草甘膦抗性轉基因植物的製作方法

2023-11-03 08:43:57 1

專利名稱：草甘膦抗性轉基因植物的製作方法
技術領域：
本發明涉及能耐受草甘膦作為活性成分的除草劑處理的轉基因甜菜植株。
甜菜田間的雜草是農場主的主要問題。它們與農作物競爭因此而降低產量。現在沒有單一的除草劑能有效控制所有雜草而不損傷甜菜作物本身(Miller等，甜菜研究雜誌，263-4，1989)。實際上，農場主使用除草劑的混合物，而它們也降低農作物生長。同時，已發展出對所述除草劑抗性的野草種類的數目持續增加(Schweizer等，甜菜研究雜誌，281-23，1991)，由此加重了甜菜田間雜草控制問題。
Roundup是廣譜的、環境上優選的抑制雜草和農作物種類的除草劑。本發明的內容中，1升除草劑Roundup溶液含有260g其活性成分，即被葉吸收的草甘膦(常用名為N-膦醯基甲基-甘氨酸)。到目前為止，在20年使用期間沒有發展出草甘膦抗性雜草(Holt等，植物生理學年鑑，1993)；另外在甜菜中沒有發現對草甘膦的耐受性。而且Roundup的預先使用在甜菜田間控制雜草方面比甜菜農業中常用的含有苯敵草、苯嗪草酮、甜菜呋的除草劑混合物更有效(Madsen等，雜草研究，35105-111，1995)。
草甘膦通過不可逆地與5-烯醇丙酮酸莽草酸鹽-3-磷酸合成酶(epsps)結合抑制芳香族胺基酸的生物合成。在葉綠體中，此酶催化莽草酸鹽-3-磷酸和烯醇磷酸丙酮酸形成5-烯醇丙酮酸-3-磷酸和磷酸。在施用除草劑後約一周，可看到肉眼可見的效應，包括萎蔫、黃化後完全變褐，植物組織的萎凋和根的腐爛。
為賦予農作物種類草甘膦耐受性，研究集中於向植物導入能增加草甘膦耐受性的epsps基因。除了植物，細胞和真菌也天然地表達epsps酶活性。發現來自農桿菌屬種類的cp4/epsps賦予對草甘膦的耐受性(Barry等，「胺基酸合成的抑制劑賦予農作物植株對草甘膦耐受性的策略，於植物中胺基酸的生物合成和分子調控，Singh等(編輯)，美國植物生理學學會，第139-145頁，1992)。將cp4/epsps基因導入大豆和油籽油菜在田間條件產生對葉面施用除草劑的耐受性(Delannay等，農作物科學，351461-1467，1995；Padgette等，農作物科學，351451-1461，1995)。
從農桿菌屬種類LBAA分離的草甘膦氧化還原酶(gox)(Barry等，同上)將草甘膦降解成氨甲基膦酸(對植物無毒的化合物)。cp4/epsps和草甘膦氧化酶(gox)基因的結合已成功地用於得到對草甘膦有抗性的轉基因小麥(Zhou等，植物細胞報告，15159-163，1995)。
本發明的目的是提供對足以實現最佳除草劑活性的高劑量的草甘膦有耐受性的甜菜植株。這樣的植株可進一步通過與優良甜菜株系回交來改良以優化農業特性如產量、病原體抗性等。
甜菜可以用根瘤農桿菌介導轉化方法來轉化(Fry等，植物分子生物學第三次國際會議，Tuscon，Arizona，USA；D′Halluin等，生物/技術，10309-314，1992；Konwar，植物生化生物技術雜誌，337-41，1994)。農桿菌介導的轉化常常導致多於一個拷貝的T-DNA整合入植物基因組。優選地將要整合的基因導入T-DNA，使它位於T-DNA右邊則不是左邊界附近，它幾乎總是會轉移至植物中。
根據本發明所述的植株對每公頃大約3×6升除草劑Roundup(每公頃約18升)的處理有耐受性。獲得良好雜草控制的總標準劑量根據雜草壓力在每公頃4-6升之間變動。在這些濃度時，除草劑處理不產生對植物活力和葉褪綠的任何可測到的影響。根據本發明所述的植株表現的耐受性由轉基因表達的cp4/epsps酶活性賦予。本發明優選的實施方案已於1997年10月24日保存於國立工業和海洋微生物保藏有限公司(23St Macher Drive，Aberdeen AB2 1RY，ScotlandUK)，保藏號為97087006/2。
因此本發明涉及表達cp4/epsps酶活性的甜菜植株及其後代。具體地，本發明涉及對每公頃約4至約8升Roundup處理有耐受性的甜菜植株及其後代。
根據本發明所述的植株可以通過使用在T-DNA左和右邊界序列間含有如SEQ ID No5所述編碼尤其是cp4/epsps的DNA片段的轉化載體進行常規農桿菌介導的轉化得到。
在本發明的範圍內令人驚訝地發現，在轉基因的基因組內缺失T-DNA左和右邊界序列並導致轉化載體DNA相當大部分的缺失而保留了編碼cp4/epsps的DNA的轉化結果(RRMax)提供了優良的草甘膦耐受性。特別是發現以SEQ ID No1為特徵的DNA片段整合入基因組高度重複的區域同時取代了該基因組重複序列的部分。與所用轉化載體中與T-DNA右邊界序列相連的轉基因序列部分直接相鄰的基因組DNA具有SEQ ID No2中給出的序列。與整合的轉基因DNA的另一末端直接相鄰的基因組DNA具有SEQ ID No3中給出的序列。新形成的基因組DNA排列的完整DNA序列在SEQ ID No4中給出。
