從豆類生產可溶性蛋白溶液的製作方法

2023-12-05 09:29:46 3

本申請是分案申請，其母案的中國申請號是201180033726.x，國際申請號是pct/ca2011/000529，申請日是2011年5月9日。

相關申請的引用

本申請依據35usc119(e)，主張於2010年5月7日提交的美國臨時專利申請號61/344,013的優先權。

本發明涉及從豆類生產蛋白溶液，並涉及新的豆類蛋白產品。

背景技術：

在轉讓給其受讓人並通過引用將其公開內容併入本文的2009年10月21日提交的美國專利申請號12/603,087(美國專利公開號2010-0098818)和2010年10月13日提交的12/923,897(美國專利公開號2011-0038993)中，闡述了具有至少約60wt%(nx6.25)d.b.優選至少約90wt%的蛋白含量的大豆蛋白產品的生產，其在低ph值下產生透明的、熱穩定的溶液，並且可用於軟飲料以及其它含水體系的蛋白強化而無蛋白沉澱。

通過以下方法來生產大豆蛋白產品：用氯化鈣水溶液提取大豆蛋白源以引起大豆蛋白自蛋白源溶解，並形成大豆蛋白水溶液；使大豆蛋白水溶液與殘餘大豆蛋白源分離；任選稀釋所述大豆蛋白溶液；調節所述大豆蛋白水溶液ph至ph約1.5-約4.4，優選約2-約4，以產生酸化的澄清大豆蛋白溶液；任選通過用選擇性膜技術濃縮澄清的蛋白水溶液，同時保持離子強度基本上恆定；任選滲濾濃縮的大豆蛋白溶液；並任選乾燥濃縮並任選滲濾的大豆蛋白溶液。

技術實現要素：

業已發現可將該程序及其改良用於自包括扁豆(lentil)、鷹嘴豆(chickpea)、幹豌豆(drypea)和乾菜豆(drybean)在內的豆類形成酸性可溶性蛋白產品。

因此，本發明一個方面提供生產具有基於乾重基礎至少約60wt%、優選至少約90wt%(nx6.25)的豆類蛋白含量的豆類蛋白產品的方法，所述方法包括：

(a)用鈣鹽水溶液優選氯化鈣水溶液提取豆類蛋白源，以引起來自蛋白源的豆類蛋白溶解，並形成豆類蛋白水溶液；

(b)使豆類蛋白水溶液與殘餘豆類蛋白源分離；

(c)任選稀釋豆類蛋白水溶液；

(d)調節豆類蛋白水溶液ph至ph約1.5-約4.4優選約2-約4，以生產酸化豆類蛋白溶液；

(e)如果酸化豆類蛋白溶液不是業已澄清，任選將其澄清；

(f)作為從步驟(b)到(e)的備選，任選稀釋然後調節混合的豆類蛋白水溶液和殘餘豆類蛋白源的ph至ph約1.5-約4.4，優選約2-約4，然後使酸化(優選澄清)的豆類蛋白溶液與殘餘豆類蛋白源分離；

(g)任選通過選擇性膜技術濃縮豆類蛋白水溶液同時維持離子強度基本上恆定；

(h)任選滲濾濃縮的豆類蛋白溶液；和

(i)任選乾燥濃縮並任選滲濾的豆類蛋白溶液。

豆類蛋白產品優選為具有至少約90wt%、優選至少100wt%(nx6.25)d.b.的蛋白含量的分離物。

本發明進一步提供具有至少約60wt%、優選至少約90wt%、更優選至少約100wt%(nx6.25)d.b.的蛋白含量的新的豆類蛋白產品，其為水溶性並在低於約4.4的酸性ph值下形成熱穩定溶液，其對於包括軟飲料和運動飲料在內的含水體系中的蛋白強化有用而不導致蛋白沉澱。

在本發明另一方面，提供了在低於約4.4的ph下熱穩定的本文提供的豆類蛋白產品的水溶液。所述水溶液可以是飲料，其可能是澄清飲料，其中豆類蛋白產品完全溶解並且透明，或所述水溶液可以是不透明飲料，其中豆類蛋白產品對不透明性有或沒有貢獻。

按照本文方法生產的豆類蛋白產品不僅適合用於酸性介質的蛋白強化，還可用於多種蛋白產品的常規應用，包括但不限於加工食品和飲料的蛋白強化、油的乳化、作為烘烤食品成體劑(bodyformer)和截留氣體的產品的起泡劑。此外，豆類蛋白分離物可形成在仿肉製品中有用的蛋白纖維，並且可用作其中蛋清用作粘合劑的食品產品中的蛋清代替物或者增補劑。豆類蛋白產品也可以用在營養補充劑中。豆類蛋白產品的其它用途是在寵物食品、動物飼料和在工業和化妝品應用和個人護理產品中。

具體實施方式

提供豆類蛋白產品的方法的初始步驟涉及從豆類蛋白源溶解豆類蛋白。本發明可以應用的豆類包括扁豆、鷹嘴豆、幹豌豆和乾菜豆。豆類蛋白源可以是豆類或任何豆類產品或源自豆類加工的副產品，例如豆粉。從豆類蛋白源回收的豆類蛋白產品可以是在豆類中天然存在的蛋白，或所述蛋白性質材料可以是通過基因操作改良但具有天然蛋白的特徵性疏水特性和極性特性的蛋白。

最合宜用氯化鈣溶液實現從豆類蛋白源材料溶解蛋白，但其它鈣鹽溶液也可以使用。此外，可以使用其它鹼土金屬化合物，例如鎂鹽。進一步可用聯合另一鹽溶液例如氯化鈉的鈣鹽溶液實現從豆類蛋白源提取豆類蛋白。另外，可用水或其它鹽溶液例如氯化鈉實現從豆類蛋白源提取豆類蛋白，隨後向在提取步驟中產生的豆類蛋白水溶液中加入鈣鹽。在後續加工前移除加入鈣鹽時形成的沉澱物。

隨著鈣鹽溶液濃度增加，自豆類蛋白源溶解蛋白的程度開始增加，直至達到最大值。鹽濃度的任何後續的增加都不會增加溶解的總蛋白。引起蛋白溶解最大值的鈣鹽溶液濃度視所涉及的鹽而變化。通常優選利用小於約1.0m的濃度值，更優選的值是約0.10-約0.15m。

