Taci-免疫球蛋白融合蛋白製劑的製作方法

2023-12-05 18:35:11

專利名稱：Taci-免疫球蛋白融合蛋白製劑的製作方法
技術領域：
本發明屬於治療蛋白質製劑領域。更具體說，本發明涉及pH範圍為4. 5-5. 5的 TACI-免疫球蛋白(Ig)融合蛋白製劑。
背景技術：
BLyS配體/警體家族業已鑑定到對於BlyS(B淋巴細胞刺激劑)和APRIL( —種誘導增殖的配體)兩 種生長因子具有獨特結合親和力的三種受體TACI (跨膜激活劑和CAML-相互作用子)、 BCMA(B細胞成熟抗原)和BAFF-R(B細胞活化因子受體)(Marsters等.，2000 ；Thompson 等 2001)。TACI和BCMA能結合BLyS與APRIL 二者，而BAFF-R看來只能高親和力結合 BLyS (Marsters等.，2000 ；Thompson等.2001)。因此，BLyS能通過所有這三種受體傳導信 號，而APRIL看來只能通過TACI和BCMA傳導信號。此外，在全身免疫性風溼病患者的血清 樣品中已鑑定到循環性BLyS與APRIL的異質三聚體複合物(由三個蛋白亞基組成，含有 BLyS和APRIL亞基的一個或二個拷貝)，並證明其在體外能誘導B細胞增殖(Roschke等， 2002)。BLyS和APRIL是B細胞成熟、增殖和存活的強效刺激劑(Moore等，1999 ； Schneider等，1999 ;Do等，2000)。BLyS和APRIL是自身免疫性疾病(特別是涉及B細胞 的自身免疫性疾病)持續存在所必需的。經工程改造能高水平表達BLyS的轉基因小鼠顯 示可患免疫細胞疾病，其症狀類似於全身性紅斑狼瘡患者所見(Gross等，2000 ；Mackay等， 1999)。類似地，檢測到全身性紅斑狼瘡病人和其它各種自身免疫性疾病如類風溼關節炎 病人血清樣品中 BLyS/APRIL 水平升高(Roschke, 2002 ；Cheema 等，2001 ；Groom 等，2002)， 從而使BLyS和/或APRIL與B細胞介導疾病的關聯從動物模型擴展到人類。MS病人外 周血單核細胞和T細胞的BLyS和APRIL表達上調(Thangarajh等，2004 ；Thangarajh等， 2005)。在MS病損中發現位於靠近表達BAFF-R免疫細胞的星形細胞中BLyS表達強烈上調 (Krumbholz 等，2005)。AtaciceptAtacicept (INN)是一種重組融合蛋白，含有受體TACI (跨膜激活劑和鈣調節 劑及親環素-配體(CAML)-相互作用子)的胞外配體結合部分及修飾的人IgG Fc部 分。Atacic印t的功能是拮抗腫瘤壞死因子(TNF)超家族二成員BLyS(B細胞刺激劑)和 APRIL(增殖誘導配體)。已證明BLyS和APRIL是B細胞成熟、發揮功能和存活的重要調節 劑。Atacicept是一種包含人IgGfFc與BLyS受體TACI胞外結構域一部分融合而成 的313個胺基酸的可溶性糖蛋白，其預計分子量為35. 4kDa。該產品的構象為二聚體，預計 分子量為73.4kDa。可用重組技術在中國倉鼠卵巢(CH0)細胞中產生Atacicept。Atacicept中的人IgGfFc經修飾削弱了其Fc與補體Clq組分結合和與抗體受體 相互作用的能力(Tao等，1993 ；Canfield等，1991)。經檢測證實Atacicept的這些Fc效應器功能減弱。治療蛋白製劑TACI-Ig融合蛋白如atacic印t是生物製劑，即治療人類疾病的治療蛋白，因此可 對人類給藥。開發這種製劑目的是提供治療蛋白的有效遞送。治療用蛋白常常遇到的問題是， 例如蛋白質的穩定性差(常需要冷藏或冷凍保存)，生物利用度差和病人對腸胃道外途徑 劑型不友好。在生物技術產品的加工中，通常需要獲得高純度的治療蛋白水溶液。當配製這些 蛋白溶液(如供非腸胃道遞送)時，使蛋白質穩定至關重要。因此，必須選擇能穩定蛋白質 的賦形劑。高純度蛋白質溶液的穩定性也可能受緩衝液的影響。緩衝液通過其離子強度和 PH共同影響蛋白質在溶液中的穩定性。已用於此目的的緩衝液例子有磷酸鹽、檸檬酸鹽、馬 來酸鹽和琥珀酸鹽緩衝液。即使在開始儲存時治療蛋白是溶液，所遇到的問題是維持蛋白質溶液穩定防止其 在儲存時凝聚形成顆粒或沉澱，和防止其降解(如水解、氧化、脫醯胺、被截短或變性)。溫度也可影響溶解性，通常隨著溫度升高溶解性也升高。然而高於某溫度域值時 蛋白質會部分去摺疊導致溶解性降低或凝聚/沉澱。為防止凝聚和降解，為獲得長期穩定的藥物，需要開發含有一種或多種賦形劑的 穩定的治療性蛋白質製劑。本發明針對這種需要，提供了可用於治療人類疾病的治療蛋白，即穩定的、藥學上 可接受的TACI-免疫球蛋白融合蛋白製劑。發明概述本發明依據的基礎是開發了穩定的TACI-免疫球蛋白融合蛋白製劑。第一方面，本發明的製劑包括a)TACI-免疫球蛋白(TACI-Ig)融合蛋白，其包含i. TACI的胞外結構域或其能結合BLyS和/或APRIL的片段或變體；和ii.免疫球蛋白的恆定區；和b)使製劑的pH範圍維持在4. 5-5. 5之間的緩衝液。第二方面，本發明涉及包含這種製劑的藥物組合物。第三方面，本發明涉及用於治療或預防自身免疫性疾病或淋巴增殖性疾病的本發 明的製劑或藥物組合物。第四方面，本發明涉及製備本發明製劑的方法，該方法包括製備TACI-Ig融合蛋 白的液體溶液，並調節該液體溶液的PH至4. 5-5. 5範圍的步驟。本發明的第五方面涉及製備本發明製劑的方法，該方法包括在滅菌容器中充裝預 定量所述製劑的步驟。發明詳述本發明依據的基礎是開發了穩定的TACI-免疫球蛋白融合蛋白製劑，此製劑中的 TACI-Ig融合蛋白可長期穩定(例如3個月以上、6個月以上、12個月以上、15個月以上或 18個月以上)。按照本發明，所述製劑包括
a)TACI-免疫球蛋白(TACI_Ig)融合蛋白，其包含i. TACI的胞外結構域或其能結合BLyS和/或APRIL的片段或變體；和ii.免疫球蛋白的恆定區；b)使製劑的pH範圍維持在4. 5-5. 5之間的緩衝液。在本發明製劑的一個實施方式中，所述製劑的pH範圍為4. 7-5. 3，更優選 4. 9-5. 1。所述製劑的pH 因此可以是 4. 5,4. 6,4. 7,4. 8,4. 9,5. 0,5. 1,5. 2,5. 3,5. 4 或 5. 5。 在一優選實施方式中，所述製劑的pH是5. 5。本發明製劑所用的緩衝液可以是，例如，磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或組 氨酸緩衝液。所述緩衝液的濃度範圍可以是l_59mM，優選5-25mM。例如，本發明製劑中包 含的緩衝液濃度為 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45 或 50mM。在本發明製劑的一個優選實施方式中，所述緩衝液是乙酸鹽緩衝液。優選是乙酸 鈉(NaAc)緩衝液。在本發明的一個實施方式中，所述緩衝液是5-25mM，優選8-12mM，更優 選約10mM的NaAc緩衝液。在一個實施方式中，本發明製劑包含賦形劑。合適的賦形劑是，例如甘露醇、山梨 醇、甘油或海藻糖。所述製劑中甘露醇或山梨醇的濃度範圍可以是(例如)30-80，或40-60， 或約50或51mg/ml。所述製劑中甘油的濃度範圍可以是(例如)10-30，或優選15-25，或 20 或 21mg/ml。海藻糖是一種二糖，由兩個葡萄糖分子通過a，a-1,1鍵連接組成。本發明製劑 中的海藻糖，如無水海藻糖，其濃度範圍可以是(例如)50-120mg/ml，或優選60-100mg/ml。 例如，本發明製劑可包含70、75、80、85、90、95、100、105或110mg/ml的海藻糖。在一個優選 實施方式中，所述製劑包含約80mg/ml的無水海藻糖。雖然本發明的製劑可包含賦形劑或鹽，如NaCl、CaCl2、MgCl2，但在本發明內容說明 中該製劑優選無鹽的。本發明製劑還可包含表面活性劑，如吐溫20，或優選波洛薩姆 (Poloxamer) 188 (Lutrol 或PluroniC F68)。在本發明一個實施方式中，所述製劑無表面活 性劑。在一個實施方式中，本發明的製劑還包含防腐劑，優選採用苯甲醇與苯扎氯銨 (潔而滅)的組合作為防腐劑。例如，所述製劑可含有0. 15-0. 5%的苯甲醇，如0. 2%,0. 3% 或 0. 4% 的苯甲醇，和 0. 0007% -0. 0015% 的苯扎氯銨，如 0. 0008%,0. 0009%,0. 001%, 0. 0011 %或0. 0012 %的苯扎氯銨。在一個高度優選的實施方式中，所述製劑含0. 3 %苯甲 醇聯合0. 001%的苯扎氯銨。本發明的製劑包含TACI-免疫球蛋白(TACI-Ig)融合蛋白作為治療活性化合物， 即作為活性成分。所述TACI-Ig融合蛋白包含(a)TACI的胞外結構域或其能結合BLyS和 /或APRIL的變體或片段；和(b)免疫球蛋白的恆定區。本領域技術人員知道按照本發明 製成的TACI-Ig融合蛋白不是抗-TACI抗體。