因此，本發明涉及甜菜植株及其後代，其中以SEQ ID No1的核苷酸序列為特徵的DNA形成植物基因組的部分，並且介所述的核苷酸序列取代了植物基因組內高度重複DNA序列。
此處優選的是其中與所述核苷酸序列直接連接的那些基因組部分分別以SEQ ID No2和SEQ ID No3的核苷酸序列為特徵的甜菜植株及其後代。
進一步優選的是其中以SEQ ID No4的核苷酸序列為特徵的DNA形成植物基因組的部分的甜菜植株及其後代。
上述經操作已導入除草劑抗性的轉基因種子和植株通過性繁殖或營養生長傳代並因此可以在後代植株中保持和繁殖。通常所述的維持和繁殖使用已知的農業方法，這些方法發展來適應特別目的如耕種、插種或收穫。正在生長的農作物易於受由昆蟲或感染引起的侵襲和損傷，因此採取措施以控制植物病毒、昆蟲、線蟲和其它對提高產量不利的條件。這些措施包括機械措施如耕地或除去受侵染的植物和施用農業化學品如殺真菌劑、殺精劑、殺線蟲劑、生長調節劑、成熟劑和殺昆蟲劑。
根據本發明所述的轉基因植物和種子的除草劑耐受性可進一步在植物育種中得到應用，以開發具有改良特性(如蟲害、除草劑或逆境耐受性，改良的營養價值，提高的產量，引起更小的由於倒伏或斷裂的損失的改良結構)的植物。各種育種步驟的特徵在於成熟的人類幹預如選擇要雜交的株系、引導親本株系的傳粉或選擇適當的後代植株。根據所需的特性採取不同的育種措施。相關技術在本領域內眾所周知並且包括但不限於雜交、近交、回交育種、多線育種、品種摻合、種間雜交、非整倍體技術等。因此，根據本發明所述的轉基因種子和植株可用於培育改良的植物株系，例如用於提高傳統方法如除草劑或殺蟲劑處理的效力或由於其修飾的遺傳特性而允許用所述方法施用。選擇性地，可以得到具有改良的逆境耐受性的新農作物，由於它們的優化遺傳裝備，產生比不能耐受相對不利發育條件的產品更高質量的收穫產品。
在種子生產中，發芽質量和種子的均一性是必需的產品特徵，而農場主收穫和出售的種子的發芽質量和種子均一性並不重要。因為使農作物與其它農作物和雜草種子分開、控制種生疾病和生產具良好發芽率的種子是困難的，所以在培養、控制和銷售純種子領域有經驗的種子生產者已開發了相當廣泛和成熟的種子生產技術。因此農場主常用的方法是購買經鑑定符合特定質量標準的種子而不是使用從他自己的農作物收穫的種子。用作種子的繁殖材料習慣用含有殺蟲劑、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑或其混合物的保護劑塗層處理。常規使用的保護劑塗層包含諸如克菌丹、萎鏽靈、福美雙(TMTD)、methalaxyl(Apron)和蟲蟎磷(Actellic)的化合物。如果需要，將這些化合物與其它載體、表面活性劑或配製領域常規使用的促進施用佐劑一起配製以提供針對由細菌、真菌或動物蟲害引起的損傷的保護。保護劑塗層可以通過用液體製品浸漬繁殖材料或通過用混合的幹或溼配方包裹來施用。也可能是其它施用方法如直接處理芽或果實。
本發明的另一方面提供新的農業方法如上面列舉的方法，其特徵在於使用根據本發明所述的轉基因植物、轉基因植物材料或轉基因種子。
在另一實施方案中，本發明涉及來自轉基因植物的轉基因植物細胞、組織、器官、種子或植物部分。本發明也包括轉基因植物後代及後代的轉基因植物細胞、組織、器官、種子和植物部分。
本發明進一步涉及含有能表達cp4/epsps的具Roundup耐受性的甜菜種子的商品包及其使用說明。本發明內優選的是包含含有穩定整合入其基因的具有SEQ ID No1所示核苷酸序列的DNA片段的轉基因植物種子的商品包。
所用的轉化方法學總結如下(a)用含有如SEQ ID No5中所示的編碼cp4/epsps的DNA片段的載體，使用根瘤農桿菌轉化體外培養的甜菜子葉。
(b)在草甘膦存在時再生芽；(c)將芽轉移到溫室的土壤中；(d)用處理苗；(e)對植株活力和葉褪綠進行目測評級；(g)選擇未受草甘膦處理影響的具有正常活力和葉子的完全正常的植株；並且(h)使用傳統育種技術繁殖所選植株。