在分批過程中，在約1℃-約65℃、優選約15℃-約65℃、更優選約20℃-約35℃的溫度下發生蛋白的鹽溶解，優選伴隨攪拌以縮短溶解時間，其通常為約1-約60分鐘。優選實現溶解以從豆類蛋白源提取實質上儘量多的蛋白，以便提供總體的高產品收率。

在連續過程中，以與實現從豆類蛋白源連續提取蛋白一致的任何方式來實施從豆類蛋白源提取蛋白。在一個實施方案中，豆類蛋白源與鈣鹽溶液連續混合，通過具有一定長度的管道或導管並以一定流速駐留一定時間來傳送該混合物，所述長度、流速、駐留時間足以實現符合本文所述參數的期需提取。在所述連續程序中，在長達約10分鐘時間內迅速完成鹽溶解步驟，優選實現溶解以從豆類蛋白源提取實質上儘量多的蛋白。在約1℃-約65℃、優選約15℃-約65℃、更優選約20℃-約35℃的溫度下發生連續程序中的溶解。

通常在ph為約4.5-約11、優選約5-約7實施提取。可視需要通過使用任何合宜的食品級酸(通常是鹽酸或磷酸)或食品級鹼(通常是氫氧化鈉)，將提取體系(豆類蛋白源和鈣鹽溶液)的ph調節至用於提取步驟的約4.5-約11範圍內的任何期望值。

在溶解步驟期間鈣鹽溶液中的豆類蛋白源濃度可以變化很大。典型濃度值為約5-約15%w/v。

源自提取步驟的蛋白溶液通常具有約5-約50g/l的蛋白濃度，優選約10-約50g/l。

鈣鹽水溶液可以包含抗氧化劑。抗氧化劑可以是任何合宜的抗氧化劑，例如亞硫酸鈉或抗壞血酸。抗氧化劑的用量可為溶液的約0.01-約1wt%，優選約0.05wt%。抗氧化劑起抑制蛋白溶液中任何酚(phenolics)的氧化的作用。

然後可以以任何合宜的方式將得自提取步驟的水相與殘餘豆類蛋白源分離，例如通過使用傾析式離心，接著碟式離心和/或過濾，以移除殘餘豆類蛋白源材料。分離步驟通常在與蛋白溶解步驟相同的溫度下進行，但是可以在約1℃-約65℃、優選約15℃-約65℃、更優選約20℃-約35℃的範圍內的任何溫度下進行。或者，可將下述任選的稀釋和酸化步驟應用於豆類蛋白水溶液和殘餘豆類蛋白源的混合物，隨後通過上述分離步驟移除豆類蛋白源材料。可以乾燥分離的殘餘豆類蛋白源用於處理。或者，可處理分離的殘餘豆類蛋白源以回收一些殘餘蛋白，例如常規等電沉澱程序以回收所述殘餘蛋白。

可以用吸附劑例如粉末狀活性炭或顆粒狀活性炭來處理豆類蛋白水溶液，以去除顏色和/或氣味化合物。所述吸附處理可以在任何合宜的條件下進行，通常在分離的蛋白水溶液的環境溫度下。對於粉末狀活性炭，採用約0.025%-約5%w/v、優選約0.05%-約2%w/v的量。吸附劑可以通過任何合宜的方法例如通過過濾來除掉。

為了將豆類蛋白水溶液的電導率降低至通常低於約90ms、優選約4-約18ms的值，可用通常約0.5-約10倍體積、優選約0.5-約2倍體積的水稀釋得到的豆類蛋白水溶液。通常用水實現所述稀釋，但可使用具有高達約3ms電導率的稀鹽溶液，例如氯化鈉或氯化鈣。

與豆類蛋白溶液混合的水通常具有與豆類蛋白溶液相同的溫度，但是水可以具有約1℃-約65℃、優選約15℃-約65℃、更優選約20℃-約35℃的溫度。

然後通過加入任何適合的食品級酸(例如鹽酸或磷酸)，將稀釋的豆類蛋白溶液調節ph至約1.5-約4.4、優選約2-約4的值，以產生酸化的豆類蛋白水溶液，優選澄清的酸化豆類蛋白水溶液。

稀釋和酸化的豆類蛋白溶液具有通常低於約95ms、優選約4-約23ms的電導率。

如上所述，作為殘餘豆類蛋白源的較早分離的備選，可以任選一起稀釋和酸化豆類蛋白水溶液和殘餘豆類蛋白源材料，然後通過上述的任何合宜技術澄清酸化的豆類蛋白水溶液，並將其與殘餘豆類蛋白源物質分離。

可使酸化的豆類蛋白水溶液經歷熱處理以使熱不穩定的抗營養因子例如胰蛋白酶抑制劑失活，其因在提取步驟期間從豆類蛋白源材料提取而存在於所述溶液中。所述加熱步驟亦提供降低微生物負載的附加好處。通常將蛋白溶液加熱到溫度約70℃-約160℃，優選約80℃-約120℃，更優選約85℃-約95℃，持續約10秒-約60分鐘，優選約10秒-約5分鐘，更優選約30秒-約5分鐘。然後可使熱處理的酸化豆類蛋白溶液冷卻至約2℃-約65℃、優選約20℃-約35℃的溫度，用於下述進一步加工。

如果任選稀釋的、酸化和任選熱處理的豆類蛋白溶液不透明，則可通過任何合宜的程序例如過濾或離心來澄清。

可直接乾燥得到的酸化豆類蛋白水溶液來生產豆類蛋白產品。為了提供減少雜質含量並減少鹽含量的豆類蛋白產品，例如豆類蛋白分離物，在乾燥之前可以如下所述處理酸化的豆類蛋白水溶液。

可以濃縮酸化的豆類蛋白水溶液以增加其蛋白濃度，同時維持其離子強度基本上恆定。通常進行所述濃縮來提供具有約50-約300g/l、優選約100-約200g/l的蛋白濃度的濃縮的豆類蛋白溶液。

可以與分批或者連續操作一致的任何合宜方式進行濃縮步驟，例如通過使用任何合宜的選擇性膜技術，例如使用膜(例如中空纖維膜或纏繞膜)的超濾或滲濾，考慮到不同膜材料和結構，膜具有合適的分子量分離點(cut-off)，例如約3,000至約1,000,000道爾頓，優選約5,000至約100,000道爾頓，且對於連續操作，隨著蛋白水溶液通過膜，膜尺寸允許所需濃縮程度。