任何抗-TACI抗體不會包含TACI的胞外結 構域或其能結合BLyS和/或APRIL的變體或片段，而是針對TACI胞外結構域中的表位。在本發明的框架中，術語「TACI胞外結構域」也指與TACI胞外結構域(SEQ ID NO 1)具有至少80%或85%，優選至少90%或95%或99%相同性的任何變體。術語「TACI胞 外結構域」還包括含有不多於50或40或30或20或10或5或3或2或1個保守性胺基酸 替代的變體。任何這種變體能結合BlyS和/或APRIL，和/或任何BlyS_APRIL異質三聚 體。優選這類變體也能抑制BlyS和/或APRIL和/或任何BlyS/APRIL異質三聚體的生物 學活性。所述BlyS或APRIL的生物學活性是，例如，B細胞增殖。本發明中，也可採用TACI胞外結構域的片段(活性片段)和變體，只要這些片段 能結合BlyS和/或APRIL，和/或BlyS_APRIL異質三聚體。優選這類片段也能抑制或減弱 BlyS和/或APRIL和/或BlyS/APRIL異質三聚體的生物學活性。可按例如以下實施例2所述，來評估任何TACI胞外結構域、TACI-Ig融合蛋白、或 其任何變體或片段結合BlyS和/或APRIL和/或BlyS/APRIL異質三聚體的能力。可按例 如以下實施例3所述，來評估它們抑制或減弱BlyS、APRIL和/或BlyS/APRIL異質三聚體 生物學活性的能力。在本發明中，TACI胞外結構域的任何這種片段或變體，或TACI-Ig融合蛋白，優選 不具有明顯低於atacic印t(即具有SEQ ID NO 3胺基酸序列的蛋白質)活性的任何生物 學活性。本文所用的術語「免疫球蛋白(Ig)_恆定區」也稱為「Fc區」，它衍生自人或動物 的免疫球蛋白(Ig)，優選IgG。IgG可以是IGgl、IgG2、IgG3或IgG4。Fc區優選包括IgGl 的至少CH2、CH3區，較佳為還包括絞鏈區。優選Ig的恆定區是人IgGl區。在一個實施方式中，人IgGl恆定區經修飾降低了其補體依賴的細胞毒性(⑶C)和 /或抗體依賴的細胞毒性(ADCC)。在ADCC中，抗體的Fc區結合於免疫效應細胞如自然殺傷細胞和巨噬細胞表面的 Fc受體(FcyR)，導致靶細胞被吞噬或溶解。在CDC中，抗體通過在細胞表面觸發補體級聯 反應而殺死靶細胞。根據位於絞鏈區和CH2結構域上的殘基，IgG可結合活化受體(Fc y RI、 Fc y RIIa、Fc y Rllla 禾口 Fc y RHIb)和抑制受體(Fc y RIIb)Fc y R,或補體第 1 組分(Clq)。 在IgG2和IgG4中，CH2結構域中的兩區域對FcyR和補體Clq結合至關重要，且具有獨特 序列。例如，將IgG2位置233-236的殘基取代為人IgGl (的殘基)大大降低了其ADCC和 CDC 活性(Armour 等，1999 和 Shields 等，2001)。按照 EU 索引位置(Kabat 等，1991)，可在 IgGl的Fc區中引入如下Fc突變T250Q/M428LM252Y/S254T/T256E+H433K/N434FE233P/L234V/L235A/AG236+A327G/A330S/P331SE333A ；K322A其它Fc突變可以是，例如在選自330、331、234或235位或其結合的EU索引位置 上的取代。本發明中，也可在Fc區中引入位於CH2結構域上的EU索引位置297的胺基酸 取代，以消除N-連接糖附著的潛在位點。也可用絲氨酸殘基取代EU索引位置220的半胱 氨酸殘基，以去除通常與免疫球蛋白輕鏈恆定區形成二硫鍵的該半胱氨酸殘基。已製備了適合用於本發明TACI-Ig融合蛋白的特定Fc結構域。具體說，為產生Fc融合蛋白，製備了 6種修飾的人IgGlFc，命名為Fc-488及Fc4、Fc5、Fc6、Fc7 和 Fc8。利用野生型人免疫球蛋白、1恆定區作模板，設計和構建了便於克隆含人、lFc 區融合蛋白的Fc-488 (具有SEQ ID NO 4的DNA序列和SEQ ID NO 5的胺基酸序列)。應 注意由於用絲氨酸取代通常與免疫球蛋白輕鏈恆定區形成二硫鍵的半胱氨酸，可能導致半 胱氨酸殘基不配對而產生有害作用。在編碼EU索引位置218的密碼子中引入一種其它改 變，以引入Bglll限制性酶識別位點而有利於後面的DNA操作。通過PCR引物將這些改變 引入編碼的PCR產物中。由於已安置了 Bglll位點，為了完成(引入)Fc絞鏈區，將編碼EU 索引位置216和217的密碼子摻入融合蛋白的伴侶序列中。Fc4、Fc5和Fc6包含突變，通 過減弱Fc y R結合和補體Clg結合而減弱Fc介導的效應器功能。Fc4含有同樣的胺基酸取 代，它們被引入Fc-488中。引入其它胺基酸取代，以減弱潛在的Fc介導的效應器功能。具 體說，引入三個胺基酸取代以減弱Fc y RI結合，這些取代是在EU索引位置234、235和237 的取代。已顯示這些位置的取代減弱了與Fc y RI的結合(Duncan等，1988)。這些胺基酸取 代可能也減弱了與FcyRlla的結合以及與FcyRIII的結合(Sondermann等，2000 ；Wines 等，2000)。幾個研究小組報導了 EU索引位置330和331的胺基酸與補體Clq結合及後續補 體的固定有關(Canfield和Morrison，1991 ；Tao等，1993)。在Fc4的這些位置引入胺基酸 取代減弱了其補體固定功能。Fc4的CH3區與相應野生型多肽的CH3區相同，除了終止密碼 之外。當用不良的大腸桿菌菌株培養克隆的DNA時，將該終止密碼子從TGA改變成TAA以 消除潛在的有害甲基化位點。在Fc5中，EU索引位置218的精氨酸殘基突變回賴氨酸，因為在含這種特定Fc的 融合蛋白中沒有採用Bglll克隆方案。Fc5序列的其餘部分與以上描述的Fc4相匹配。Fc6與Fc5相同，除了羧基末端賴氨酸密碼子已消除外。成熟免疫球蛋白C_末 端的賴氨酸通常從翻譯後成熟免疫球蛋白去除然後從B細胞分泌出來，或在血清循環時去 除。結果，循環抗體通常沒有C-末端賴氨酸殘基。與以上的Fc4和Fc5相同，Fc6序列中 的終止密碼子改變成TAA。Fc7與野生型YlFc相同，除了 CH2結構域中EU索引位置297上有胺基酸取代外。 EU索引位置297天冬醯胺是N-連接的糖附著點。由於糖結構可能產生批間差異，N-連接 糖在重組表達的蛋白中引入了潛在的變異源。在一個消除這種潛在變異的嘗試中，使297 天冬醯胺突變為穀氨醯胺殘基以防止該殘基位置附著N-連接糖。殘基297處的糖也參與 Fc與FcIII的結合(Sondermann等，Nature 406:267(2000))。因此，通常去除該糖應減弱 含Fc7重組融合蛋白與Fc Y R的結合。如上所述，將Fc7序列中的終止密碼子突變為TAA。Fc8與SEQ ID NO 4所示的野生型免疫球蛋白Y 1區相同，除了 EU索引位置220 的半胱氨酸被絲氨酸殘基取代外。此突變消除了通常與免疫球蛋白輕鏈恆定區形成二硫鍵 的半胱氨酸殘基。任何這些特定Fc區在形成TACI-Ig融合蛋白的應用均落入本發明範圍。TACI-Ig的免疫球蛋白恆定區優選包含具有SEQ ID NO :2所示胺基酸序列的多 肽，或其與SEQ ID NO :2所示Ig恆定區至少有80%或85%，優選至少90%或95%或99% 相同的變體；或含有少於50或40或30或20或10或5或3或2個保守性胺基酸取代的變 體，只要這不影響TACI-Ig融合蛋白的整體生物學活性，此種TACI-Ig蛋白的免疫原性不會
8顯著高於 atacic印t(SEQ ID NO :3)。在本發明說明書中，術語「相同性」表示通過序列比較所確定的兩條或多條多肽序 列之間的關係。相同性通常指兩條多肽序列作全長序列比較時，它們的胺基酸與胺基酸分 別精確對應。對於無精確對應的序列而言，可確定其為「0%相同」。通常排列對比所比較的二條 序列，得到序列之間的最大相關性。這可包括在一條或二條序列中插入「空格」以提高對比 程度。比較每條序列的全長(所謂總體對比)可確定相同性％，這特別適合長度相同或非 常相似的序列，或比較較短、長度限定的的序列(所謂局部對比)，這較適合長度不相等的 序列。比較兩條或多條序列相同性的方法是本領域熟知的。例如，可採用在9. 1版威斯 康新序列分析包中的這種程序(Devereux J等，1984)，例如BESTFIT和GAP程序，來測定 兩條多聚核苷酸之間的相同性％和兩條多肽序列之間的相同性％。BESTFIT採用Smith和 Waterman(1981)的「局部同源性」算法，尋找二條序列之間相似性的最佳單一區域。測定 序列相同性的其它程序也是本領域已知的，例如，BLAST家族程序(Altschul S F等，1990 ； Altschul S F 等，1997,可通過 NCBI 主頁 www, ncbi.nlm.nih. gov 講入)和 FASTA (Pearson ff R,1990)。本發明優選的胺基酸取代是被稱作「保守性」的取代。TACI-Ig融合蛋白的TACI 胞外結構域或免疫球蛋白恆定區部分的保守性胺基酸取代，包括理化性質充分相似的 同組內的同義胺基酸(相互取代)，同組內成員之間的取代將保存該分子的生物學功能 (Grantham, 1974)。