具體地，在選擇8-12周後，在約0.1至約10mM，優選地1mM草甘膦存在時再生芽。每個轉基因芽進一步繁殖成10個拷貝，在將它轉移至溫室中生根前，可以用聚合酶鏈式反應(PCR)分析cp4/epsps轉基因的存在。溫室中光照條件是16小時光照和8小時黑暗，溫度為22±2℃。在3-4葉期，用每公頃0.1-20升，優選地1升劑量的Roundup水溶液噴灑苗。草甘膦施用後2周基於0(死亡植株)到9(完受未受影響的植制)的等級對單個植物進行植株活力和植物褪綠的目測損傷評級。0-3的評級是易感植物的特徵。3-7的評級表明耐受性的低至中間水平，8或9的評級表明耐受性的良好水平。具體地，評級有以下意義9與未處理的對照相同的未受影響的植株8隻有葉尖上很小的壞死，少於5％的葉面積受到影響並黃化7葉尖上很小的壞死開始捲曲，少於5％的葉面積受到影響並黃化6，5，4壞死和葉捲曲增強；葉變得比正常的更小3，2沒有或非常有限的葉生長；所有的葉子捲曲並受壞死影響1無植物生長，最多5％的植株保持綠色0死亡植株為收集田間實驗數據，通過傳統技術進一步繁殖或培育有正常活力並且不受草甘膦處理影響的(評分9)植株。
優選地，使用含有具有SEQ ID No5給出序列的DNA片段的載體進行轉化，其中DNA片段含有cp4/epsps和gox基因(都已被報導賦予某些植物種類對草甘膦的耐受性)和報告基因UidA基因(編碼β-葡糖醛酸酶)。增強的35S啟動子(odell等，自然313810-812，1995)與UidA基因相連，玄參花葉病毒(FMV)啟動子(Gouwda等，J.Cell.Biochem.Suppl.13D301，1989)與cp4/epsps和gox基因相連。在cp4/epsps和gox基因的上遊插入轉運肽(Gasser等，生物化學雜誌，2634280-4289，1988)以將兩個蛋白靶向葉綠體。
令人驚奇地發現，根據本發明產生的一個轉化結果不受每公頃多達約3×6升(約18升)除草劑Roundup劑量的影響。分子分析表明·有整合於單一位點的單拷貝轉基因DNA；·整合的DNA編碼cp4/epsps並對應於截短的載體DNA；·整合的DNA取代了基因組DNA片段並具有SEQ ID No1所示的序列；·與整合的DNA直接相鄰的基因組DNA的特徵在於SEQ ID No2和SEQ ID No3的序列，導致SEQ ID No4的新基因組序列排列；
·cp4/epsps和UidA基因是完整的，而gox因是截斷的；·其它載體序列不存在於轉基因植物中。
目前可以知道這一信息，即來自根據本發明所述的特定轉化結果的植株可以容易地通過PCR方法與其它甜菜植株區分開。適當的引物對組合使得可以特異地鑑定僅存在於直接或間接來自相同轉化結果的植物的基因組DNA序列。這樣的事件不以任何方式限制在由農桿菌介導的轉化得到的那些結果，而也可以來自biolistic轉化實驗。
因此本發明涉及甜菜植株及其後代，其特徵在於用其基因組DNA為模板的PCR導致以下片段的擴增當使用以SEQ ID NoB和SEQ ID Noa的序列為特徵的寡核苷酸引物對時，739bp DNA片段；或者當使用以SEQ ID NoD和SEQ ID Noe的序列為特徵的寡核苷酸引物對時，834bp DNA片段；或者當使用以SEQ ID NoA和SEQ ID Nob的序列為特徵的寡核苷酸引物對時，1057bp DNA片段；或者當使用以SEQ ID NoC和SEQ ID Nof的序列為特徵的寡核苷酸引物對時，1224bp DNA片段。
實施例以下實施例進一步描述了得到本發明和隨後的結果時所用的材料和方法。它們通過舉例說明提供，並且它們的複述不應認為是要求權利的本發明的限制。實施例1甜菜轉化用含有cp4/epsps和gox因(能賦予草甘膦耐受性)、nptII基因(典型對抗生素卡那素的抗性)及報告基因uidA(編碼β-葡糖醛酸酶。GUS)的載體轉化A1012基因型甜菜。nptII和uidA基因與加強的35S啟動子(odell等，自然，313810-812，1995)功能性連接，而cp4/epsps和gox基因在玄參花葉病毒(FMV)啟動子(Gouwda等，J.Cell.Biochem.Suppl.13D301，1989)的控制下。另外，cp4/epsps和gox基因在5′與轉運肽(Gasser等，生物化學雜誌，2634280-4289，1988)連接以使兩個蛋白靶向葉綠體。cp4/epsps和uidA使用E9 3′終止子序列，而gox和nptII使用相應的NOS 3′序列。
使用根瘤農桿菌轉化體外培養的甜菜(Beta vulgaris.L)。使用1mM濃度的草甘膦作為選擇劑，如Fry等(「使用根瘤農桿菌的基因型依賴的甜菜轉化」，第三次植物分子生物學國際會議，Tuscon，Arizona，USA，1991)和Konwar(植物生物化學及生物技術雜誌，337-41，1994)所述使植物再生。為殺滅根癌農桿菌，將子葉在含500mg/l頭孢的MS培養基中培養三次(45-50rpm，60分鐘)。在1mM草甘膦和500mg/l頭孢噻肟上篩選8-12周(包括每三周轉至新鮮培養基上)後分析再生芽。將每一轉基因芽進一步微量繁殖(micropropagate)成十個拷貝，分析轉基因的存在並轉移至溫室中生根。
