCGGGCCCCCCCTGGAGGTCGAGTGCCATCACATCCAGGGTGTAGGCTC60AAACTTGGTATCTGAGCTCAGAGTTCAAGAGTCTAAGGTGTCTATAAAGT120AGAGTCCTAGTTATCGGTGTGAAGCGCGCCACATCTATAACCAGGAGGCT180AGAATTATCATACTTCTTTCATACTCTTTTCGTGCAATAGAGTTCAACTC240CTTTATAATTCATGTTTACGCATATCTTTGAGATCATGCCTCCATGTAGA300GTCGTCCTGCTAGAAGAAATATTGATCCTCAGGATCAAGGGGTACCCAAT360TGCGACCCCAAGGAAAGGTCACTAATGTTGAGTTCCAGGATGTTATACGG420AAGTTGTGACCAACCAAGCTGGACAACAAAGAGGGAATCAACAAGATGTG480CCAGAATCCGTGAGTTCTTAAGGATGAATCCTTCAGACTTCACCAATTCA540AGGATCTGGAAAACTTTGTGGAAGAGTTGTAGAAGGTTTTTGAGGTTATG600ATGCTGAGCGAGTGGAACTAACTGCATACCAACTGAATGGTGTTGCTAGA660ACCAATAGAAAAAGAGTAGAGTTGAGGGTGCACAAATTGTGAGTTGGGCA720ACGCCTTCATGGGGCATTTCTTTTCCCATGAACTATATGGCAAAGGTAAG780CACTCTTAAGCAGGAATCCATGAGTGTGCATAAGTATAGCCTCAAGTTCA840GCCTATGCTCCAGAGATGGCTGTTGATATGAGGAGCAGGATGGGCTTGTT900TTGTCTCATCTGTCAATCAAAGAAGGTAAGGTTGTGATGTGGATAAAGGA960GAAAGGGTAATGATCCTTGTGCAACAGGTTGAGGAAGATAAGTTGAGGGA1020TTCTGAAACAAGAGGGCTAAGAACACATGAAATGAGTACGTAAGCAGAAG1080AGTAATGCAAATCGGTTATCTTTTCAATGAAAGCCAAATAAACCTGCTTGATTGTTTGCA1140AGTGCAACCTGTACCAACGAACAAAGGTGAGTTCAAGAATCAGAATTCTTAGAAATTCAG1200AGCTAGACCTGCACAATCTCAAGGTAGTGTGGCACAAGGATGTAATGGGACTCCTGCATG1260TGTTAAGTACGGTAGGAACCACCCAGGAGCGTGTCATGATGGCTCTGCTGGTTGCTTCAA1320GTGTGGTCAGAATGGTCACTTCATGAGAGAGTGCCTAAAGAANAGGCAAGGTAATAGCAA1380TGGGGGCAATATATCACAATCTTCTTCAGTGGCTCCACNAGATAGAGCTGCACCTTGAGG1440ATCATGGGTTCATATGCGTAAAGATTCATGTTTTGTGGTAATGCTATGAGGTATTAGTAC1500TGAGCATATAGCTAGCTTGGGTTTTGGGTTTACCGACCATTTTTTTTAATTAGTGATATT1560TTCTTTATGTATTTTATACTTTTCTTGGTTGCTTAAAGATTACATATACTTTATTGAGAT1620TTGAATAAATCTATTTGATTTAGATCCATTGATAAATCTTAATCTTATGGGATTACTGAT1680TTGTTGATTGGCTGCAGAAGGATCC170權利要求1.一種提高貯存在降低溫度下的馬鈴薯塊莖質量的方法，包括用重組的雙鏈DNA分子轉化馬鈴薯作物，在降低的溫度下貯存期間塊莖中提供增加水平的ADP葡萄糖焦磷酸化酶活性，該重組的雙鏈DNA分子包括(a)作用於馬鈴薯以致在塊莖中產生RNA序列的啟動子，(b)能產生RNA序列的結構DNA序列，其中的RNA序列編碼包括氨基末端質體傳輸肽和ADP葡萄糖焦磷酸化酶的融合多肽，和(c)作用於作物細胞以致轉錄終止和聚腺苷酸化的核苷酸加到RNA序列的3′端的3′非轉譯DNA序列；從這些轉化的馬鈴薯作物獲得塊莖，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是去調節的。2.權利要求1的方法，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是E.coliglgC酶。3.權利要求1的方法，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是突變的E.coli酶。4.權利要求3的方法，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶有SEQIDNO4中所示的序列。5.