已知也可在上述序列中製造插入和缺失而不會改變其功能，具體說，如 果插入或缺失只涉及少數胺基酸，如50以下、或30個以下、20個以下、或優選10個以下、或 5個以下胺基酸殘基，並且不去除或置換對功能構象至為關鍵的胺基酸，如半胱氨酸殘基。 這樣的缺失和/或插入所產生的蛋白質和變體可用於治療復發性MS，只要其生物學活性不 顯著低於atacic印t (具有SEQ ID NO :3所示胺基酸序列的蛋白)的生物學活性。已公布的國際專利申請W0 00/40716和W0 02/094852公開了 TACI的胞外結構域 及TACI胞外結構域與其配體BlyS和APRIL相互作用的特異性片段。如W0 00/40716所公開的那樣，TACI的胞外結構域包含2個富含半胱氨酸(Cys) 的重複序列，這是TACI受體所屬腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族成員的特徵。W0 00/40716 中也製備了一種能與BlyS結合的TACI修剪變體，命名為BR42x2，它只包含第2種較不保 守的富含Cys重複序列。因此，在本發明框架內，TACI的胞外結構域片段優選至少包含對 應於該第2種富含Cys重複序列的SEQ ID NO 1的71-104胺基酸殘基或由這些殘基組成， 更優選TACI-Ig融合蛋白還包含對應於第一種富含Cys重複序列的SEQ ID N0 :1的34-66 胺基酸殘基。在本發明另一實施方式中，所述能結合和抑制BlyS和/或APRIL活性的TACI的 胞外結構域片段自身包含SEQ ID NO :1的30-110胺基酸殘基或由這些殘基組成。在本發明的還有一個實施方式中，所述TACI-Ig融合蛋白包含SEQ IDN0 :3序列的 多肽或由其組成，或與之有至少90%或95%或98%或99%相同性或少於30個或20個或 15個或10個或5個或3個或2個保守性胺基酸取代的變體，這種變體能結合BlyS和/或 APRILo
在本發明的還有另一個實施方式中，所述TACI-Ig融合蛋白包含SEQ IDN0 :8序列 的多肽或由其組成，或與之有至少90%或95%或98%或99%相同性或少於30個或20個 或15個或10個或5個或3個或2個保守性胺基酸取代的變體，這種變體能結合BlyS和/ 或 APRIL。在本發明的還有一個實施方式中，所述TACI-Ig融合蛋白包含SEQ IDN0 10序列 的多肽或由其組成，或與之有至少90%或95%或98%或99%相同性或少於30個或20個 或15個或10個或5個或3個或2個保守性胺基酸取代的變體，這種變體能結合BlyS和/ 或 APRIL。在本發明的還有一個實施方式中，所述TACI-Ig融合蛋白包含SEQ IDN0 12序列 的多肽或由其組成，或與之有至少90%或95%或98%或99%相同性或少於30個或20個 或15個或10個或5個或3個或2個保守性胺基酸取代的變體，這種變體能結合BlyS和/ 或APRIL。在本發明的還有一個實施方式中，所述TACI-Ig融合蛋白包含SEQ IDN0:14序列 的多肽或由其組成，或與之有至少90%或95%或98%或99%相同性或少於30個或20個 或15個或10個或5個或3個或2個保守性胺基酸取代的變體，這種變體能結合BlyS和/ 或 APRIL。在本發明的另一個實施方式中，所述製劑包含濃度範圍20mg/ml-180mg/ml，例如 濃度為 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、 130、135、140、145、150、155、160、165、170、175mg/ml 的 TACI-Ig 融合蛋白。在本發明另一實施方式中，所述製劑是液體(如水溶液)劑型。在本發明的還有一個實施方式中，所述製劑是多劑量給藥製劑。多劑量製劑中優 選包含防腐劑。如上所述，在一個優選的實施方式中，所述製劑包含苯甲醇(如0.3% )和 苯扎氯銨(如0.001% )。可每天、每隔一天，優選每周二次或每周一次給予TACI-Ig融合蛋白製劑。給予 TACI-Ig優選推注給藥，每周一次。或者，也可每隔一周或每月一次給予所述製劑。本發明的製劑可以是例如靜脈內、皮下或肌肉內途徑給藥。在本發明的一個實施 方式中，所述製劑是用於皮下給藥的。本發明的製劑用於治療疾病，優選治療人類疾病。因此，在一實施方式中，將本發 明製劑製備成藥物組合物。包含TACI-Ig融合蛋白的製劑或藥物組合物優選用於治療自身免疫性疾病或淋 巴增殖性疾病，或製備治療自身免疫性疾病或淋巴增殖性疾病的醫療用藥。本發明所述的自身免疫性疾病包括但不限於全身性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡性腎 炎、類風溼關節炎、多發性硬皮症或視神經炎。淋巴增殖性疾病是一種淋巴系統細胞過度增殖的疾病。B細胞惡變是例如淋巴增 殖性疾病。B細胞惡變疾病包括但不限於白血病和淋巴瘤，例如，急性白血病、急性淋巴細 胞性白血病、急性髓細胞性白血病、髓母細胞白血病、前髓細胞性白血病、粒-單核細胞白 血病、單核細胞紅白血病、慢性白血病、慢性髓細胞(粒細胞)白血病、慢性淋巴細胞性白血 病、真性紅細胞增多症、何杰金病、非何杰金淋巴瘤、多發性骨髓瘤和瓦爾登斯特倫巨球蛋 白血症。
10
本發明也涉及生產或製備本發明製劑的方法，包括製備(例如混合)組分(a)-(c) 的步驟，優選在液體溶液(如水溶液)中。本發明還涉及生產或製備本發明製劑的方法，包括在滅菌容器中放置預定量的所 述製劑。預定量可以是例如0. 5-5ml，優選l-2ml。在本發明的一個實施方式中，所述容器選自玻璃小瓶或預裝填針筒。玻璃小瓶例 如可用無塗層瓶塞或塗層瓶塞密封。瓶塞可以是例如橡皮塞或溴丁基橡膠塞。針筒，如預 裝填針筒可以用橡皮內芯或用塗層內芯塞住。塗層可以是例如無油矽酮塗層。預裝填針筒可以有不同容量，如0.5、1、1.5或2ml。優選lml針筒。針筒的裝填容 量優選1或1. 2ml。預裝填針筒可用塑料製成，或優選為玻璃針筒。合適的玻璃針筒為例如 Becton Dickinson製造的lmL玻璃針筒27G1/2 RNG ff 7974/50G。預裝填針筒優選用塗層 塞子(如FluroTec公司製造的W4023/50G)和無塗層塞子(如West Pharmaceutical公司 製造的W4023/50G)塞住。按照本發明，預裝填針筒優選包含TACI-Ig融合蛋白含量範圍在 20-160mg，例如20、25、50、75、100、125或15011^的藥物。如以下實施例4所示，包含乙酸鈉 緩衝液和海藻糖的PH5. 0的TACI-Ig融合蛋白製劑保持在5-25°C可長期穩定，例如達18個 月。除非另外指明，本申請說明書所指定的各種範圍的數值都表示為近似值，正如所 述範圍內的最低值與最高值前面都有「大約」這個詞。以這種方式，可採用在所述範圍之上 或之下的輕微變更以達到與範圍內的數值基本上相同的結果。還有，所公開的範圍是連續 範圍，包括所引用的最低值與最高值之間的每一個值，以及可能形成的任何範圍。在本發明中，本發明的製劑或藥物組合物可包含除TACI-Ig融合蛋白以外的其它 活性成分，或與其它活性成分聯合給藥。例如，可存在皮質類固醇，特別是甲基氫化潑尼 松，還有幹擾素-0、克拉曲濱、米託蒽醌、乙酸格拉默、那他珠單抗、利妥昔單抗、特立氟胺、 fingolimod, laquinimod或BG_12(—種口服延胡索酸鹽)。這種聯合治療可以同時、分開 或相繼進行。現已全面公開了本發明，本領域技術人員會明白，採用範圍廣泛的同等參數、濃度 和條件，不背離本發明的思路和範圍，無需過多實驗而可獲得同樣的結果。雖然結合具體實施例描述了本發明，但應明白可以作進一步改進。本申請旨在其 所附權利要求範圍中覆蓋按照本發明原理對本發明所作的任何變更、應用和改編，包括屬 於本發明所屬領域的已知或常規實踐、可適用於上述基本特徵而與本說明書公開偏離的內 容。本文引用的所有參考文獻，包括雜誌文章或摘要，公開或未公開的美國或外國專 利申請，頒發的美國或外國專利及其它任何參考文獻，整體納入本說明書作為參考，包括引 用參考文獻中的所有數據、圖表和文本。此外，本說明書所引用參考文獻中的參考文獻內容 也納入本說明書作參考。參考已知的方法步驟、常規方法步驟、已知方法或常規方法，不意味以任何方式承 認本發明的任何方面內容、描述或實施方式在向各方領域已公開、報導或提出過。以上對具體實施方式
的描述完全揭示了本發明的總體特徵，他人可通過應用本技 術領域的知識(包括本說明書所引參考文獻的內容)無須過多實驗和不背離本發明的總體 概念，不難修飾和/或改編這樣的具體實施方式
以供各種應用。因此，這些依據本說明書提