聚合酶鏈式反應(PCR)用於確定cp4/epsps基因的存在。從再生的體外芽收集20mg植物材料至微量離心管。基本上按照Tai等，植物分子生物學報告，8297-303，1990抽提總DNA。次要的改進是加入500μl含有50mM Na-EDTA，1.25％SDS(重量/體積)，0.38％Na-Bisulfite(重量/體積)和200μg/ml蛋白酶K的100mM Tris-HCl(pH8.0)並於65℃溫育2小時。挑出未溶解的葉材料並於-20℃冷凍和沉澱總DNA 2小時。用Perkin-Elmer Gene-Amp PCR試劑盒(Perkin-Elmer公司)按照所含的說明進行PCR，使用含有10mMTris-HCl(pH8.3)，500mM KCL，30mM MgCl2，1.0％NonidetP-40(重量/體積)，24％蔗糖(重量/體積)中的0.4μM甲酚紅和Taq Start Antibody(Clontech)的修飾的10×反應緩衝液。為擴增cp4/epsps序列，使用如下引物(Shah等，科學，233478-481，1986)5′-CAC CGG TCT TTT GGA AGG TGA AG-3′(SEQ ID NO6)和5′-AAC GAG ACC CAT AAC GAG GAA GC-3′(SEQ ID NO7).為擴增基因間調控序列(surA，surB)，使用如下引物5′-AAA CAG TCC CGT GCA TCC CCA AC-3′(SEQ ID NO8)和5′-GAC GCT CTC CTT GAT TCT GTC CC-3′(SEQ ID NO9).
不同雙元載體間未見到轉化效率的不同。
將微量繁殖的芽轉移到溫室的土壤中。溫室中的光照條件是200μmol m-2sec-1(Osram Power Star HQI-Z，400w)，16小時光照，8小時黑暗，溫度為22±2℃。用Roundup處理來自260個獨立轉化子的三至四葉期小苗。使用刻度噴霧器以每公頃1升的劑量(360g.a.i.l-1)施用除草劑的水溶液。草甘膦施用後2周，基於0(完全葉壞死)至9(無可見影響)的等級，對每個植株進行植物毒性影響的目測損傷評級。對於75個不同的轉化子，檢測到的植物毒性效應在評分0-6之間變動。其它185個(75％)轉化子評分為7或更高，這意味著在用除草劑處理之後，它們表現較少或不可見的影響。將它們與非轉基因甜菜雜交以產生F1子代用於隨後的田間實驗評估。
進行田間實驗以評估田間條件下的不同轉化結果。每一塊地包含三排，每排9米長，行間距0.5米。在每一塊地插種一個不同的轉化子。在子葉期每公頃1升(360g.a.i.l-1)的初始Roundup施用去除非轉基因植物後，人工挑選各行至最終標準每20釐米1個植株。每一小塊地分成獨立處理的三部分。一部分用傳統的除草劑苯嗪草酮(0.1kg a.i.ha-1)、苯敵草(0.2kg a.i.ha-1)和甜菜呋(0.1kg a.i.ha-1)處理。另一部分用每公頃2升Roundup處理2次(1400g a.i.ha-1)，第三部分用4升Roundup處理2次(2880ga.i.l-1)，在二葉期和四葉期處理植物。最後施用後二周，評估植物由於施用除草劑的植物毒性效應。發現症狀從完全易感變化至完全耐受。觀察到溫室中評分和田間實驗中評分的不同。這可能是由於溫室和田間實驗的環境不同，包括在玻璃下缺少紫外光。與用傳統除草劑混合物處理相比，用不同劑量的Roundup處理的地區的植物間沒有形態學或生理學上的變化。兩個轉化子在用每公頃2升2次和4升2次處理後，表現對Roundup的高度耐受性。
用Roundup噴酒後，通過植株活力(Tr.vig)和葉褪綠(Tr.ch1)評級測定耐受性。不同的評級有如下意義9與未處理的對照相同的未受影響的植株8隻有葉尖上很小的壞死，少於5％的葉面積受到影響並黃化7葉尖上很小的壞死開始捲曲，少於5％的葉面積受到影響並黃化6，5，4壞死和葉捲曲增強；葉變得比正常的更小3，2沒有或非常有限的葉生長；所有的葉子捲曲並受壞死影響1無植物生長，最多5％的植株保持綠色0死亡植株用1+4+4升Roundup/公頃(共9升/公頃)噴灑22個不同的轉化結果(1-22項)和一個非轉基因對照(23項)。目測損傷評級的結果在下表中給出。
RRMax)(非轉基因植物)實施例2 整合的轉基因DNA的拷貝數通過對在所用轉化載體的左和右邊界序列之外延伸的限制性片段的Southern印跡分析測定具有最高草甘膦耐受性的轉化子(RRMax)的基因組內整合的轉基因DNA的拷貝數。