如眾所周知的，超濾和類似的選擇性膜技術允許低分子量物類通過膜，同時防止較高分子量物類通過膜。低分子量物類不僅包括鹽的離子物類，而且包括提取自源材料的低分子量物質，例如碳水化合物、色素、低分子量蛋白和抗營養因子，例如其本身是低分子量蛋白的胰蛋白酶抑制劑。考慮到不同膜材料和結構，通常選擇膜的分子量分離點以確保截留溶液中顯著比例的蛋白，同時允許汙染物通過。

然後可以用水或稀鹽水溶液使濃縮的豆類蛋白溶液經歷滲濾步驟。滲濾溶液可以是其天然ph或等於待滲濾的蛋白溶液ph的ph或是其間的任何ph值。可以用約2-約40體積的滲濾溶液、優選約5-約25體積的滲濾溶液進行所述滲濾。在滲濾操作中，通過使滲透物通過膜從豆類蛋白水溶液中移除更多量的汙染物。這純化了蛋白水溶液並亦可以降低其粘性。可以進行滲濾操作直至沒有顯著更多量汙染物和可見的顏色在滲透物中存在，或直至滲餘物充分純化以至當乾燥時提供具有至少約90wt%(nx6.25)d.b.的蛋白含量的豆類蛋白分離物。可以通過與濃縮步驟相同的膜進行所述滲濾。然而，如果需要，考慮不同膜材料和結構，可以用具有不同分子量分離點的分離膜進行滲濾步驟，例如具有約3,000-約1,000,000道爾頓、優選約5,000-約100,000道爾頓範圍內的分子量分離點的膜。

或者，可在濃縮或部分濃縮酸化的蛋白水溶液之前對酸化的蛋白水溶液應用滲濾步驟。在濃縮過程期間也可在多個點應用滲濾。當在濃縮或部分濃縮溶液之前應用滲濾時，可然後完全濃縮得到的滲濾的溶液。隨著蛋白溶液濃縮而通過多次滲濾實現粘性降低，這可以允許獲得較高的最終完全濃縮的蛋白濃度。這減少待乾燥的物質的體積。

本文中可進行濃縮步驟和滲濾步驟，其方式使得隨後回收的豆類蛋白產品含有低於約90wt%蛋白(nx6.25)d.b.，例如至少約60wt%蛋白(nx6.25)d.b.。通過部分濃縮和/或部分滲濾豆類蛋白水溶液，僅可部分除掉汙染物。然後可乾燥該蛋白溶液以提供具有較低純度水平的豆類蛋白產品。在酸性條件下該豆類蛋白產品高度可溶，並能夠生產蛋白溶液，優選為澄清的蛋白溶液。

在至少部分滲濾步驟期間，滲濾介質中可以存在抗氧化劑。抗氧化劑可以是任何合宜的抗氧化劑，例如亞硫酸鈉或抗壞血酸。在滲濾介質中使用的抗氧化劑的量取決於所用的物質，可為約0.01-約1wt%，優選約0.05wt%。抗氧化劑起抑制在濃縮的豆類蛋白分離物溶液中存在的任何酚的氧化的作用。

可以在任何合宜的溫度下進行濃縮步驟和任選滲濾步驟，一般為約2℃-約65℃，優選約20℃-約35℃，並持續一段時間以實現所期需的濃縮程度。所使用的溫度和其它條件某種程度上取決於用於進行膜處理的膜裝置、溶液的所期需的蛋白濃度和對滲透物的汙染物移除效率。

如上面提到的，豆類含有抗營養的胰蛋白酶抑制劑。在最終豆類蛋白產品中的胰蛋白酶抑制劑的活性水平可通過操控不同的處理變量來控制。

如上所述，酸化豆類蛋白水溶液的熱處理可以用於使熱不穩定的胰蛋白酶抑制劑失活。也可以對部分濃縮或完全濃縮的酸化豆類蛋白溶液熱處理以使熱不穩定的胰蛋白酶抑制劑失活。當熱處理用於部分濃縮的酸化豆類蛋白溶液時，然後可再濃縮得到的熱處理的溶液。

另外，濃縮和/或滲濾步驟可以以有利於移除滲透物中的胰蛋白酶抑制劑連同其它汙染物的方式操作。通過使用較大孔徑例如30,000-1,000,000da的膜，在高溫例如30℃-65℃下操作膜，並採用較大體積例如20-40體積的滲濾介質，來促進胰蛋白酶抑制劑的移除。

在較低ph例如1.5-3下酸化和膜處理豆類蛋白溶液，相對於在較高ph例如3-4.4下處理溶液可以降低胰蛋白酶抑制劑活性。當在ph範圍的低端濃縮和滲濾蛋白溶液時，可期望在乾燥前提高滲餘物的ph。可以通過添加任何合宜的食品級鹼例如氫氧化鈉，來將濃縮和滲濾的蛋白溶液的ph提高至所期需的值，例如ph3。

此外，可通過使豆類材料與破壞或重排抑制劑的二硫鍵的還原劑接觸，來實現胰蛋白酶抑制劑活性的降低。適合的還原劑包括亞硫酸鈉、半胱氨酸和n-乙醯半胱氨酸。

可在整個過程的不同階段添加所述還原劑。可以在提取步驟中給豆類蛋白源材料添加還原劑，可以向在移除殘餘豆類蛋白源材料之後的澄清的豆類蛋白水溶液中添加還原劑，可以向乾燥前的滲濾滲餘物中添加還原劑，或還原劑可與幹豆類蛋白產品幹混合。還原劑的添加可以與熱處理步驟和膜處理步驟聯合，其如上所述。

如果需要在濃縮的蛋白溶液中保留活性胰蛋白酶抑制劑，這可以通過以下方法來實現：消除或降低熱處理步驟的強度，不利用還原劑，在ph範圍例如3-4.4的高端操作濃縮和滲濾步驟，利用具有較小孔徑的濃縮和滲濾膜，在較低溫度下操作膜並採用較小體積的滲濾介質。

