萘醌磷醯胺類化合物及其在作為細胞鐵死亡誘導劑中的用途的製作方法

2023-12-05 19:59:06

本發明涉及萘醌磷醯胺類化合物及其在作為細胞鐵死亡誘導劑中的用途。此外，本發明還涉及用此種化合物以及藥物組合物通過誘導細胞發生鐵死亡在疾病的治療中的用途。
背景技術：
：鐵死亡(ferroptosis)是2012年dixo等[dixonsj,lembergkm,lamprechtmr,etal.ferroptosis:aniron-dependentformofnonapoptoticcelldeath.cell,2012,149(5):1060-1072]新提出的一種由鐵依賴的氧化損傷引起的細胞死亡模式，在形態學、生物化學和遺傳學等方面與凋亡、壞死和自噬有較大區別。凋亡典型的特徵包括細胞皺縮、核濃縮、染色質邊集、dna降解、膜起泡、核和胞漿斷裂成凋亡小體，後被鄰近的細胞吞噬和降解。壞死的形態學特徵是細胞和細胞器腫脹、膜破裂、核染色體溶解而不是固縮，線粒體受損，隨後細胞溶解。自噬典型的特徵為細胞內出現大量泡狀結構，即雙層膜結構的自吞噬泡，吞噬泡內為胞質及細胞器，高爾基器、核糖體、內質網等均先於核的改變而被降解，但細胞骨架成分卻大部分保存。而鐵死亡的特徵為線粒體嵴消失及膜密度增加，同時表現為細胞質以及脂質活性氧自由基增多。鐵死亡主要是由鐵依賴的氧化損傷引起，涉及一系列複雜的生化反應、基因表達和信號傳導。dixon等最早發現這種細胞死亡模式與小分子誘導的ras腫瘤細胞死亡有關。新的研究(friedmannaj,schneiderm,etal.inactivationoftheferroptosisregulatorgpx4triggersacuterenalfailureinmice,natcellbiol.2014,16(12):1180-91.)指出鐵死亡通路還與許多病理過程有關，包括神經退行性疾病、腎功能衰竭、心血管疾病和糖尿病等。而鐵死亡誘導劑的發現對深入研究鐵死亡通路的生化機制，探討其在不同疾病模型中的作用，對相關疾病治療靶點的確證以及治療藥物的研究具有重要意義。目前已發現的鐵死亡誘導劑較少，主要包括以下兩類(caojy,dixonsj,mechanismsofferroptosis,cellmollifesci.2016,73(11-12):2195-209.)，a類抑制胱氨酸/穀氨酸反向轉運體(systemxc-)，b類抑制穀胱甘肽過氧化酶4(gpx4)。本發明人發現了一種新型鐵死亡誘導劑-萘醌磷醯胺類化合物，此類化合物誘導鐵依賴的細胞死亡方式，表現為活性氧增多，線粒體嵴消失及膜密度增加，同時發明人在動物體內也證實了此類化合物誘導鐵死亡的發生。技術實現要素：本發明的目的是提供一類新型鐵死亡誘導劑-萘醌磷醯胺類化合物，以及這些化合物作為細胞鐵死亡誘導劑在疾病治療中的用途。為了達到上述目的，本發明採用了以下技術手段：本發明的一種具有通式i的化合物及其溶劑化物、鹽、複合物、同質多形體、晶型、外消旋混合物、非對映體、對映非對映體、互變非對映體、同位素標記形式、前藥及其組合：其中，n為1-3的整數；r1為氫，c1-4烷基、c1-4烷氧基、滷素、c1-4滷代烷基、羥基、氰基、巰基、硝基或氨基；r2和r3滿足下述兩種情形之一：(1)r2和r3各自獨立地選自氫、烷基、滷代烷基、環烷基、烯基、炔基和芳基所組成的組；或者(2)r2和r3連同二者所連接的n原子共同形成5-6元雜環，所述5-6元雜環選自嗎啉基、硫嗎啉基、噻唑烷基、噁唑基、異噁唑基、咪唑烷基、哌啶基、吡咯烷基；所述雜環任選被一個或多個取代基取代，所述取代基各自獨立地選自由烷基、烯基、炔基和苯基所組成的組；r4為氫，c1-4烷基、c1-4烷氧基、滷素、c1-4滷代烷基、羥基、氰基、巰基、硝基或氨基。在本發明中，優選的，通式i中：n為1；r1為氫，甲基或滷素；r2和r3為滿足下述兩種情形之一，(1)r2和r3各自獨立地選自烷基、滷代烷基，或者(2)r2和r3連同二者所連接的n原子共同形成嗎啉基、硫嗎啉基、噻唑烷基、噁唑基、異噁唑基、咪唑烷基、哌啶基、吡咯烷基；r4為氫、c1-4烷基、c1-4烷氧基、滷素或羥基。