11供的說明和指南作出的改編和修飾意在落入所公開實施方式的同等範圍內。也應理解本說 明書所用的措詞和術語目的是為了說明而非限制，因此本說明書的術語或措詞可由本領域 技術人員根據本說明書提供的說明和指南，結合本領域普通技術人員的知識予以解釋。在描述了本發明後，參見以下示範性臨床研究狀況的實施例不難理解，它只是為 了說明而提供的，並非為了限制本發明。實施例1.液體製劑的開發詞彙表AUC:分析型超離心，⑶園二色性DLS 動態光散射，DSC:差示掃描熱量法IEC:離子交換色譜，MALDI-ToF 基質輔助雷射解吸電離時間飛行質譜0D:光密度，RALS:直角光散射RP:反相色譜，SEC:分子大小排阻色譜材料-TACI-Fc 藥品，磷酸鹽緩衝液，pH6. 0，+140mM NaCl-TACI-Fc藥品，磷酸鹽緩衝液，pH5-TACI-Fc藥品，乙酸鹽緩衝液，pH5-正磷酸(1. 00563，Merck)-琥珀酸(1. 00682，Merck)-檸檬酸(1.59134，Merck)-組氨酸(1.04351，Merck)-冰乙酸100% (1. 00063，Merck)-D-甘露醇 DMB，Ph Eur, BP, USP, FCC, E421 (1. 05980, Merck) -D-山梨醇(S-1876， Sigma)-蔗糖 DAB, Ph Eur, BP, NF(1. 07653, Merck)-海藻糖(1.08216，Merck)-D-葡萄糖一水合物(346971，Carlo Erba)-氫氧化鈉片GR(1. 06498，Merck)-吐溫20，合成的(8. 22184，Merck)；-波洛沙姆(Poloxamer)188(Lutrol F 68 DAC, USP/NF, Basf)-氯化鈣二水合物(1.02382，Merck)-氯化鎂(1.05833，Merck)-氯化鈉(1.06404, Merck)-鹽酸精氨酸(A-5131,Sigma)；-賴氨酸鹽酸鹽(1.0571，Merck)0136]-甘氨酸(5.00190, Merck)；
0137]-乙腈(00030，Merck)
0138]-10xPBS(P/N 70013-032，Gibco)
0139]-三氟乙酸(94了0，Baker)
0140]-硫酸銨(1.01217，Merck)
0141]-IN 氫氧化鈉(1. 09137，Merck)
0142]-IN 鹽酸(1. 09057，Merck)
0143]-HPLC 級水(MilliQ)
0144]-注射用水
0145]-無水硫酸鈉(代碼6649，Merck)
0146]-甲醇(代碼06009，Merck)
0147]-疊氮化鈉(代碼6688，Merck)
0148]-磷酸二氫鈉一水合物(代碼063妨，Merck)
0149]-磷酸氫二鈉二水合物(代碼06580，Merck)
0150]生物學試驗用
0151]-Jurkat pKZ142 克隆(WCB)24 細胞
0152]-TACI-Fc5 (1-8. 66mg/ml)
0153]-zTNF4(l. 44mg/ml)
0154]-RPMI 1640，含或不含酚紅(Gibco)
0155]-胎牛血清(FBS)(GIBCO)
0156]-L-穀氨醯胺(Hyclone)
0157]-丙酮酸鈉(Gibco)嘌呤黴素(Sigma)
0158]-穩定的GL0螢光素酶試驗緩衝液和底物(PrOMegaE2510)
0159]白色組織培養96孔板加蓋(Dynex)
0160]-96 孔板加蓋(Falcon)
0161]_5mL 聚丙烯試管(Falcon)
0162]設備
0163]-HPLC 系統(Waters)
0164]-計量移液管(Gi1 son)
0165]-差示掃描量熱儀(2920型，TA儀器公司)
0166]-微熱量計(VP-DSC型，MicroCal)
0167]-pH 計(713 型，Metrohm)
0168]-滲透壓計(Osmomat 030-D，Gonotec)
0169]-旋光分光光度儀J-810，配備有Peltier溫度控制計PTC-423S(Jasco)
0170]-螢光分光光度儀FluoroMax3，配備有微板計數計MicroMax384(Jobin Yvon)
0171]-96-孑L MaxSorp 板(Nunc)
0172]-分光光度計入354 (Perkin-Elmer)
0173]-石英杯0. 1 和 lcm 光路徑(Perkin Elmer)
0174]-Zetasizer Nano Series(Malvern)
-小容量(約70ii L)石英杯-細胞攪拌系統(8400或8450型，Amicon)-lOkDa 截留膜(YM10 型，Amicon)-不鏽鋼容器22mL 和 220mL 容量(Sartorius)-濾膜 0.22ym(Durapore 型 GWV P, Millipore)- _月莫 0. 45 um(Durapore M HVLP, Millipore)—焚光/RALS 光度計(Photon Technology International)-IKA-Vibrax-VXR 振蕩器(IKA-Works，Inc.)_ 凍幹機(Lyoflex 06, Lyoflex 08, Edwards)-旋渦振蕩器(Falc)_f亙溫箱(Heraeus)-低溫冰箱(Angelantoni)生物學檢測用-發光計平板讀數儀Lumicount Packard-Graph Pad Prism 軟體-層、流通風櫃(Flow Laboratories)-37 °C C02 培養箱(Heraeus)-37°C 水浴箱-細胞計數器-顯微鏡-搖動平臺-桌面離心機-單通道和多通道刻度移液管和移液頭-移液輔助器主要包裝材料-DIN2R(3mL)玻璃小瓶(Nuova 0MPI)-Flurotec 橡皮塞(S2F452，D777-1, B2-40，West Pharmaceutical)-橡皮塞(1779W1816灰色 Pharmagummi)分子大小排阻色譜法(SEC)方法1用PBS1X pH = 7. 2 稀釋樣品至 0. 5mg/ml，取 40 yl (20 y g)加到 TSK 凝膠柱 G3000SWXL (5 u m, 7. 8 X 300mm)上。每次試驗，洗脫液為0. 05M乙酸鈉，0. 5M硫酸銨pH = 6. 0。方法2用移動相稀釋樣品至0. 25mg/ml,取40 yl (20 y g)加到TSK凝膠柱 G3000SWXL (5um,7. 8X 300mm)上，此柱連接於TSK凝膠SWXL保護柱(6mm X 4cm)。每次試 驗，洗脫液為0. 05M磷酸鈉，0. 5M硫酸銨pH 二 6. 0。反相色譜法(RP)
14
用PBS1X pH = 7. 2 稀釋樣品至 0. 5mg/ml，取 40iil(20iig)加到已用 71% 緩衝 液 A(0. 1 % TFA/ 水)和 29%緩衝液 B(0. 1 % TFA/ 乙腈)平衡的PLRP4000A柱(8 u m， 50X4. 6mm)上。用線性梯度液洗脫樣品，流速2ml/分。注入不同量的標準液(IRS ACI_Fc5 2002/2001)產生標準曲線。C-末端截短(RP)將樣品用酶(Cys-C) 37 V消化2小時，然後在帶保護柱的Vydac C18柱 (4, 6X 50mm)上進行反相層析。洗脫液A 0. 1% TFA/ 水；洗脫液 B 0. 08% TFA/70% CH3CN流速1ml/分，溫度40°+/-5V,檢測214nm洗脫梯度7分鐘內洗脫液B 15% -23%，共15分鐘。修剪形式(RP)用純水稀釋TACI-Fc藥品的樣品至蛋白濃度4mg/ml。取10 yl稀釋的樣品用還 原變性液(0. 15M DTT/6M鹽酸胍)稀釋至200 u 1，旋渦振蕩後60 士 2°C培育90分鐘。取 75-150 u 1(15-30 ug)注入先前已用起始條件液(71%洗脫液A，0. 05% TFA/水和29% 洗脫液B，0. 04% TFA/乙腈)平衡的柱(大孔丁基柱，5mm，直徑4.6mmX高50mm，貨號 7116-05，J.T.Baker 公司產品)中。游離Fc 二聚體(IEC)用Poloxamerl88 100mg/L 溶液(以 10mM磷酸鈉緩衝液 pH4. 0 配製)稀釋 TACI_Fc 藥品的樣品至蛋白濃度為10mg/ml。當TACI-Fc濃度高於100mg/ml時，應通過稱重進行樣 品稀釋。取25 ill (250 u g)注入預先用起始條件液(80%洗脫液A，10mM磷酸鈉pH4. 00和 20%洗脫液B，10mM磷酸鈉pH 4. 00+0. 5M KCI)平衡的柱(ProPac WCX-10G(保護)，4x50mm， 貨號054994，Dionex公司產品)中。氧化形式(MALDI-ToF)對TACI-Fc藥品樣品進行肽圖描繪，應用NALDI_ToF檢測定量其氧化形式而驗證。分析型超離心(AUC)將樣品加到有二通道碳環氧樹脂十字頭的小杯中，光路徑12mm。用SE-HPLC洗脫 緩衝液作為稀釋劑將樣品稀釋以模擬HPLC檢測的條件。將相對應的緩衝液加入參比通道 (該儀器操作類似於雙光束分光光度計)中。然後將加樣小杯放入AN-59Ti分析轉頭，安置 在Beckman Optima XL-I分析型離心機中。採用以下實驗設置進行分析轉頭類型8孔轉頭；轉速；40000rpm ；十字頭碳環氧樹脂；通道長度12匪； AUC試驗期間的溫度20°C 士0. 2°C ；檢測波長280nm；樣品濃度0.5mg/ml ；