一種降低在低溫下貯存的馬鈴薯塊莖中糖含量的方法，包括用重組的雙鏈DNA分子轉化馬鈴薯作物，在降低溫度下貯存期間塊莖中提供增加水平的ADP葡萄糖焦磷酸化酶活性，該重組的雙鏈DNA分子包括(a)作用於馬鈴薯以致塊莖中產生RNA序列的啟動子，(b)能產生RNA序列的結構DNA序列，其中RNA序列編碼包括氨基末端質體傳輸肽和ADP葡萄糖焦磷酸化酶的融合多肽，和(c)作用於作物細胞以致轉錄終止和聚腺苷酸化的核苷酸加到RNA序列的3′端的3′非轉譯DNA序列；從這些轉化的馬鈴薯作物獲得塊莖，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是去調節的。6.權利要求5的方法，其中所述的ADPGPP酶是E.coliglgC酶。7.權利要求5的方法，其中所述的ADPGPP酶是突變的E.coli酶。8.權利要求7的方法，其中所述的ADPGPP酶有表示在SEQIDNO4中的序列。9.一個重組的雙鏈DNA分子，包括以下有效序列(a)作用於作物以致靶作物組織中產生RNA序列的冷誘導啟動子，(b)能產生RNA序列的結構DNA序列，該RNA序列編碼包括氨基末端質體傳輸肽和ADP葡萄糖焦磷酸化酶的融合多肽，和(c)作用於作物細胞以致轉錄端止和聚腺苷酸化的核苷酸加到RNA序列3′端的3′非轉譯DNA序列；其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是去調節的。10.權利要求9的DNA分子，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是E.coliglgC酶。11.權利要求9的DNA分子，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是突變的E.coli酶。12.權利要求11的DNA分子，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶有表示在SEQIDNO4中的序列。13.權利要求9的DNA分子，其中所述的啟動子來自馬鈴薯。14.一種包括重組的雙鏈DNA分子的馬鈴薯作物細胞，該重組體包括以下有效序列(a)作用於作物以致靶作物組織中產生RNA序列的冷誘導啟動子，(b)能產生RNA序列的結構DNA序列，該RNA序列編碼包括氨基末端質體傳輸肽和ADP葡萄糖焦磷酸化酶的融合多肽，和(c)作用於作物細胞以致轉錄端止和聚腺苷酸化的核苷酸加到RNA序列3′端的3′非轉譯DNA序列；其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是去調節的。15．權利要求14的馬鈴薯作物細胞，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是E．coliglgC酶。16．權利要求14的馬鈴薯作物細胞，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是突變的E．coli酶。17．權利要求16的馬鈴薯作物細胞，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶有表示在SEQIDNO4中的序列。18.權利要求14的馬鈴薯作物細胞，其中所述的啟動子來自馬鈴薯。19.一種由權利要求14的細胞組成的馬鈴薯作物。20.權利要求19的馬鈴薯作物，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是E.coliglgC酶。21.權利要求19的馬鈴薯作物，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是突變的E.coli酶。22.權利要求21的馬鈴薯作物，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶有表示在SEQIDNO4中的序列。23.權利要求19的馬鈴薯作物，其中所述的啟動子來自馬鈴薯。24.一種延長貯存馬鈴薯塊莖休眠期的方法，包括用重組的雙鏈DNA分子轉化馬鈴薯作物，在貯存期間塊莖中提供增加水平的ADP葡萄糖焦磷酸化酶活性，該重組的雙鏈DNA分子包括(a)作用於馬鈴薯以致在塊莖中產生RNA序列的啟動子，(b)能產生RNA序列的結構DNA序列，其中的RNA序列編碼包括氨基末端質體傳輸肽和ADP葡萄糖焦磷酸化酶的融合多肽，和(c)作用於作物細胞以致轉錄終止和聚腺苷酸化的核苷酸加到RNA序列的3′端的3′非轉譯DNA序列；從這些轉化的馬鈴薯作物獲得塊莖，其中所述的ADP葡萄糖焦磷酸化酶是去調節的。25.權利要求24的方法，其中所述的貯存是在降低的溫度下。26.權利要求25的方法，其中所述的ADPGPP酶是在冷誘導啟動子控制下的E.coliglgC酶。27.權利要求25的方法，其中所述的ADPGPP酶是在冷誘導啟動子控制下的突變的E.coli酶。28.權利要求27的方法，其中所述的ADPGPP酶有表示在SEQIDNO4中的序列。29.權利要求24的方法，其中所述的塊莖來自權利要求19的作物。全文摘要一種提高貯存在降低溫度下的馬鈴薯質量的方法和一種延長貯存馬鈴薯塊莖休眠期的方法，包括提高貯存在環境溫度或降低溫度期間的馬鈴薯塊莖中的ADP葡萄糖焦磷酸化酶的活性。提供新的DNA分子、作物細胞和馬鈴薯作物，其中ADP葡萄糖焦磷酸化酶的基因是在冷誘導啟動子控制下。文檔編號C12N15/54GK1127016SQ94192717公開日1996年7月17日申請日期1994年5月18日優先權日1993年5月28日發明者G·F·巴裡,G·M·吉索爾,D·M·施塔克,J·C·扎盧斯基申請人:孟山都公司