更優選的，所述的具有通式i的化合物及其溶劑化物、鹽、複合物、同質多形體、晶型、外消旋混合物、非對映體、對映非對映體、互變非對映體、同位素標記形式、前藥及其組合選自於由下述化合物所組成的組：氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯、氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-甲基-1,4-萘醌)甲酯、氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(3-甲基-1,4-萘醌)甲酯、氨基-n,n-二-(2-溴乙基)氨基磷酸-2-(1,4-萘醌)甲酯、氨基嗎啉基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯、氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-溴-1,4-萘醌)甲酯、氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-甲巰基-1,4-萘醌)甲酯、氨基-n,n-二甲氨基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯、氨基-n-甲基哌嗪基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯、氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(7-甲基-1,4萘醌)甲酯，及其溶劑化物、鹽、複合物、同質多形體、晶型、外消旋混合物、非對映體、對映非對映體、互變非對映體、同位素標記形式、前藥及其組合。進一步的，本發明還提出了所述的具有通式i的化合物及其溶劑化物、鹽、複合物、同質多形體、晶型、外消旋混合物、非對映體、對映非對映體、互變非對映體、同位素標記形式、前藥及其組合在製備調節細胞脂質過氧化藥物中的應用。所述的具有通式i的化合物及其溶劑化物、鹽、複合物、同質多形體、晶型、外消旋混合物、非對映體、對映非對映體、互變非對映體、同位素標記形式、前藥及其組合在製備誘導細胞線粒體損傷藥物中的應用。所述的具有通式i的化合物及其溶劑化物、鹽、複合物、同質多形體、晶型、外消旋混合物、非對映體、對映非對映體、互變非對映體、同位素標記形式、前藥及其組合在製備鐵死亡誘導劑中的應用。以及具有通式i的化合物及其溶劑化物、鹽、複合物、同質多形體、晶型、外消旋混合物、非對映體、對映非對映體、互變非對映體、同位素標記形式、前藥及其組合在製備抗腫瘤藥物中的應用。綜上，本發明提出了一種新的鐵死亡的誘導劑，該誘導劑能夠誘導細胞發生鐵死亡，進而達到抑制細胞，特別是腫瘤細胞增殖的目的，本發明的提出為腫瘤疾病的治療提供了一種新的技術手段。附圖說明圖1為加入化合物1或化合物1+鐵鰲合劑dfx作用6小時以及12小時後顯微鏡下觀察的細胞狀態；圖2為加入化合物1或化合物1+鐵鰲合劑dfx作用6小時後加入二氫乙啶(dhe)的顯微鏡下觀察的細胞狀態；圖3為化合物1對線粒體形態的影響；圖4為對照組和給藥組小鼠的ptgs2mrna水平測定結果；圖5為對照組和給藥組小鼠的腫瘤大小。具體實施方式為了進一步闡述本發明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發明進行具體描述，不應當理解為對本發明的限制。實施例1：氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯(1)的製備反應條件：(a)pocl3,net3,ch2cl2,0℃-rt；(b)ch3i,k2co3,丙酮,回流；(c)liaih4,thf,回流；(d)lin(tms)2,,nh3,thf,-78℃至-20℃；(e)ce(nh4)2(no3)6,ch3cn,h2o,rt.按照以上路線合成得到目標化合物，該目標化合物為黃色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.11(m,2h,arh),7.77(m,2h,arh),7.06(s,1h,ch＝c-o),4.99(m,2h,ch2o),3.07(m,4h,2ch2ch2ch3),2.74(bs,2h,nh2),1.58(m,4h,2ch2ch2ch3),0.91(m,6h,2ch2ch2ch3)。