樣品體積432ml/通道；參比品體積442ml/通道。用國立衛生研究院Peter Schuck開發的c (s)法分析數據，用其分析程序 SEDFIT(8.7版)進行分析。差示掃描熱量法(DSC)DSC 2920CE, TA儀；溫度範圍25-100 °C ；升溫速度2 °C /分；填裝的最大體 積(HVP)75iU溶液；用安慰劑溶液為參比液。微熱量計為MicroCalVP-DSC;溫度範圍 25-100°C ；升溫速度70°C /小時；反應=15秒；數據間距0. 2-8°C ；樣品杯填裝約600ml的 5mg/ml Taci-Fc5液；用水作參比溶液。光密度(0D)用水稀釋製備0. 5mg/ml TACI_Fc5液，用蘭伯特-比爾公式0D = e be ( e是摩爾 消光係數；b是光杯的厚度)計算濃度(c)。￡ (280nm) = 1. 56 (mL/mg)/cm。將這些計算值 乘以稀釋倍數測得起始液的濃度。園二色性(CD)構緣分析通常採用⑶研究肽和蛋白質的構象。幾種因素可能影響⑶光譜遠紫外 (180-250nm)區和近紫外區9250-350nm)特徵峰的形態，如蛋白濃度、溫度、pH和離子強度。 文獻報告在遠紫外區觀察到的總譜帶位置代表了特定類型的二級結構(a-螺旋，片 層，隨機捲曲)。在近紫外區觀察到的⑶譜帶主要由Trp、Tyr、Phe和二硫鍵產生。然而，必須指出，二硫鍵的信號一般比芳族胺基酸的信號低得多。只要這些殘基位 於不對稱環境即可產生CD信號。蛋白三級結構的構象變化常導致起始環境的變化，從而引 起CD波譜改變。事實上，天然蛋白的各胺基酸佔據三維結構中的獨特位置。這種結構的改 變可導致其可及度的改變。近紫外區⑶光譜的沒置掃描速度=5-20nm/分；範圍=250_350nm ；反應速度=8秒；濃度=2mg/ml ；光 路徑長=lem ；數據間距=0. 5nm ；帶寬=lnm ；累積=2標準靈敏度。室溫下獲得光譜。遠紫外區⑶光譜的設置；掃描速度=5-20nm/分；範圍=200-300nm ；反應速度=8秒；濃度=0. 25mg/ml ； 光路徑長0. lem ；數據間距=0. 5nm ；帶寬=lnm ；累積=2標準靈敏度。室溫下獲得光譜。蛋白質去摺疊溫度用⑶以固定波長監測溫度掃描是在不同溫度下研究蛋白質二級和三級結構的有 價值的方法。這種檢測可以評價在不同製劑中蛋白質的去摺疊溫度(Tmf)。雖然Tmf與蛋 白質去摺疊釋放的自由能(它是蛋白質穩定性的一種指標)不直接相關，但廣為接受的是 Tmf升高應與蛋白質穩定性增加相關。因此，Tmf的變化可表明特定組合物是否有穩定或去 穩定的效果。通過監測色氨酸(Trp)信號的變化對熱變性進行了研究，該信號的變化與蛋 白質構象隨溫度變化有關。在55-70°C範圍內加熱藥品製劑(1°C/分)。可通過CD橢園相 對極小值292. 5nm的變化檢測溫度對三級結構的影響。採用第4級多項擬合法計算出解鏈 溫度值。⑶溫度掃描的設置
16
溫度範圍=55-70°C;升溫速度=1°C /分八=292. 5nm ；濃度=2mg/ml ；反應速 度=8秒；數據間距=0. 2-8°C ；帶寬=lnm ；標準靈敏度；攪拌速度=低速。動態光散射法(DLS)動態光散射法是檢測顆粒布朗運動產生的與顆粒大小有關的光散射。此法需要將 顆粒置於雷射束下，分析散射光中的強度波動。更精確地說，顆粒布朗運動的速度與顆粒大 小相關(史託克-愛因斯坦等式)。用數字相關器檢測在一段時間內兩種信號(此例為強 度信號)之間的相似程度，給出與散射光強度波動的性質和程度相關的信息，這些信息與 顆粒大小有關。測定相關函數後，可用其計算出顆粒大小分布。M Zetasizer Nano Series檢測接近180°的散射光強度(反相散射檢測)。這 種設置可減少通過樣品時多重散射光的影響和大汙染顆粒的影響。採用一次性小杯(內部 容量約70iU)。檢測時的溫度=25°C。平衡時間=1分鐘，運行次數=11次；運行時間= 10秒；檢測次數=2 ；分散劑為水(粘度=0. 8872cP ；屈光率=1. 330)，不經稀釋。螢光直角光散射(RALS)用螢光檢測器檢測RALS，其激發光和發射光的波長設置相同。在此種配置中，螢光 檢測器成為非常靈敏的RALS檢測器。RALS升高表明樣品中有凝聚/沉澱。螢光內螢光蛋白質含三種芳族胺基酸殘基(色氨酸Trp、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe)，這成為其 發出內螢光的原因。摺疊蛋白的螢光是各芳族殘基螢光的集合。一般用280nm波長或常用 更長的295nm光激發蛋白螢光。大多數發射光由色氨酸殘基發射產生，少數發射光由酪氨 酸和苯丙氨酸產生。色氨酸最大螢光發射的強度、量子率和波長極其依賴於溶劑。隨著色 氨酸殘基周圍溶劑極性的降低，螢光光譜轉移為較短波長，螢光強度增加。包埋在蛋白疏水 核心中的色氨酸與蛋白表面的色氨酸相比，其光譜可能漂移10-20nm。此外，色氨酸螢光可 被鄰近的質子化酸性基團如Asp或Glu淬滅。因此，可利用螢光作為強效監測工具，反映芳 族殘基所處微環境的變化。 MicroMax384是一種微孔板讀數儀，能裝下多達384孔的平板並連接FluoroMax熒 光分光光度計。單色光鏡的激發光和發射光通過光纖束進出MicroMax 384，因此，用戶可用 該主螢光光度計掃描並選擇強度測量用的激發光和發射光波長對。MicroMax的所有控制均 為通過DataMax軟體的自動控制，通過此軟體也可自定義選擇板中微孔。用Micr0MaX384平板讀數儀進行高通量螢光掃描，採用以下設置激發光和發射 光間隔=5nm ； A exc = 280nm ；發射光範圍=300-450nm ；積分時間=0. 1秒；不稀釋。用 Fluromax3軟體自動計算最大發射光波長。RALS用FluoroMax螢光分光光度計在500_800nm之間同步掃描(X exc = A em)進行 RALS檢測。在這些條件(無樣品吸收和不受光源影響)下顯示的強度主要為溶液中存在的 (光/蛋白質)散射現象所致。散射總強度隨著蛋白粒度增加而增加，因此，可用此技術監 測凝聚、亞單位分離、降解等等。散射強度也依賴於蛋白濃度與屈光係數，因此，應在相同的蛋白濃度下進行檢測 比較。
17
進行RALS檢測設置的參數如下同步掃描，波長範圍=500"800nm,間距=15nm, 積分時間=0. 5秒，偏移=Onm，樣品濃度=35mg/ml (用milliQ水作為稀釋劑)。螢光發射光的各向異性大分子的旋轉取決於其大小、形狀和局部環境(即溶劑)。通常採用偏振發射測量 來檢測分子大小的微小變化(凝聚、結合、切斷)及環境變化(局部粘度，相轉變等)。這 些檢測的第一步是激發所選擇的螢光基團(光選擇)。通常用垂直偏振光以垂直方向激發 能吸收偶極子的分子群。在此時相中，用激發途徑中的偏振器產生垂直的偏振激發光。一 旦受到激發，分子可在激發狀態壽命期(約10_9秒)內旋轉。這種旋轉將使螢光發射消偏 振。測定偏振發射光的組成可以出計算分子旋轉的類型與程度。用發射途徑中的偏振器檢 測螢光發射的偏振組成部分。從垂直(V)和水平(H)發射光組成部分的大小，可計算出旋 轉的程度和類型。AniS0tr0py(A)是一種比例，定義為線性偏振組成部分的強度除以光的總 強度A = (Ivv-G * Ivh)/(Ivv+2G * IVH)此式中，G是校正因子，G = IHV/IHH在這些方程式中，強度I的第一個下標表示激發光偏振器的位置(H或V)，第二個 為發射光偏振器的位置(H或V)。當激發光波長設為\ = 295nm時，螢光的各向異性給出 了與色氨酸殘基移動和它們所處局部粘度的有關信息。因此，螢光各向異性的增加可反映 蛋白質的這些殘基處於更剛性的環境。檢測各向異性所設置的參數如下入exc = 295nm，發射光範圍=500_800歷，積分 時間=0. 5秒，間距=15nm，樣品濃度=35mg/ml (用milliQ水作為稀釋液)。生物學試驗TACI-Fc體外生物學試驗基於Jurkat (人急性T細胞淋巴瘤)轉染的細胞(Jurkat PKZ142)。用二種質粒轉染此細胞系，第一種編碼在CMV啟動子控制下的全長TACI cDNA, 第二種含NF-kB/AP-1驅動的螢光素酶報告基因。該方法基於zTNF4結合細胞表面TACI受 體、觸發信號轉導級聯反應、導致轉染的NF-kB/AP-1螢光素酶報告基因激活的能力。可溶 性TACI-Fc的存在抑制了 zTNF4與TACI受體的結合，從而降低螢光素酶的表達。將Jurkat pKZ142細胞與TACI-Fc標準品一起培育，建立27. 86-1. 63U/ml全劑量 反應曲線，以及與兩種濃度(即4和6U/ml)的受試樣品一起培育，這兩種濃度位於標準曲 線的線性部分。然後將zTNF4溶液以能誘導次級最大螢光素酶產生的濃度(即每孔150ng/ml)加 入標準品和樣品中；以最少和最多螢光素酶產生為對照。37°C (5% C02)培育4小時後，用 螢光素酶Steady Glo試劑盒加入細胞，以發光光度計檢測螢光素酶的表達。在標準劑量反應曲線的線性部分內插兩種測試濃度的Y值(RLU)，計算出樣品效 能，獲得X軸上的TACI-Fc濃度(Graph Pad軟體)。求得各次獨立試驗中兩種濃度的平均 值，然後從各次獨立試驗獲得的效能算術平均值計算出TACI-Fc5的生物學活性。預配製過程對pH、緩衝液類型和輔料對蛋白質穩定性的影響進行了評價。製備濃度70或 100mg/ml的TACI-Fc溶液，初步研究以下變量-pH(4、5、6、7)