可以用吸附劑例如粉末狀的活性炭或顆粒狀的活性炭處理濃縮的和任選滲濾的蛋白水溶液，來去掉顏色和/或氣味化合物。可以在任何合宜的條件下進行所述吸附劑處理，通常在濃縮的蛋白溶液的環境溫度下。對於粉末狀的活性炭，使用量約0.025%-約5%w/v，優選約0.05%-約2%w/v。可以通過任何合宜的方式例如過濾從豆類蛋白溶液移除吸附劑。

可以通過任何合宜的技術例如噴霧乾燥或冷凍乾燥，來乾燥濃縮的和任選滲濾的豆類蛋白水溶液。可以在乾燥前對豆類蛋白溶液實施巴氏消毒步驟。所述巴氏消毒可以在任何所期需的巴氏消毒條件下進行。通常將濃縮和任選滲濾的豆類蛋白溶液加熱至約55℃-約70℃、優選約60℃-約65℃的溫度，持續約30秒-約60分鐘，優選約10分鐘-約15分鐘。然後可冷卻巴氏消毒的濃縮的豆類蛋白溶液用於乾燥，優選冷卻至約25℃-約40℃的溫度。

乾燥的豆類蛋白產品具有大於約60wt%的蛋白含量。優選乾燥的豆類蛋白產品是具有超過約90wt%蛋白的蛋白含量的分離物，優選至少約100wt%(nx6.25)d.b.。

本文中生產的豆類蛋白產品在酸性水環境中可溶，這使得可理想地將該產品摻入飲料(碳酸的和非碳酸的)中，以提供對其的蛋白強化。所述飲料具有大範圍的酸性ph值，介於約2.5-約5。可以以任何合宜的量將本文提供的豆類蛋白產品添加至所述飲料，以提供對所述飲料的蛋白強化，例如每份至少約5g的該豆類蛋白。添加的豆類蛋白產品在飲料中溶解，並且飲料的不澄清度不會因熱加工而增加。可以在通過溶於水復溶飲料之前，使幹飲料與豆類蛋白產品共混。在某些情況下，當飲料中存在的組分可能不利地影響本發明的組合物保持在飲料中溶解的能力時，可能需要修改飲料的正常配方以耐受本發明的組合物。

實施例

實施例1

本實施例評估了扁豆、鷹嘴豆和幹豌豆的蛋白提取性(extractability)，以及酸化對得自提取步驟的蛋白溶液澄清度的影響。

購買完整形式的幹扁豆、鷹嘴豆、黃莢豌豆(yellowsplitpea)和綠莢豌豆(greensplitpea)，用bamix切碎機碾磨至相對細的粉末形式。碾磨程度不受時間或粒徑控制。用0.15mcacl2(100ml)在磁力攪拌器上於室溫提取碾磨的材料(10g)達30分鐘。通過以10,200g離心10分鐘分離提取液和廢料，然後進一步通過用0.45μm孔徑的注射式濾器(syringefilter)過濾來澄清。用lecofp528定氮儀測試碾磨的起始材料和澄清的提取液的蛋白含量。通過測量600nm處吸光度(a600)來測定全強度(fullstrength)提取液和用1體積反滲純化(ro)水稀釋的提取液的澄清度。然後用hcl調節全強度和稀釋的溶液至ph3，再次測量a600。在通過a600測量評估溶液澄清度的本實施例和其它實施例中，用水作為分光光度計的空白。

表1中顯示了測定的每種蛋白源的蛋白含量和表觀提取性。

表1-蛋白源的蛋白含量和表觀提取性

如可從表1中的結果所見，所有蛋白源的表觀提取性都相當好。

表2中顯示了酸化前後全強度和稀釋的提取液樣品的澄清度。

表2-酸化對稀釋和未稀釋提取液樣品澄清度的影響-氯化鈣提取

如可從表2中的結果所見，來自扁豆、鷹嘴豆和莢豌豆的全強度提取液為澄清到輕微渾濁。未稀釋的酸化增加樣品中的濁度水平。用等體積水稀釋過濾後的提取液導致明顯沉澱和a600值相應增加。稀釋溶液的酸化使大部分沉澱再溶，對於扁豆和鷹嘴豆產生澄清溶液，對於黃莢豌豆和綠莢豌豆產生輕微渾濁溶液。

實施例2

本實施例含有酸化的、稀釋的或未稀釋的綠莢豌豆提取液的澄清度評估，其中用水和氯化鈉代替實施例1中氯化鈣溶液作為提取液。

購買完整形式的幹綠莢豌豆，用kitchenaid混合器碾磨器附件碾磨至細粉。碾磨程度不受時間或粒徑的控制。用0.15mnacl(100ml)或ro水(100ml)在磁力攪拌器上於室溫提取碾磨的材料(10g)達30分鐘。通過以10,200g離心10分鐘來分離提取液和廢料，然後進一步通過用0.45μm孔徑的注射式濾器過濾來澄清。通過測量600nm處吸光度來測定全強度提取液和用1體積ro水稀釋的提取液的澄清度。然後用hcl調節全強度溶液和稀釋溶液至ph3，再次測量a600。

表3中顯示了酸化前後全強度提取液和稀釋提取液樣品的澄清度。

表3-酸化對稀釋和未稀釋提取液樣品澄清度的影響-水和氯化鈉提取

如可從表3中的結果所見，用水或氯化鈉溶液製備的提取液酸化時無論是否採取稀釋步驟，都非常渾濁。

實施例3

本實施例評估了幾種類型幹豆的蛋白提取性以及酸化對得自提取步驟的蛋白溶液澄清度的影響。

購買完整、乾燥形式的花豆(pintobean)、小白豆(smallwhitebean)、小紅豆(smallredbean)、羅馬諾豆(romanobean)、大北豆(greatnorhernbean)和利馬豆(limabean)，用bamix切碎機碾磨至相對細粉形式。碾磨程度不受時間或粒徑的控制。也購買了黑豆粉。用0.15mcacl2(100ml)在磁力攪拌器上於室溫提取碾磨的材料或粉末(10g)達30分鐘。通過以10,200g離心10分鐘來分離提取液和廢料，然後進一步通過用0.45μm孔徑的注射式濾器過濾來澄清。用lecofp528定氮儀測試碾磨的起始材料或粉末和澄清提取液的蛋白含量。通過測量600nm處吸光度來測定全強度提取液和用1體積ro水稀釋的提取液的澄清度。然後用hcl調節全強度溶液和稀釋的溶液至ph3，再次測量a600。