實施例2：氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-甲基-1,4-萘醌)甲酯(2)的製備該目標化合物以1,4-二羥基-3-甲基-2-萘甲酸為原料，參照實施例1方法製備，得到黃色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.11(m,2h,arh),7.76(m,2h,arh),5.06(m,2h,ch2o),3.66(t,4h,2ch2ch2cl),3.47(dt,4h,2ch2ch2cl),3.02(bs,2h,nh2)，2.34(s,3h)。實施例3：氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(3-甲基-1,4-萘醌)甲酯(3)的製備該目標化合物以1,4-二羥基-3-甲基-2-萘甲酸為原料，參照實施例1方法製備，得到白色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.13(m,2h,arh),7.76(m,2h,arh),5.03(m,2h,ch2o),3.02(m,4h,2ch2ch2ch3),2.77(bs,2h,nh2),2.35(s,3h,c＝cch3),1.56(m,4h,2ch2ch2ch3),0.89(m,6h,2ch2ch2ch3)。實施例4:氨基-n,n-二-(2-溴乙基)氨基磷酸-2-(1,4-萘醌)甲酯(4)的製備該目標化合物以1,4-二羥基-2-萘甲酸為原料，參照實施例1方法製備，得到黃色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.10(m,2h,arh),7.77(m,2h,arh),7.03(t,1h,ch＝c-o),5.05(m,2h,ch2o),3.55(m,8h,2ch2ch2cl),2.98(bs,2h,nh2)。實施例5:氨基嗎啉基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯(5)的製備該目標化合物以1,4-二羥基-2-萘甲酸為原料，參照實施例1方法製備，得到褐色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.08(m,2h,arh),7.78(m,2h,arh),7.03(t,1h,ch＝c-o),5.01(m,2h,ch2o),3.68(t,4h,2ch2ch2o),3.23(dt,4h,2ch2ch2o),2.89(bs,2h,nh2)。實施例6:氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-溴-1,4-萘醌)甲酯(6)的製備該目標化合物以1,4-二羥基-3-溴-2-萘甲酸為原料，參照實施例1方法製備，得到黃色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.18(m,2h,arh),7.80(m,2h,arh),5.21(m,2h,ch2o),3.66(t,4h,2ch2ch2cl),3.48(dt,4h,2ch2ch2cl),2.97(bs,2h,nh2)。實施例7：氨基-n,n-二-(2-氯乙基)氨基磷酸-2-(3-甲巰基-1,4-萘醌)甲酯(7)的製備該目標化合物以1,4-二羥基-3-甲巰基-2-萘甲酸為原料，參照實施例1方法製備，得到黃色油狀物。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.10(m,2h,arh),7.75(m,2h,arh),5.21(m,2h,ch2o),3.66(t,4h,2ch2ch2cl),3.46(dt,4h,2ch2ch2cl),2.97(bs,2h,nh2)，2.74(s,3h，ch3s)。實施例8：氨基-n,n-二甲氨基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯(8)的製備該目標化合物以1,4-二羥基-2-萘甲酸為原料，參照實施例1方法製備，得到黃色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.01(m,2h,arh),7.73(m,2h,arh),7.04(t,1h,ch＝c-o),5.20(m,2h,ch2o),2.96(bs,2h,nh2)，2.82(s,6h，2nch3)。