-緩衝液(乙酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、組氨酸)-糖(甘露醇、山梨醇、甘油、蔗糖、海藻糖)-輔料(氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、甘氨酸)除此之外，對70mg/ml的TACI_Fc5進行了以下進一步的預篩選研究-用pH5-6-7的20mM緩衝液(組氨酸、磷酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽)進行反覆凍 融(F-T)1、3、5F-T 次；-40°C培育(搖動和不搖動)；-儲存在2_8°C，pH4-5-6，20mM緩衝液(乙酸鹽、組氨酸、磷酸鹽)中。根據這些第一批觀察到的結果，選擇pH 5和6的兩種緩衝液(磷酸鹽和組氨酸)， 製備第二批製劑，用以研究再加入穩定劑(剩餘重量克分子滲透濃度0. 280 0SM)的效果。 測試了以下穩定劑葡萄糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖、甘氨酸、NaCl、MgCl2、CaCl2。將各溶液儲存於2_8°C、25°C和40°C，在14天中對凝聚物(SE-HPLC)、蛋白含量 (RP-HPLC)、pH和外觀進行檢測。實驗設計根據前期所作的選擇，進行實驗設計以評估以前所研究的不同水平的因素對蛋白 質穩定性的影響。對乙酸鹽和組氨酸緩衝液中的製劑進行檢測，同時檢測以下表面活性劑 Poloxamer 188 ( Lutrol F-68)和吐溫20，及以下輔料精氨酸、甘氨酸、賴氨酸、甘露醇和 海藻糖。將這些製劑裝在玻璃小瓶中，貯存於2-8°C、25°C和40°C，檢測凝聚物(SE-HPLC和 AUC)、pH、外觀和重量克分子滲透濃度。也採用生物物理分析方法(如園二色性、2nd UV衍 生光譜法、內螢光法)。候選製劑在預製備期結束時，檢測鑑定了某些候選製劑，含70或lOOmg/mlTACI-FcUOmM乙 酸鹽緩衝液、甘露醇(51mg/ml)或無水海藻糖(80或96mg/ml)為輔料的有或無Poloxamer 188 ( Lutrol F-68) (0. 05mg/ml)，pH4. 8、5. 0、5. 2 和 5. 4。將所有溶液通過0.22 ym Durapore濾膜過濾除菌後收集到滅菌容器中。然後將 溶液裝填到DIN2R玻璃小瓶(1ml填量)中。取製備期間的加工樣品(過濾前、後)評估蛋 白質的損失或凝聚物的增多。將樣品貯存在2-8 V、25 V和40 V，檢測儲存1個月(40°C )和6個月(2_8 V和 25°C )的結果。檢測候選製劑的凝聚物(SE-HPLC)、蛋白含量(RP-HPLC)、pH、重量克分子滲透濃 度和生物學活性。也檢測C-末端截短的程度和截短/修剪形式的比例。還採用了生物物 理方法(內螢光、動態光散射、90°光散射)。也評估了凍-融對2_8°C保存的候選製劑液體樣品的影響-80°C冰凍樣品然後室 溫融化。用SE-HPLC評估凍-融前後的凝聚物含量。評價了模擬藥品裝船運輸搖動24小時對2_8°C保存樣品的影響，將樣品放在微孔 板搖動平臺上室溫搖動24小時後用SE-HPLC評估凝聚物水平並與起初的水平比較。結果候選製劑用10mM NaAc配製。 以下表A-T報告了詳細結果。表A :SE-HPLC測定的總凝聚物百分比％ (2_8°C )
所用批量原料，S128/L20a(10mM乙酸鈉緩衝液，pH = 5. 0)，總凝聚物％= 3. 9 (Tre =海藻糖，Man =甘露醇)。表B SE-HPLC測定的總凝聚物百分比％ (25°C ) 所用批量原料，S128/L20a(10mM乙酸鈉緩衝液，pH = 5. 0)，總凝聚物％ = 3. 9 (Tre =海藻糖，Man =甘露醇)。表D. AUC測定的二聚物百分比％ (2-8°C ) 表E. AUC測定獲得的大凝聚物百分比％ (2-8°C ) 表F. AUC測定獲得的二聚物百分比％ (25°C ) 表G. AUC測定獲得的大凝聚物百分比％ (25°C ) 表H. AUC測定獲得的二凝聚物百分比％ (40°C ) 表I. AUC測定獲得的大凝聚物百分比％ (40°C ) 表L. SE-HPLC測定獲得的蛋白含量(40°C ) 表M.pH 值(2_8°C )
表N.ph值(25°C) 表P.重量克分子滲透濃度(OSM/kg) 表Q.生物學試驗(U/ml) (2-8°C )
結sdt3。/48 x
〔0340〕姆 R. (u/ml) (25。c ) 〔0341U 表S.C－末端截短
主要結果總結分子大小排阻色譜法在25°C，70mg/ml製劑就凝聚率而言，其斜率(％凝聚/月)通常比100mg/ml組 低。在後一組中，製劑21D和21E顯示的斜率最低。40°C時，在100mg/ml液體製劑組中，制 劑21E顯示的斜率值最低。AUC在2-8°C和25°C，未觀察到製劑21E的AUC狀態有所改變，而70mg/ml製劑檢測到 在整個穩定期間(研究)中單體傾向增多。用⑶監測的去摺疊在100mg/ml製劑組中，製劑21E顯示最高的Timf，pH值不同於導致較低Tmf的 5. 0。70mg/ml製劑則顯示較高的Tmf值(即穩定性較好)。內螢光在40°C，檢測到70mg/ml各製劑及100mg/ml組備選製劑21E的最大發射光波長有 微小變化。RALS40°C貯存後，pH不同於「最適pH」 5. 0的製劑其RALS有顯著增高。含甘露醇製劑 的散射光值高於其它製劑。製劑21A、21B、21D和21E是顯示較低散射光值的製劑。2_8°C 貯存後，它們都不顯示任何散射光的增加。
35
螢光發射光的各向異性製劑21A和21B於40°C貯存(1個月)後，未觀察到各向異性的變化。製劑21F和 21H有相關改變，其它製劑觀察到處於二者之間的變化。動態光散射在2_8°C未檢測到大小分布有相關改變。25°C貯存後觀察到較大顆粒有所減少。 40°C貯存後，除了含甘露醇的製劑和pH不同於5.0的製劑外，所有製劑中分子量較高物質 無顯著增加。去摺疊的自由能100mg/ml製劑組中，製劑21D和21E觀察到較高的熱動力學穩定性。生物學試驗25°C和40°C貯存3個月未見生物學活性降低。總體結論對液體製劑的預篩選研究表明，使70mg/ml TACI_Fc5溶液穩定的最佳pH為約 5. 0。pH值越高，出現凝聚現象(用SE-HPLC評價)和濃度下降(用RP-HPLC和光密度估 計)越強烈。鹽的存在(如NaCl、CaCl2*MgCl2)也導致凝聚增加。如在不同緩衝液中(pH =4.0與5.0相比較)的園二色構象研究所示，低於5的pH值不是最適pH。DSC初步研究 表明海藻糖和蔗糖對分子穩定性(即在較高去摺疊溫度時)有某種正面影響。實驗設計階段目的在於研究溶於pH = 5. 0乙酸鹽或組氨酸緩衝液(也試驗不同 緩衝強度)的幾種輔料在存在表面活性劑如Lutrol F-68和吐溫20時的作用。存在甘露醇 或山梨醇時低濃度的乙酸鹽緩衝液為樣品提供了較高的抗降解穩定性。在穩定蛋白質上， Lutrol F-68看來比吐溫20更有效。螢光和動態光散射檢測與這些結果相一致。以實驗室規模製備70mg/ml和100mg/ml濃度的TACI-Fc候選樣品。用海藻糖和 甘露糖作輔料(存在乙酸鈉緩衝液，pH = 4. 8、5. 0、5. 2和5. 4)。用SE-HPLC和AUC及幾種 分光光度法監測候選製劑隨時間的變化。此研究結果是，蛋白濃度越低導致的凝聚也越少。證實最佳pH為5.0。對於穩定 TACI-Fc製劑，海藻糖比甘露醇更成功。在lOOmg/mlTACI-Fc候選製劑中，製劑21E(10mM NaAc,pH = 5. 0，80mg/ml無水海藻糖)顯示了對40°C凝聚更強的抵抗力(2_8°C檢測的凝聚 無統計學相關的增多)。更精確地說，2-8°C候選液體製劑21E在26周內純度提高1. 4%。 25 °C時其純度只降低(26周)。用RP-HPLC分析檢測了候選製劑21E(2_8°C和25°C，10個月)的全部修剪形式，與 起始原料藥(約19% )相比，修剪形式的含量無變化。發現C-末端截短物約95%，與起始 原料藥相似，此水平的截短常見於人抗體。也用RP-MALDI分析了液體候選製劑21E (2_8°C和25°C貯存10個月)中氧化形式 的含量，與製備此製劑的基礎原料藥相比，未見貯存期氧化形式的顯著改變(約2. 4% )。實施例2 :TACI-Fc與抑菌劑的相容性目的此研究的目的是評估多劑量製劑中TACI-Fc與不同抑菌劑的相容性。檢測了以下 抑菌劑0. 9%苯甲醇、0. 3%間甲酚、0. 5%苯酚、0. 5%三氯叔丁醇、0. 5%苯基乙醇、0. 3%苯甲醇+0. 001%苯扎氯銨。主要結果藥品+抑菌劑-有防腐劑存在的藥品與參比樣品(不加抑菌劑)相比，40°C存貯存2周後，觀察 到總凝聚物(用SEC)增多(15-70% ) ；25°C和2_8°C時觀察到降解速率可比。