按照Saghai-Maroof等，美國國家科學院院報，818014-8018，1984，從250mg冷凍乾燥的甜菜材料分離來自RRMax和具有相同遺傳學的非轉基因植物的基因組DNA。所用轉化載體的DNA作用為陽性對照。用120單位的限制性酶在400μl總體積中於37℃消化15μgDNA 4小時。使消化的DNA沉澱並重新溶解於50μl總體積中。消化的DNA、陽性對照質粒和標準的分子大小標記(用EcoRI和HindIII消化的λDNA)在0.8％瓊脂糖凝膠上分離。用溴化乙錠觀察DNA，並包括尺子進行攝影。然後將DNA轉移到Hybond N+膜上並如Ausubel等(編輯)，於「現代分子生物學常用方法」，Green PublishingAssociates，Inc.和John WileySons，Inc.，New York，1987所述與探針雜交。
通過聚合酶鏈式反應(PCR，其中所用的轉化載體作用為反應的模板DNA)製備與cp4/epsps基因序列(SEQ ID No5)的975-1766鹼基對和gox基因序列(SEQ ID No5)的7108-7535鹼基對互補的探針。cp4/epsps探針用於測定鄰近右邊界區域的插入數。gox探針用於測定鄰近左邊界區域的插入數。使用BIO 101(La Jolla，CA)的Geneclean II試劑盒純化PCR產物。使用AmershamInternational(Little Chalfont，UK)的MegaprimeTMDNA標記系統進行探針的32P標記。
拷貝數測定可以通過對鄰近右邊界區域的基因組DNA的分析進行。用限制性酶NcoI消化基因組DNA，NcoI切割35s啟動子和uidA基因間的和甜菜基因組內的質粒來源的序列。用cp4/epsps基因的內部PCR片段探測膜。用NcoI消化並用cp4/epsps探針雜交後，在RRMax中檢測到4.7kb的單一條帶。這證明了轉移DNA在單一位點的單拷貝。
拷貝數測定可以通過對鄰近左邊界區域的基因組DNA的分析進行。用限制性酶HindIII消化基因組DNA，HindIII切割gox的FMV啟動子和uidA基因的E93′終止子間的和甜菜基因組內的質粒來源的序列。在用HindIII消化並用gox探針雜交後，檢測到轉化子在RRMax中的2.0kb的單一條帶。因為預期的最小片段大小是≥4.4kb，所以結果表面在轉移入植物基因組DNA的過程中質粒DNA的截斷。而且結果證明了轉移DNA單拷貝整合在單一位點。實施例3 RRMax整合位點的序列分析按照Saghai-Maroof等，同上，從250mg冷凍乾燥的甜菜葉材料分離RRMax基因組DNA。製備在XhoI克隆位點中帶有9-23kb大小插入的λFIXII噬菌體文庫。並用cp4/epsps和gox探針探測以篩選覆蓋整合結果的推測克隆。檢測到與cp4/epsps或gox探針雜交的總共25個噬菌體。發現分別與cp4/epsps探針和gox探針雜交的2個克隆。純化其中之一(Fritsch等，1987)並通過Southern印跡分析和PCR進一步評估。它含有15-16kb的基因組DNA插入，包括轉基因DNA和側翼的甜菜序列。所述側翼序列通過PCR、使用與FMV啟動子或gox基因序列匹配的引物結合與λFIXII克隆元件中的序列匹配的引物(詳細的序列在下面1中給出)來擴增。整合的DNA/甜菜接合區域通過Sanger雙脫氧介導的鏈終止法使用Applied Biosystem，373A型，2.1.1版測序。所用的測序引物在表2中給出。
表1用於擴增邊界區域的引物
序列分析表明整合在RRMax基因組中的轉基因DNA具有SEQ IDNo1中給出的核苷酸序列。整合起始點位於右邊界序列和FMV啟動子之間並終止於gox起始密碼子下遊的897鹼基對。截短的gox基因的翻譯終止密碼子可在接合點下遊的130和235鹼基對找到。在gox起始密碼子下遊210鹼基對識別了一個HindIII位點，而在下遊650鹼基對識別了一個轉錄終止信號(AATAAA)。SEQ ID No2表示了與轉基因DNA的右邊界區域直接相連的基因組DNA序列，而SEQ ID No3表示與轉基因DNA的左邊界區域直接相連的基因組DNA序列。實施例4 RRMax整合的轉基因DNA的特徵鑑定為進一步鑑定右邊界區域，用限制性酶BamHI、HindIII、BcII或EcoRI消化基因組DNA和轉化載體DNA。在Southern印跡分析中，用實施例2中所述的cp4/epsps PCR片段探測切開的DNA。與所用的限制性酶無關，用不同的限制性酶消化在Southern印跡分析中產生單一片段。檢測到的片段大小在表3中表示。數據表明單一拷貝的DNA已轉移至植物中，並且DNA向甜菜植株的轉移導致cp4/epsps基因的完整轉移。結果與實施例2中的拷貝數測定和實施例3的核苷酸序列一致。