表4顯示了測定的每個類型的幹豆的蛋白含量和表觀提取性。

表4-不同幹豆的蛋白含量和表觀提取性

如可從表4中的結果所見，所有類型的豆中的蛋白都容易提取。

表5顯示了酸化前後全強度提取液和稀釋的提取液樣品的澄清度。

表5-酸化對稀釋和未稀釋提取液樣品澄清度的影響-氯化鈣提取

如可從表5中的結果所見，所有豆的全強度提取物溶液均十分澄清。未稀釋的酸化輕微增加樣品濁度水平但是仍然保持十分澄清。用等體積水稀釋過濾的提取液未導致任何沉澱的形成。這與實施例1中所測豆類稀釋後所見的沉澱形成對比。當酸化時稀釋的豆蛋白溶液保持澄清。

實施例4

本實施例含有酸化的、稀釋的或未稀釋的小白豆提取液的澄清度評估，其中用水和氯化鈉代替實施例3中氯化鈣溶液作為提取溶液。

購買完整形式的幹小白豆，用bamix切碎機碾磨至細粉。碾磨程度不受時間或粒徑的控制。用0.15mnacl(100ml)或ro水(100ml)在磁力攪拌器上於室溫提取碾磨的材料(10g)達30分鐘。通過以10,200g離心10分鐘來分離提取液和廢料，然後進一步通過用0.45μm孔徑的注射式濾器過濾來澄清。用lecofp528定氮儀來測定濾液的蛋白含量。通過測量600nm處吸光度來測定全強度提取液和用1體積ro水稀釋的提取液的澄清度。然後用hcl調節全強度溶液和稀釋的溶液至ph3，再次測量a600。

用水和氯化鈉溶液提取分別提供了45.9%和61.5%的表觀提取性。表6顯示了酸化前後全強度提取液和稀釋的提取液樣品的澄清度。

表6-酸化對稀釋和未稀釋提取液樣品澄清度的影響-水和氯化鈉提取

如可從表6中的結果所見，無論酸化時是否採用稀釋步驟，用水或氯化鈉溶液製備的提取液都非常渾濁。

實施例5

本實施例闡明以小試規模(benchtopscale)生產綠豌豆蛋白分離物。

用kitchenaid混合器碾磨器附件精細碾磨180g幹綠莢豌豆。使150g精細碾磨的綠莢豌豆粉與1,000ml0.15mcacl2溶液在環境溫度混合，並攪拌30分鐘來提供蛋白水溶液。移除殘餘固體，通過離心和過濾來澄清得到的蛋白溶液，以生產具有1.83%重量的蛋白含量的濾後蛋白溶液。將655ml濾後蛋白溶液加到655mlro水中，用hcl溶液將樣品ph降低到3.03。

通過在具有10,000道爾頓分子量分離點的pes膜上濃縮，將稀釋的和酸化的蛋白提取液體積從1250ml降低至99ml。然後在相同的膜上用480ml的ro水滲濾96ml濃縮的蛋白溶液等分試樣。得到的酸化、滲濾、濃縮的蛋白溶液具有7.97%重量的蛋白含量，這表示經進一步加工的初始過濾後的蛋白溶液的產率為65.5wt%。使酸化、滲濾、濃縮的蛋白溶液乾燥，以生產發現具有95.69%(nx6.25)d.b.蛋白含量的產品。將該產品命名為gp701-01蛋白分離物。

生產8.30g的gp701-01。通過溶解足夠的蛋白粉以提供15mlro水中的0.48g蛋白來製備gp701-01的溶液，用ph計測量ph，用hunterlabcolorquestxe儀器以透射模式操作來評估顏色和澄清度。結果顯示於下表7中。

表7-gp701-01溶液的ph和hunterlab評分

如可從表7中的結果所見，gp701-01溶液是半透明的，並具有淺色。

將gp701-01溶液加熱至95℃，保持在該溫度30秒，然後立即在冰浴中冷卻至室溫。用hunterlab儀器再次測量澄清度，結果示於表8中。

表8-熱處理後的gp701-01溶液的hunterlab評分

如可從表8中的結果所見，發現熱處理提高亮度，並降低溶液濁度水平，同時使其更綠和黃色更淡。雖然溶液濁度水平降低，但蛋白溶液仍然是半透明而不是透明的。

實施例6

本實施例闡明以小試規模但是將過濾步驟移到提取液稀釋和酸化之後地生產綠豌豆蛋白分離物。

用kitchenaid混合器碾磨器附件精細碾磨180g幹綠莢豌豆。使150g精細碾磨的綠莢豌豆粉與1,000ml0.15mcacl2溶液在環境溫度混合，並攪拌30分鐘以提供蛋白水溶液。通過離心移除殘餘固體以生產具有2.49%重量的蛋白含量的離心濾液(centrate)。將800ml離心濾液加到800ml水中，用稀hcl將樣品ph降低到3.00。通過過濾進一步澄清稀釋的和酸化的離心濾液，以提供具有1.26%重量的蛋白含量的澄清蛋白溶液。通過在稀釋和酸化後過濾，與實施例5中稀釋和酸化的濾液的0.093相比，在該試驗中膜處理前溶液的a600是0.012。

通過在具有10,000道爾頓分子量分離點的pes膜上濃縮，將過濾後蛋白溶液體積從1292ml降低至157ml。然後在相同的膜上用600ml的ro水滲濾120ml濃縮蛋白溶液等分試樣。得到的酸化、滲濾、濃縮的蛋白溶液具有7.70%重量的蛋白含量，這表示進一步處理的初始離心濾液產率為42.5wt%。使酸化、滲濾、濃縮的蛋白溶液乾燥，以生產發現具有94.23%(nx6.25)d.b.蛋白含量的產品。將該產品命名為gp701-02蛋白分離物

生產8.55g的gp701-02。通過溶解足夠的蛋白粉末以提供15mlro水中的0.48g蛋白來製備gp701-02的溶液，用ph計測量ph，用hunterlabcolorquestxe儀器在透射模式下操作來評估顏色和澄清度。結果示於下表9中。