-提供了最少負面影響(根據SEC和CD分析)的抑菌劑是苯甲醇+苯扎氯銨。液體候選製劑+抑菌劑-在TACI-Fc液體候選製劑(乙酸鹽、pH5.0，海藻糖)中加入防腐劑導致的凝聚 顯著低於藥品所導致的凝聚(40°C，2周後約10-25%)。這表明海藻糖有效地防止了天然 二級結構的凝聚和損失(遠紫外CD實驗證明)。_存在防腐劑的製劑組中，就凝聚率而言，苯甲醇+苯扎氯銨聯用提供了最佳結果。結論評價了幾種抑菌劑對TACI-Fc藥品(原批量裝)和用pH 5.0乙酸鈉和海藻糖配 制的100mg/ml TACI-Fc製劑中蛋白質完整性的影響。包含任何這些抑菌劑對蛋白質的完整性均有負面影響，特別是對原批量裝藥品。0.3%苯甲醇+0. 001%苯扎氯銨聯用成為對蛋白質結構有害作用最小的。實施例3 :TACI-Fc液體候選製劑在預裝填針筒中的穩定性目的此研究的目的是評估在用兩種橡皮塞塞住的1ml Hypak針筒(W4023/50和 W4023/50G, FluroTec公司)中充裝的100mg/ml TACI-Fc液體製劑(乙酸鈉，海藻糖， PH5. 0)的穩定性。主要結果對充裝在用塗層塞子(W4023/50G Fluro Tec公司)和無塗層塞子(W4023/50G) 塞住的1ml玻璃針筒中TACI-Fc 100mg/ml進行6個月的檢測，結果小結如下- 二聚體和HMW :40°C (每周增加1. 6% )和25°C (每月增加0. 5% )的降解速率 是可比的。2-8°C觀察到的表現稍有不同，雖然並不明顯影響總體穩定性兩種不同生產批 號每月增加0.2%和0. ；-蛋白質含量蛋白質含量在貯存期未見減少；-修剪形式檢測到與小瓶中產品可比水平的剪接形式(2_8°C時與藥品相比不增 加，25 °C 5個月後約增加40% )；-生物效能生物學活性保持直到3個月(2-8°C和25°C )；-pH 貯存期未見pH變化。結論充裝在1ml Hypak針筒中的100mg/ml TACI-Fc液體製劑(乙酸鈉+海藻糖， pH5. 0)是穩定的。此研究評價的兩種橡皮塞(W4023/50和W4023/50GFluroTeC公司)是等 價的，均不影響該液體製劑的穩定性。實施例4 裝在預充裝針筒中的不同強度ATACICEPT的穩定性評估了裝在預充裝針筒中的不同強度atacic印t的穩定性。按實施例1中報告的方法進行。受試樣品的組合物如下 穩定性研究的結果報告見以下表U-Z。表U. SE-HPLC檢測的純度％5°C貯存 1、2、3、6、9、12 和 18 個月後 25°C貯存1、2、3和6個月後 表V. SE-HPLC測定的蛋白含量(mg/ml)5°C貯存 1、2、3、6、9、12 和 18 個月後 25°C貯存1、2、3和6個月後 25°C貯存1、2、3和6個月後 表X. IEC-HPLC 檢測的游離 Fc %5°C貯存 1、2、3、6、9、12 和 18 個月後 25°C貯存1、2、3和6個月後 表Y.生物學活性(U/ml)5°C貯存 1、2、3、6、9、12 和 18 個月後 25°C貯存1、2、3和6個月後 表Z. pH 測定5°C貯存1、2和3個月後 25°C貯存1、2、3和6個月後 實施例5. BLYS拮抗劑的製備 製備了 4種胺基酸末端截短的TACI-Fc。這4種都含有融合於SEQ IDN0 6的氨 基酸殘基30的修飾的人組織纖維蛋白溶解酶原激活劑序列(如W0 02/094852 (SEQ ID NO: 25)所揭示的)。然而，這4種蛋白中的「Fc5」融合於SEQ ID NO :6的TACI胺基酸序列的 位點不同。表1概括了這4種融合蛋白的結構。
表1. TACI-Fc融合蛋白 採用標準技術通過重疊PCR製備了編碼蛋白的表達盒(參見，例如Horton等， 1989)。採用編碼TACI的核酸分子和編碼Fc5的核酸分子作為PCR模板。表2和3為其鑑 定的寡核苷酸引物。表2.用於製備TACI融合蛋白的寡核苷酸引物 表3.寡核苷酸的序列 第一輪PCR擴增包括4種氨基末端截短物各自的二次反應。分別進行這二次反應， 一次反應用5』和3』 TACI寡核苷酸。另一次反應用各自的5』和3』 Fc5寡核苷酸。第一輪 PCR擴增的條件如下加入約200ng模板DNA、2. 5 u 1 lOxPfu反應緩衝液(Stratagene)、 2 ill的2. 5mMdNTP、0. 5 yl的20 y M各種5 『寡核苷酸和3 『寡核苷酸及0. 5 yl Pfu聚合 酶(2. 5單位，Stratagene)至終體積25 yl。擴增的溫度設置為94°C 3分鐘，35輪94°C 15 秒，50°C 15秒，72°C2分鐘，再於72°C延伸2分鐘。用瓊脂糖凝膠電泳分離反應產物，用 QIAGEN QIAQUICK凝膠抽提試劑盒(Qiagen公司)按照廠商說明書從凝膠中切割並回收對 應於預計大小的條帶。用第一輪PCR凝膠純化的片段作為DNA模板，進行第二輪PGR擴增或重疊PCR 擴增反應。第二輪PCR擴增的條件如下加入約10ng TACI片段和Fc5片段各自的模 板 DNA、2. 5 u 1 lOxPfu 反應緩衝液(Stratagene)、2 ii 1 的 2. 5mMdNTP、0. 5 u 1 的 20 ii M ZC24，903(SEQ ID NO: 15)和 ZC24，946 (SEQ ID NO: 18)及 0. 5 ii 1 Pfu 聚合酶(2. 5 單位， Stratagene)至終體積25 yl。擴增的溫度設置為94 °C 1分鐘，35輪94 °C 15秒、55°C 15 秒、72°C 2分鐘，再72°C延伸2分鐘。用瓊脂糖凝膠電泳分離反應產物，用QIAGENQIAQUICK 凝膠抽提試劑盒(Qiagen公司)按照廠商說明書從凝膠中切割並回收對應於預計大小的條
市o用Invitrogen公司的ZER0BLUNT T0P0 PCR克隆試劑盒按廠商推薦的方案分別分 離4種氨基末端截短的TACI-Fc PCR產物。表4是這些TACI-Fc構建物的核苷酸和胺基酸 序列。表4. TACI-Fc變體的序列 驗證核苷酸序列後，用Fsel和Ascl消化包含4種氨基末端截短TACI-Fc融合核 酸的各自質粒，以釋放編碼胺基酸的區段。將Fsel-Ascl消化片段連接入含CMV啟動子和 SV40聚A區段的哺乳動物表達載體中。如下所述將該表達載體引入中國倉鼠卵巢細胞中。實施例6.用中國倉鼠卵巢細胞生產TACI-Fc蛋白通過電穿孔用TACI-Fc表達構建物轉染已適應懸浮生長的中國倉鼠卵巢細胞 (CH0)DG44細胞，用無動物蛋白的培養基(Urlaub等，1986)培養。CHO DG44細胞由於染色 體的二氫葉酸還原酶有2個位置缺失而缺乏功能性二氫葉酸還原酶基因。在遞增濃度甲氨 喋呤的存在下培養細胞，導致該表達構建物中二氫葉酸還原酶基因和與之相連的編碼重組 蛋白基因的擴增。在PFCH0 培養基(JRH Biosciences 公司，Lenexa，KS)、4mM L_ 穀氨醯胺(JRH Biosciences公司)和lx次黃嘌呤-胸苷添加物(LifeTechnologies公司)中將CHO DG44 細胞傳代。在旋轉振蕩平臺上的Corning搖瓶中於37°C和5% C02條件下以120rpm轉動 培養細胞。分別用線性化的表達質粒轉染細胞。為確保無菌，在冰上的Eppendorf小管中 將200iig質粒DNA與20iiL剪切的矽魚精子載體DNA(5' — 3' Inc. Boulder公司，10mg/ ml)、22ii L 的 3M NaOAc (pH5. 2)禾口 484 u L 的 100 % 乙醇(GoldShield Chemical 公司， Hayward, CA)混合，進行一次乙醇沉澱步驟25分鐘。培育後，用放在4°C冷室中的微量離心 機於14，OOOrpm將小管離心，棄去上清液，用0. 5ml 70%乙醇將沉澱洗滌2次，空氣乾燥。在DNA沉澱乾燥的同時，將25ml錐形離心管中總共106個細胞於900rpm離心5分 鍾，製備CHO DG44細胞。將CHO DG44細胞重懸於總體積300 u 1的PFCH0生長培養基中， 放入有0. 4cm電極間隙的基因-脈衝小杯(Bio-Rad)中。乾燥約50分鐘時間後，將DNA重 懸浮於500iil的PFCH0生長培養基，加入小杯的細胞中，使總體積不超過800 iil，置於室溫 下5分鐘以減少氣泡形成。將小杯置於BioRad基因脈衝器II單元中立即電穿孔，電穿孔 的設置為0. 296kV (千伏)和0. 950HC(高電容)。將細胞室溫培育5分鐘，然後置於CoStar T_75培養瓶總體積20ml的PFCH0培養 基中。將培養瓶置於37°C和5% C02培養48小時，用臺盼蘭排除法染色以血球計對細胞計 數後，將細胞放入無次黃嘌呤_胸苷添加物而含200mM甲氨喋呤(Cal Biochem公司)的 PFCH0選擇培養基中。甲氨喋呤選擇處理回收後，用Western印染分析檢查含所分泌的TACI-Fc蛋白的 條件培養基。