表3 Southern印跡片段大小
為進一步鑑定整合的轉基因片段，用限制性酶NcoI、BamHI或HindIII消化來自RRMax的基因組DNA。作為對照，用相同的限制性酶消化轉化載體DNA。用橫跨SEQ ID No5中uidA基因的3796-4837鹼基對的PCR擴增的DNA片段探測印跡。檢測到的片段大小在表4中表示。與所用的限制性酶無關，用不同的限制性酶消化在放射自顯影膠片上產生單一信號，這表明DNA插入具有與所用轉化載體的內部DNA相同的特徵。
表4 Southern印跡片段大小
為進一步鑑定左邊界區域，用限制性酶NcoI、BamHI、HindIII或EcoRI消化轉化載體DNA。在Southern分析中用實施2中所述的goxPCR片段探測切開的DNA。檢測到的片段大小在表5中表示。與所用的限制性酶無關，用不同的限制性酶消化在放射自顯影膠片上產生單一片段。用限制性酶NcoI、BamHI、HindIII或EcoRI消化預期識別已知大小的內部片段。但是，這些限制性酶沒有產生這樣的預期大小的內部片段。這表明NcoI、BamHI、HindIII或EcoRI的限制性位點在轉基因植物中缺乏。這些結果與通過測序發現的gox基因僅部分整合入植物的結果一致。用限制性酶HindIII消化產生的2kb片段，進一步確定了測序數據，即HindIII位點位於基因組中gox基因的下遊。結果也表明轉基因DNA的單拷貝已轉移到植物中。它們與實施例2中的拷貝數測定和實施例3中的核苷酸序列分析的最初結果很好地相關。單一拷貝已整合入植物基因組，而gox基因部分缺失。
表5Southern印跡片段大小
實施例5其它載體DNA序列的缺失為確定轉化結果RRMax中oriV，ori-322，aad和nptII序列的缺失，Southern印跡分析可以使用覆蓋oriV，ori-322，add和nptII的限制性酶/探針組合進行。
用限制性酶NspI消化轉化載體DNA，NspI在17處位點切割質粒。為了分析，純化覆蓋oriV的NspI片段和覆蓋ori-322和aad的片段並用於Southern印跡分析。具有SEQ ID No26中給出的核苷酸序列的PCR擴增的片段用於探針nptII列。用BIO 101(La Jolla，CA)的Geneclean II試劑盒純化。用Amersham International(Littlechalfont，UK)的MegaprimeTMDNA標記系統進行P32的標記。
用限制性酶BamHI消化RRMax的基因組DNA，BamHI在分別位於SEQID No5的鹼基對2321、5544和8413的三處位點切割轉化載體DNA。相應Southern轉移膜與覆蓋oriV探針的雜交沒有檢測到信號，必然得出結論oriV不存在於RRMax中。
相應Southern轉移膜與覆蓋ori-322和aad的探針的雜交沒有檢測到信號。必然得出結論ori-322和aad序列不存在於RRMax中。
相應Southern轉移膜與nptII探針的雜交也未檢測到信號，這證明nptII基因不存在於RRMax株系中。實施例6 RRMax株系的穩定性如實施例2中所述的用限制性酶BcII消化基因組DNA並使用cp4/epsps基因作為探針進行Southern印跡分析。來自2和3代的四株植物和來自4代的5株植物用於此分析。另外，3株非轉基因植物用作負對照。最初轉化結果的分析得到3.2kb的單一片段。如果導入的DNA在代與代之間穩定遺傳，那麼預期在所有植株中有相同的3.2kb片段。
如實施例2中所述的用HindIII消化基因組DNA並用gox基因的內部片段作為探針進行Southern印跡分析。最初轉化結果的分析得到2.0kb的單一片段。子代的Southern印跡分析也得到2.0kb的單一片段，表明特徵的穩定遺傳。實施例7 RRMax的PCR測定。
如實施例2中所述製備RRMax株系的基因組DNA。在PCR反應中，約0.5μg DNA用作模板DNA，且使用以表6中給出的序列為特徵的特定引物組合，所述的特定組合和擴增片段的大小在表7中給出。在每個30-35擴增循環中，根據引物對組合，使用55℃和65℃之間的退火溫度。
表6引物序列