表9-gp701-02溶液的ph和hunterlab評分

如可從表9中的結果所見，gp701-02溶液是半透明的並且具有淺色。濁度水平較實施例5中gp701-01溶液所測定的低。

將gp701-02溶液加熱至95℃，保持在該溫度30秒，然後立即在冰浴中冷卻至室溫。用hunterlab再次測量澄清度，結果示於下表10中。

表10-熱處理後的gp701-02溶液的hunterlab評分

如可從表10中的結果所見，熱處理gp701-02溶液導致溶液極其澄清。

實施例7

本實施例闡明以小試規模生產小白豆蛋白分離物。

用kitchenaid混合器碾磨器附件精細碾磨約150g小白豆。使120g精細碾磨的小白豆粉與1,000ml0.15mcacl2溶液在環境溫度混合，攪拌30分鐘以提供蛋白水溶液。移除殘餘固體，通過離心和過濾來澄清所得到的蛋白溶液，以生產具有2.02%重量蛋白含量的濾後蛋白溶液。將600ml濾後蛋白溶液加到600mlro水中，用稀釋的hcl將樣品ph降低到3.01。ph調節後可以在樣品中看見一些纖細顆粒，通過使樣品通過25μm孔徑的濾紙來去除它們。

然後通過在具有10,000道爾頓分子量分離點的pes膜上濃縮，將稀釋的和酸化的蛋白提取液樣品體積從1110ml降低至82ml。然後在相同的膜上用395ml的ro水滲濾79ml的滲餘物等分試樣。所得到的酸化、滲濾、濃縮蛋白溶液具有10.37%重量的蛋白含量，其表示進一步處理的初始過濾的蛋白溶液產率為67.6wt%。使酸化、滲濾、濃縮的蛋白溶液乾燥，以生產發現具有93.75%(nx6.25)d.b.蛋白含量的產品。將該產品命名為swb701蛋白分離物。

生產8.26g的swb701。通過溶解足夠的蛋白粉末以提供15mlro水中的0.48g蛋白來製備swb701的溶液，用ph計測量ph，用hunterlabcolorquestxe儀器以透射模式操作來評估顏色和澄清度。結果示於下表11中。

表11-swb701溶液的ph和hunterlab評分

如可從表11中的結果所見，swb701溶液是半透明的並具有淺色。

將swb701溶液加熱至95℃，保持在該溫度30秒，然後立即在冰浴中冷卻至室溫。用hunterlab儀器再次測量澄清度，結果在表12中顯示

表12-熱處理後的swb701溶液的hunterlab評分

如可從表12中的結果所見，發現熱處理提高亮度並降低溶液濁度水平，同時使其更綠且黃色更淡。雖然溶液濁度水平降低，但蛋白溶液仍然是半透明的而不是透明的。

實施例8

本實施例含有實施例6的方法生產的gp701-02和實施例7的方法生產的swb701在水中的溶解性的評估。用morr等,j.foodsci.50:1715-1718的程序的改良版測試溶解性。

稱量足夠量的蛋白粉末以提供0.5g蛋白到燒杯中，然後加入大約45ml反滲(ro)純化水。用磁力攪拌器慢慢攪拌燒杯內容物60分鐘。在將蛋白分散後立即測定ph，用稀naoh或hcl調節至適當的水平(2、3、4、5、6或7)。也在天然ph下製備樣品。對於調節了ph的樣品，在60分鐘攪拌期間定期測量並校正ph。攪拌60分鐘後，用ro水將樣品補足至50ml總體積，得到1%w/v的蛋白分散體。用lecofp528定氮儀測量分散體的蛋白含量。然後以7,800g離心分散體等分試樣10分鐘，這使不溶材料沉澱。然後用leco分析測定上清液的蛋白含量。

然後用以下公式計算蛋白溶解性：

溶解性(%)=(上清液中蛋白%/初始分散體中蛋白%)x100

下表13顯示實施例6和7生產的蛋白分離物的天然ph值：

表13-在水中製備的1%w/v蛋白樣品的天然ph

獲得的溶解性結果列於下表14：

表14-不同ph值下產品的溶解性

如可從表14中的結果所見，在ph2-4範圍內701產品兩者均極其可溶。

實施例9

本實施例含有由實施例6的方法生產的gp701-02和由實施例7的方法生產的swb701在水中的澄清度的評估。

通過在hunterlabcolorquestxe儀器上以透射模式操作分析樣品來評估如實施例8所述製備的1%w/v蛋白分散體的澄清度，以提供濁度讀數百分比。評分越低表示澄清度越高。

澄清度結果列於下表15中：

表15-通過hunterlab分析評估的不同ph值下的溶液澄清度

如可從表15中的結果所見，gp701-02溶液在ph2-4範圍內基本上澄清或輕微渾濁。gp701-02溶液在溶解性降低的較高ph值下渾濁。swb701溶液在ph2下未檢測到渾濁，但是隨著ph增加顯著更渾濁。值得注意的是在ph3-4範圍內即使溶液不澄清但蛋白溶解性仍然非常高。

實施例10

本實施例闡明以小試規模生產黑豆蛋白產品。

使50g黑豆粉與500ml0.15mcacl2溶液在環境溫度混合，攪拌30分鐘以提供蛋白水溶液。移除殘餘固體，通過離心和過濾來澄清得到的蛋白溶液，以生產具有1.18%重量的蛋白含量的濾後蛋白溶液。將450ml濾後蛋白溶液加到450mlro水中，用稀釋的hcl將樣品ph降低到3.09。

然後通過在具有10,000道爾頓分子量分離點的pes膜上濃縮，將稀釋的和酸化的蛋白提取液體積從900ml降低至50ml。在相同的膜上用200ml的ro水滲濾40ml滲餘物等分試樣。所得酸化、滲濾、濃縮的蛋白溶液具有6.23%重量的蛋白含量，其表示進一步處理的初始過濾的蛋白溶液產率為約46.9wt%。使酸化、滲濾、濃縮的蛋白溶液乾燥，以生產發現具有86.33%(nx6.25)d.b.蛋白含量的產品。將該產品命名為bb701。

生產2.19g的bb701。通過溶解足夠的蛋白粉末以提供15mlro水中的0.48g蛋白來製備bb701的溶液，用ph計測量ph，用hunterlabcolorquestxe儀器以透射模式操作來評估顏色和澄清度。結果示於下表16中。