參考文獻Altschul S F 等，J Mol Biol，215，403-410，1990。Altschul S F 等，NucleicAcids Res.，25 :389_3402，1997。Armour KL等，1999. 「缺乏Fc y受體1結合和單核細胞觸發活性的重組人IgG分 子」Eur J Immunol. 29(8) :2613_24。Canfield SM, Morrison SL. 「人IgG與其高親和Fc受體的結合親和力由CH2區 中多個胺基酸決定並受絞鏈區的調節」.J Exp Med 1991 ；173 :1483_1491.Cheema 等，Arthritis Rheum 2001 ；44 (6) :1313_1319。Devereux J 等，Nucleic Acids Res，12，387—395，1984。Do RKG, Hatada E，Lee H, Tourigny MR,Hilbert D，Chen-Kiang S. 「基於 B 細胞 刺激劑對體液免疫應答的增強而使細胞凋亡減弱」.J Exp Med2000 ； 192 (7) :953_964。Duncan 等，Nature 332 563 (1988)。Grantham 等，Science, Vol. 185，pp. 862-864 (1974)。Groom等，J Clin Invest 2002 ；109(1) :59_68 ；Mariette X，Ann Rheum Dis2003 ； 62(2) :168-171。Gross 等，Nature 2000;404:995-999。Horton 等，Gene 77 :61(1989)。Kabat EA，Glusman M，Knaub V. 「用免疫化學方法定量檢測正常和病理腦脊液中 的白蛋白和Y球蛋白」.Am J Med 1948;4:653-662。Kabat, E. A.，ffu, T. T.，Perry, H. M.，Gottesman, K. S.，and Foeller, C. (1991)， 「免疫學感興趣蛋白質的序列」.第5版，國立衛生研究院，Bethesda, MD。Railed SL. "BAFF在免疫功能中的作用和與自身免疫的關聯」.Immunol Rev2005 ； 204 :43-54。Mackay 等，J Exp Me 1999 ；190(11) ；1697-1710。Marsters SA, Yan M, Pitti RM, Haas PE, Dixit VM, Ashkenazi A. "TNF
物BLyS和AraiL與TNF受體同源物BCMA和TACI的相互作用」 .CurrBiol 2000 ；10 (13) 785-788。Moore 等，Science 1999 ；285 (5425) :260_263 ；Schneider 等，J Exp Medl999 ； 189(11) :1747-1756。Do 等，J EXp Med 2000 ； 192 (7) :953_964。Pearson, Methods Enzymol. 1990 ；183 63-98.Roschke V, Sosnovtseva S, Ward CD, Hong JS, Smith R, Albert V 等，「BLyS 和 APRIL形成的生物學活性異質三聚體在全身性免疫風溼疾病患者中的表達」.J Immunol 2002 ； 169 :4314-4321。Rudick 等，Neurology 2001 ；56 1324-1330。Schneider P, Mackay F, Steiner V, Hofmann K, Bodmer J-L, Holler N. 「一種月中 瘤壞死因子家族的新配體BAFF能刺激B細胞生長」.J EXp Medl999 ；189 (11) :1747_1756。Shields RL.等，2001. 「人 IgGl 的 Fc Y RI、Fc Y RII、Fc Y RIII 和 FcRn 結合位點 的高分辨圖譜和具有改進的FcyR結合能力的IgGl變體的設計」.J Biol Chem.276(9)6591-604.Soderstrom M, Link H, Xu Z, Fredriksson S. 「視神經和多發性硬化症抗-MBP 和抗-MBP肽抗體分泌細胞在CSF中的累積」 Neurology 1993 ；43 1215-1222。Sondermann 等，Nature 406 267 (2000)。Tao M_H，Smith RIF, Morrison S L. 「人免疫球蛋白IgG的結構特徵決定了補體 激活的同種型差異」 .J Exp Med 1993 ；178 :661_667。Thangarajh M, Gomes A，Masterman T，Hillert J，Hjelmstrom P. 「多發性硬化症 中TNF家族B細胞活化因子(BAFF)及其受體的表達」JNeuroimmunol 2004 ；152 :183_190。Thompson JS, Bixler SA, Qian F, Vora K, Scott ML, Cachero TG. BAFF-R, 「一禾中 新鑑定的能與BAFF特異性相互作用的TNF受體」 Science 2001 ；293 :2108_2111。Urlaub 等，Som. Cell. Molec. Genet. 12 555 (1986)。Wines 等，J. Immunol. 164 5313 (2000)。
權利要求
一種製劑，包含a)TACI-免疫球蛋白(TACI-Ig)融合蛋白，其包含i.TACI的胞外結構域或其能結合BLyS和/或APRIL的片段或變體；和ii.免疫球蛋白的恆定區；和b)使製劑的pH範圍維持在4.5-5.5之間的緩衝液。
1.TACI的胞外結構域或其能結合BLyS和/或APRIL的片段或變體；和 .免疫球蛋白的恆定區；和b)使製劑的pH範圍維持在4.5-5. 5之間的緩衝液。
2.如權利要求1所述的製劑，其pH範圍為4.7-5. 3，或4. 9-5. 1，或pH5. O。
3.如權利要求1或2所述的製劑，其中所述緩衝液選自乙酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、檸 檬酸鹽和組氨酸緩衝液。
4.如以上權利要求中任何一項所述的製劑，其中所述乙酸鹽緩衝液是乙酸鈉。
5.如權利要求4所述的製劑，其中所述乙酸鈉的濃度是5-25mM。
6.如以上權利要求中任何一項所述的製劑，該製劑還包含海藻糖。
7.如權利要求6所述的製劑，其中所述海藻糖的濃度範圍為60-100mg/ml。
8.如權利要求7所述的製劑，其中所述TACI-Ig融合蛋白的濃度在70-100mg/ml之間， 所述海藻糖的濃度在80-100mg/m之間，所述緩衝液是IOmM乙酸鈉緩衝液。
9.如以上權利要求中任何一項所述的製劑，該製劑還包含防腐劑。
10.如權利要求9所述的製劑，其中所述防腐劑是苯甲醇聯合苯扎氯銨。
11.如以上權利要求中任何一項所述的製劑，其中所述TACI-Ig片段包含SEQID NO 1的胺基酸殘基34-66和/或胺基酸殘基71-104。
12.如權利要求11所述的製劑，其中所述片段包含SEQID NO :1的胺基酸殘基30-110， 或與其至少90%相同或少於10個保守性胺基酸替代的變體，所述變體能結合BlyS和/或 APRIL0
13.如以上權利要求中任何一項所述的製劑，其中所述免疫球蛋白恆定區來自人IgGl 的恆定區。
14.如權利要求13所述的製劑，其中所述人IgGl恆定區包含SEQIDNO :2序列，或其 含少於20個保守性胺基酸替代的變體。
15.如以上任何一項權利要求所述的製劑，該製劑包含SEQID NO :3序列，或與其至少 90%相同或少於30個保守性胺基酸替代的變體，所述變體能結合BlyS和/或APRIL。
16.如以上任何一項權利要求所述的製劑，該製劑包含的所述TACI-Ig融合蛋白濃度 範圍為 20-180mg/ml。
17.如以上任何一項權利要求所述的製劑，其中所述製劑是液體劑型。
18.如以上任何一項權利要求所述的製劑，其中所述製劑是多劑量給藥用製劑。
19.一種包含以上權利要求任何一項所述製劑的藥物組合物。
20.如權利要求1-18任何一項所述的製劑或權利要求19所述的藥物組合物，所述製劑 或藥物組合物用於治療自身免疫性疾病或淋巴增殖性疾病。
21.一種製備權利要求1-18任何一項所述製劑的方法，該方法包括製備TACI-Ig融合 蛋白液體溶液和調節所述液體溶液的PH至4. 5-5. 5或4. 7-5. 3或4. 9-5. 1範圍或pH5. 0 的步驟。
22.如權利要求21所述的製備製劑的方法，所述方法包括將預定量的所述製劑放置在 滅菌容器中的步驟。
23.如權利要求22所述的方法，其中所述容器選自玻璃小瓶或預裝填的針筒。
全文摘要
本發明涉及TACI-免疫球蛋白融合蛋白製劑。
文檔編號A61K47/00GK101854951SQ200880115935
公開日2010年10月6日 申請日期2008年11月12日 優先權日2007年11月12日
發明者A·德爾裡奧, G·裡納爾迪, J·裡查德 申請人:阿雷斯貿易股份有限公司