實施例9:氨基-n-甲基哌嗪基磷酸-2-(1,4萘醌)甲酯(9)的製備該目標化合物以1,4-二羥基-2-萘甲酸為原料，參照實施例1方法製備，得到黃色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.07(m,2h,arh),7.80(m,2h,arh),7.01(t,1h,ch＝c-o),5.03(m,2h,ch2o),3.38(t,4h,2ch2ch2n),3.05(dt,4h,2ch2ch2n),2.89(bs,2h,nh2)，2.73(s，3h，nch3)。實施例10:氨基-n,n-二正丙基氨基磷酸-2-(7-甲基-1,4萘醌)甲酯(11)的製備該目標化合物以1,4-二羥基-7-甲基-2-萘甲酸為原料，參照實施例1方法製備，得到黃色固體。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.57-8.01(m,3h,arh),7.02(s,1h,ch＝c-o),4.99(m,2h,ch2o),3.12(m,4h,2ch2ch2ch3),2.77(s，3h，ch3)，2.70(bs,2h,nh2),1.56(m,4h,2ch2ch2ch3),0.92(m,6h,2ch2ch2ch3)。實施例11：對所合成通式i類化合物進行細胞毒作用評價1)實驗方法：細胞株：hct116結腸癌細胞篩選方法：mtt法作用時間：48h2)結果細胞毒測試結果如下表1所示。表1：細胞毒測試結果(10μm化合物對細胞生長的抑制率)化合物編號抑制率化合物編號抑制率189.5％699.2％280.7％796.1％356.6％890.8％492.3％978.3％570.4％1088.1％由以上數據可以看出，通式i化合物對腫瘤細胞具有顯著的殺傷作用。通過研究發現這種殺傷作用與化合物誘導鐵死亡相關。實施例12：化合物1誘導的細胞死亡方式具有鐵依賴性1)實驗方法：將5×105個hct116細胞/孔鋪於6孔板中，待細胞生長至80％，分兩組，第一組加入化合物1(10μm)，第二組加入化合物1(10μm)同時加入鐵鰲合劑dfx(100μm)。作用6小時以及12小時後顯微鏡下觀察細胞狀態。2)實驗結果：加入化合物1或化合物1+鐵鰲合劑dfx作用6小時以及12小時後顯微鏡下觀察的細胞狀態如圖1所示。由圖1可知，鐵鰲合劑的加入可以抑制化合物1對hct116腫瘤細胞的殺傷作用，說明化合物1誘導的死亡方式具有鐵依賴性。實施例13：化合物1誘導的細胞死亡方式與氧自由基ros積累有關1)實驗方法：將5×105個hct116細胞/孔鋪於6孔板中，待細胞生長至80％，分兩組，第一組加入化合物1(10μm)，第二組加入化合物1(10μm)同時加入鐵鰲合劑dfx(100μm)。作用6小時後，加入二氫乙啶(dhe)，dhe可以被細胞內ros氧化為氧化乙啶插入dna中產生紅色螢光，螢光強度與細胞內ros的量正相關。染色30分鐘後，pbs漂洗兩次，每次5分鐘去除背景後螢光顯微鏡下觀察。2)實驗結果：加入化合物1或化合物1+鐵鰲合劑dfx作用6小時後加入二氫乙啶(dhe)的顯微鏡下觀察的細胞狀態如圖2所示。由圖2可知，化合物1促進了細胞氧自由基ros的積累，而dfx的加入可抑制化合物1誘導的ros積累，說明化合物1誘導的細胞死亡方式與氧自由基ros積累有關。實施例14：化合物1誘導細胞線粒體嵴消失及膜密度增加1)實驗方法：將5×105個hct116細胞/孔鋪於6孔板中，待細胞生長至80％，分兩組，第一組加入溶劑dmso，第二組加入化合物1(10μm)。作用8小時後收取細胞pbs洗兩次，加入戊二醛細胞固定液固定過夜後切片，透射電鏡觀察。2)實驗結果：化合物1對線粒體形態的影響如圖3所示。由圖3的透射電鏡結果可以看出，化合物1使細胞線粒體嵴消失且線粒體雙層膜密度增加。綜合以上化合物1誘導hct116細胞發生的死亡在形態及生化基礎上都與鐵死亡完全吻合。實施例15：化合物1誘導體內腫瘤細胞發生鐵死亡1)實驗方法：取15隻balb/c裸鼠(♀16-18g)，於右側背部肩胛骨處種植2×106個hct116細胞製作藥效檢測的小鼠模型，6-7天後成瘤，等待瘤體長到50-100mm3大小後隨機分組給藥。設置：對照組和給藥組(腹腔注射15mg/kg的化合物1)。2)實驗結果：ptgs2為鐵死亡發生的重要分子標誌物，其mrna水平的上調則預示細胞將發生鐵死亡。對對照組和給藥組小鼠的ptgs2mrna水平進行測定，結果如圖4所示，圖4結果表明，給藥組腫瘤組織中ptgs2的量顯著高於對照組，說明化合物1誘導體內腫瘤細胞發生鐵死亡。圖5為對照組和給藥組小鼠的腫瘤大小，由結果推測化合物1誘導腫瘤細胞發生鐵死亡，降低了腫瘤生長速度。當前第1頁12