表16-bb701溶液的ph和hunterlab評分

如可從表16中的結果所見，bb701溶液是半透明的，並具有淺色。

將bb701溶液加熱至95℃，保持在該溫度30秒，然後立即在冰浴中冷卻至室溫。用hunterlab儀器再次測量澄清度，結果在表17中顯示。

表17-熱處理後的bb701溶液的hunterlab評分

如可從表17中的結果所見，發現熱處理提高亮度，並且降低溶液濁度水平，同時使其紅色和黃色更淡。雖然溶液濁度水平降低，但蛋白溶液仍然渾濁而不是透明的。

實施例11

本實施例闡明以中試規模生產黃豌豆蛋白分離物。

使20kg黃莢豌豆粉與200l0.15mcacl2溶液在環境溫度混合，並攪拌30分鐘以提供蛋白水溶液。通過離心移除殘餘固體，以生產具有1.53%重量的蛋白含量的離心濾液。將180.4l離心濾液加到231.1lro水中，用稀釋的hcl將樣品ph降低至約3。通過過濾進一步澄清稀釋的和酸化的離心濾液，以提供具有0.57%重量的蛋白含量並具有2.93的ph的澄清蛋白溶液。

通過在具有100,000道爾頓分子量分離點的pes膜上濃縮，將過濾後蛋白溶液體積從431l降低至28l，其在約30℃的溫度操作。此時用252lro水滲濾具有6.53%重量的蛋白含量的酸化蛋白溶液，其中滲濾操作在約30℃執行。然後進一步濃縮所得滲濾的溶液，以提供21kg具有7.62%重量的蛋白含量的酸化、滲濾、濃縮的蛋白溶液，其表示進一步處理的初始離心濾液產率為58.0wt%。使酸化、滲濾、濃縮的蛋白溶液乾燥，以生產發現具有103.27%(nx6.25)d.b.蛋白含量的產品。將該產品命名為yp01-d11-11ayp701蛋白分離物。

實施例12

本實施例含有由實施例11的方法生產的黃豌豆蛋白分離物和稱為propulse的市售黃豌豆蛋白產品(nutripea,portagelaprairie,mb)的蛋白和植酸含量以及胰蛋白酶抑制劑活性的評估。

通過用lecotruspecn定氮儀的燃燒法來測定蛋白含量。用latta和eskin(j.agric.foodchem.,28:1313-1315)的方法來測定植酸含量。用aocs法ba12-75測定市售蛋白樣品的胰蛋白酶抑制劑活性(tia)，並用此方法的改良版測定在重新水化時具有較低ph的yp701產品的tia。

獲得的結果列於下表18中：

表18-蛋白產品的蛋白含量、植酸含量和胰蛋白酶抑制劑活性

如可從表19中的結果所見，與市售產品相比，yp701的蛋白非常高，植酸低。兩種產品的胰蛋白酶抑制劑活性都非常低。

實施例13

本實施例含有由實施例11的方法生產的黃豌豆蛋白分離物和稱為propulse的市售黃豌豆蛋白產品(nutripea,portagelaprairie,mb)的幹顏色和溶液顏色的評估。

用hunterlabcolorquestxe儀器以反射模式評估乾粉末顏色。顏色值結果列於下表19中：

表19-幹蛋白產品的hunterlab評分

如可從表19中所見，yp01-d11-11ayp701粉末與市售黃豌豆蛋白產品相比更亮，紅色和黃色更淡。

通過溶解足夠的蛋白粉末以提供15mlro水中的0.48g蛋白來製備黃豌豆蛋白產品的溶液。用ph計測量溶液ph，用hunterlabcolorquestxe儀器以透射模式操作來評估顏色和澄清度。添加鹽酸溶液到propulse樣品來降低ph到3，然後重複測量。結果示於下表20中。

表20-黃豆蛋白產品溶液的ph和hunterlab評分

如可從表20中的結果所見，yp01-d11-11ayp701溶液是透明的，同時無論ph怎樣propulse溶液都是非常渾濁的。無論ph怎樣，yp01-d11-11ayp701溶液還都較propulse溶液亮得多，紅色和黃色更淡。

實施例14

本實施例含有由實施例11的方法生產的黃豌豆蛋白分離物和稱為propulse的市售黃豌豆蛋白產品(nutripea,portagelaprairie,mb)在水中的熱穩定性的評估。

在ro水中製備2%w/v的yp01-d11-11ayp701和propulse蛋白溶液。用ph計測定溶液的天然ph。每種樣品分成兩份，一份的ph用hcl溶液降低至3.00。通過用hunterlabcolorquestxe儀器以透射模式操作進行濁度測量來評估對照和ph調節了的溶液的澄清度。然後將溶液加熱至95℃，在此溫度保持30秒，然後立即在冰浴中冷卻至室溫。然後再次測量熱處理的溶液的澄清度。

加熱前後的蛋白溶液的澄清度列於下表21中：

表21-熱處理對黃豌豆蛋白產品的2%w/v蛋白溶液澄清度的影響

如可從表21中的結果所見，加熱前後在兩種ph水平下yp01-d11-11ayp701溶液都是透明的。加熱前後在兩種ph水平下propulse溶液都是高度渾濁的。

實施例15

本實施例含有由實施例11的方法生產的黃豌豆蛋白分離物和稱為propulse的市售黃豌豆蛋白產品(nutripea,portagelaprairie,mb)在水中的溶解性的評估。基於蛋白溶解性(稱為蛋白法，morr等,j.foodsci.50:1715-1718的程序的改良版)和總產品溶解性(稱為沉澱物法)來測試溶解性。