序列表(1)基本信息(i)申請人NOVARTIS AG(A)街道Schwarzwaldallee 215(B)城市Basel(C)國家瑞士(D)郵政編號4058(E)電話+41 61 324 11 11(F)傳真+41 61 322 75 32(ii)發明名稱轉基因植物(iii)序列數27(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)(2)關於SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度8012個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO1AACGACAATC TGATCCCCAT CAAGCTTGAG CTCAGGATTT AGCAGCATTC CAGATTGGGT 60TCAATCAACA AGGTACGAGC CATATCACTT TATTCAAATT GGTATCGCCA AAACCAAGAA 120GGAACTCCCA TCCTCAAAGG TTTGTAAGGA AGAATTCTCA GTCCAAAGCC TCAACAAGGT 180CAGGGTACAG AGTCTCCAAA CCATTAGCCA AAAGCTACAG GAGATCAATG AAGAATCTTC 240AATCAAAGTA AACTACTGTT CCAGCACATG CATCATGGTC AGTAAGTTTC AGAAAAAGAC 300ATCCACCGAA GACTTAAAGA TAGTGGGCAT CTTTGAAAGT AATCTTGTCA ACATCGAGCA 360GCTGGCTTGT GGGGACCAGA CAAAAAAGGA ATGGTGCAGA ATTGTTAGGC GCACCTACCA 420AAAGCATCTT TGCCTTTATT GCAAAGATAA AGCAGATTCC TCTAGTACAA GTGGGGAACA 480AAATAACGTG GAAAAGAGCT GTCCTGACAG CCCACTCACT AATGCGTATG ACGAACGCAG 540TGACGACCAC AAAAGAATTC CCTCTATATA AGAAGGCATT CATTCCCATT TGAAGGATCA 600TCAGATACTG AACCAATCCT TCTAGAAGAT CTAAGCTTAT CGATAAGCTT GATGTAATTG 660GAGGAAGATC AAAATTTTCA ATCCCCATTC TTCGATTGCT TCAATTGAAG TTTCTCCGAT 720GGCGCAAGTT AGCAGAATCT GCAATGGTGT GCAGAACCCA TCTCTTATCT CCAATCTCTC 780GAAATCCAGT CAACGCAAAT CTCCCTTATC GGTTTCTCTG AAGACGCAGC AGCATCCACG 840AGCTTATCCG ATTTCGTCGT CGTGGGGATT GAAGAAGAGT GGGATGACGT TAATTGGCTC 900TGAGCTTCGT CCTCTTAAGG TCATGTCTTC TGTTTCCACG GCGTGCATGC TTCACGGTGC 960AAGCAGCCGT CCAGCAACTG CTCGTAAGTC CTCTGGTCTT TCTGGAACCG TCCGTATTCC 1020AGGTGACAAG TCTATCTCCC ACAGGTCCTT CATGTTTGGA GGTCTCGCTA GCGGTGAAAC 1080TCGTATCACC GGTCTTTTGG AAGGTGAAGA TGTTATCAAC ACTGGTAAGG CTATGCAAGC 1140TATGGGTGCC AGAATCCGTA AGGAAGGTGA TACTTGGATC ATTGATGGTG TTGGTAACGG 1200TGGACTCCTT GCTCCTGAGG CTCCTCTCGA TTTCGGTAAC GCTGCAACTG GTTGCCGTTT 1260GACTATGGGT CTTGTTGGTG TTTACGATTT CGATAGCACT TTCATTGGTG ACGCTTCTCT 1320CACTAAGCGT CCAATGGGTC GTGTGTTGAA CCCACTTCGC GAAATGGGTG TGCAGGTGAA 1380GTCTGAAGAC GGTGATCGTC TTCCAGTTAC CTTGCGTGGA CCAAAGACTC CAACGCCAAT 1440CACCTACAGG GTACCTATGG CTTCCGCTCA AGTGAAGTCC GCTGTTCTGC TTGCTGGTCT 1500CAACACCCCA GGTATCACCA CTGTTATCGA GCCAATCATG ACTCGTGACC ACACTGAAAA 1560GATGCTTCAA GGTTTTGGTG CTAACCTTAC CGTTGAGACT GATGCTGACG GTGTGCGTAC 