稱量足夠量的蛋白粉末以提供0.5g蛋白到燒杯中，然後加入少量反滲(ro)純化水，攪拌混合物至形成光滑糊狀物。然後添加額外的水至體積大約45ml。然後用磁力攪拌器慢慢攪拌燒杯內容物60分鐘。在將蛋白分散後立即測定ph，用稀釋的naoh或hcl調節至適當的水平(2、3、4、5、6或7)。也在天然ph下製備樣品。對於調節了ph的樣品，在60分鐘攪拌期間定期測量並校正ph。攪拌60分鐘後，用ro水將樣品補足至50ml總體積，產生1%w/v的蛋白分散體。用lecotruspecn定氮儀測量分散體的蛋白含量。然後將等分試樣的分散體(20ml)轉移到預先稱重並且在100℃烘箱中乾燥過夜然後在乾燥器中冷卻的離心管中，將管子合上蓋。於7,800g離心樣品10分鐘，其沉澱不溶材料，產生澄清的上清液。然後通過leco分析測量上清液的蛋白含量，然後棄去管蓋和上清液，將沉澱物材料在設為100℃的烘箱中乾燥過夜。次日早晨將管子轉移到乾燥器並使其冷卻。記錄乾燥沉澱物材料的重量。通過將所使用的粉末重量乘以係數((100-粉末水分含量(%))/100)來計算初始蛋白粉末的乾重。然後用兩種不同的方法計算產品的溶解性：

1)溶解性(蛋白法)(%)=(上清液中的蛋白%/初始分散體中的蛋白%)x100

2)溶解性(沉澱物法)(%)=(1-(不溶沉澱物材料乾重/((20ml分散體重量/50ml分散體重量)x初始蛋白粉末乾重)))x100

表22中顯示實施例11生產的蛋白分離物和市售黃豌豆蛋白產品在水中(1%蛋白)的天然ph值：

表22-在水中製備的1%蛋白的yp01-d11-11ayp701和propulse溶液的天然ph

獲得的溶解性結果列於下表23和24中：

表23-基於蛋白法的不同ph值下產品的溶解性

表24-基於沉澱物法的不同ph值下產品的溶解性

如可從表23和24中的結果所見，yp01-d11-11ayp701在ph2-4範圍內高度可溶，ph值越高越不可溶。在所有測試的ph值下propulse可溶性非常差。

實施例16

本實施例含有由實施例11的方法生產的黃豌豆蛋白分離物和稱為propulse的市售黃豌豆蛋白產品(nutripea,portagelaprairie,mb)在水中的澄清度的評估。

通過測量600nm處吸光度評估如實施例15中所述製備的1%w/v蛋白溶液的澄清度，其中較低吸光度評分表明較大澄清度。在hunterlabcolorquestxe儀器上以透射模式進行樣品分析也提供了濁度讀數百分比，這是澄清度的另一種度量。

澄清度結果列於下表25和26中：

表25-通過a600評估的不同ph值下蛋白溶液的澄清度

表26-通過hunterlab濁度分析評估的不同ph值下蛋白溶液的澄清度

如可從表25和26中的結果所見，yp01-d11-11ayp701溶液在ph2-4範圍內是透明的，但是在較高ph值下非常渾濁。propulse溶液無論ph怎樣都非常渾濁。

實施例17

本實施例含有由實施例11的方法生產的黃豌豆蛋白分離物和稱為propulse的市售黃豌豆蛋白產品(nutripea,portagelaprairie,mb)在軟飲料(sprite)和運動飲料(orangegatorade)中的溶解性的評估。用加入蛋白未校正ph的飲料和也用將ph調節到原始飲料水平的蛋白強化飲料來測定溶解性。

當用未校正ph來評估溶解性時，稱量足夠量的蛋白粉末以提供1g蛋白到燒杯中，加入少量飲料，攪拌至形成光滑糊狀物。添加額外的飲料至體積為50ml，然後在磁力攪拌器上慢慢攪溶液60分鐘以產生2%w/v的蛋白分散體。用lecotruspecn定氮儀分析樣品的蛋白含量，然後使含有蛋白的飲料等分試樣於7,800g離心10分鐘，測量上清液的蛋白含量。

溶解性(%)=(上清液中的蛋白%/初始分散體中的蛋白%)x100。

當用ph校正評估溶解性時，測量無蛋白的軟飲料(sprite)的ph(3.42)和運動飲料(orangegatorade)的ph(3.11)。稱量足夠量的蛋白粉末以提供1g蛋白到燒杯中，加入少量飲料，攪拌至形成光滑糊狀物。添加額外的飲料至體積大約45ml，然後在磁力攪拌器上慢慢攪拌溶液60分鐘。在將蛋白分散後立即測定含有蛋白的飲料的ph，並視需要用hcl或naoh調節至原始無蛋白的ph。在60分鐘攪拌期間定期測量並校正ph。攪拌60分鐘後，將每個溶液用額外的飲料添加至50ml總體積，產生2%w/v的蛋白分散體。用lecotruspecn定氮儀分析樣品的蛋白含量，然後使含有蛋白的飲料等分試樣於7,800g離心10分鐘，測量上清液的蛋白含量。

溶解性(%)=(上清液中的蛋白%/初始分散體中的蛋白%)x100

獲得的結果列於下表27中：

表27-sprite和orangegatorade中黃豌豆蛋白產品的溶解性

如可從表27中的結果所見，yp01-d11-11ayp701在sprite和orangegatorade中高度可溶。由於yp701是酸化產品，故它的添加不會顯著改變飲料的ph。propulse在測試的飲料中溶解性非常差。加入propulse增加飲料ph，但是通過降低飲料ph返回至其原始無蛋白值不提高蛋白的溶解性。

實施例18

本實施例含有由實施例11的方法生產的黃豌豆蛋白分離物和稱為propulse的市售黃豌豆蛋白產品(nutripea,portagelaprairie,mb)在軟飲料和運動飲料中的澄清度的評估。

實施例17中在軟飲料(sprite)和運動飲料(orangegatorade)中製備的2%w/v蛋白分散體的澄清度用實施例16中描述的a600和hunterlab濁度法評估。

獲得的結果列於下表28和29：

表28-sprite和orangegatorade中黃豌豆蛋白產品的a600讀數

表29-sprite和orangegatorade中黃豌豆蛋白產品的hunterlab濁度讀數

如可從表28和29中的結果所見，添加yp01-d11-11ayp701到軟飲料和運動飲料中幾乎不增加或不增加濁度，而添加propulse甚至在校正ph時也使飲料非常渾濁。

公開內容概述

在本公開內容概述中，本發明提供了新的豆類蛋白產品，其完全可溶，並在酸性ph下形成熱穩定的優選透明的溶液，其可用於在包括軟飲料和運動飲料在內的含水體系的蛋白強化而不導致蛋白沉澱。落入本發明範圍內的改良是可能的。