1620CATCCGTCTT GAAGGTCGTG GTAAGCTCAC CGGTCAAGTG ATTGATGTTC CAGGTGATCC 1680ATCCTCTACT GCTTTCCCAT TGGTTGCTGC CTTGCTTGTT CCAGGTTCCG ACGTCACCAT 1740CCTTAACGTT TTGATGAACC CAACCCGTAC TGGTCTCATC TTGACTCTGC AGGAAATGGG 1800TGCCGACATC GAAGTGATCA ACCCACGTCT TGCTGGTGGA GAAGACGTGG CTGACTTGCG 1860TGTTCGTTCT TCTACTTTGA AGGGTGTTAC TGTTCCAGAA GACCGTGCTC CTTCTATGAT 1920CGACGAGTAT CCAATTCTCG CTGTTGCAGC TGCATTCGCT GAAGGTGCTA CCGTTATGAA 1980CGGTTTGGAA GAACTCCGTG TTAAGGAAAG CGACCGTCTT TCTGCTGTCG CAAACGGTCT 2040CAAGCTCAAC GGTGTTGATT GCGATGAAGG TGAGACTTCT CTCGTCGTGC GTGGTCGTCC 2100TGACGGTAAG GGTCTCGGTA ACGCTTCTGG AGCAGCTGTC GCTACCCACC TCGATCACCG 2160TATCGCTATG AGCTTCCTCG TTATGGGTCT CGTTTCTGAA AACCCTGTTA CTGTTGATGA 2220TGCTACTATG ATCGCTACTA GCTTCCCAGA GTTCATGGAT TTGATGGCTG GTCTTGGAGC 2280TAAGATCGAA CTCTCCGACA CTAAGGCTGC TTGATGAGCT CAAGAATTCG AGCTCGGTAC 2340CGGATCCTCT AGCTAGAGCT TTCGTTCGTA TCATCGGTTT CGACAACGTT CGTCAAGTTC 2400AATGCATCAG TTTCATTGCG CACACACCAG AATCCTACTG AGTTCGAGTA TTATGGCATT 2460GGGAAAACTG TTTTTCTTGT ACCATTTGTT GTGCTTGTAA TTTACTGTGT TTTTTATTCG 2520GTTTTCGCTA TCGAACTGTG AAATGGAAAT GGATGGAGAA GAGTTAATGA ATGATATGGT 2580CCTTTTGTTC ATTCTCAAAT TAATATTATT TGTTTTTTCT CTTATTTGTT GTGTGTTGAA 2640TTTGAAATTA TAAGAGATAT GCAAACATTT TGTTTTGAGT AAAAATGTGT CAAATCGTGG 2700CCTCTAATGA CCGAAGTTAA TATGAGGAGT AAAACACTTG TAGTTGTACC ATTATGCTTA 2760TTCACTAGGC AACAAATATA TTTTCAGACC TAGAAAAGCT GCAAATGTTA CTGAATACAA 2820GTATGTCCTC TTGTGTTTTA GACATTTATG AACTTTCCTT TATGTAATTT TCCAGAATCC 2880TTGTCAGATT CTAATCATTG CTTTATAATT ATAGTTATAC TCATGGATTT GTAGTTGAGT 2940ATGAAAATAT TTTTTAATGC ATTTTATGAC TTGCCAATTG ATTGACAACA TGCATCAATC 3000GACCTGCAGC CACTCGAAGC GGCCGCGTTC AAGCTTCTGC AGGTCCGATG TGAGACTTTT 3060CAACAAAGGG TAATATCCGG AAACCTCCTC GGATTCCATT GCCCAGCTAT CTGTCACTTT 3120ATTGTGAAGA TAGTGGAAAA GGAAGGTGGC TCCTACAAAT GCCATCATTG CGATAAAGGA 3180AAGGCCATCG TTGAAGATGC CTCTGCCGAC AGTGGTCCCA AAGATGGACC CCCACCCACG 3240AGGAGCATCG TGGAAAAAGA AGACGTTCCA ACCACGTCTT CAAAGCAAGT GGATTGATGT 3300GATGGTCCGA TGTGAGACTT TTCAACAAAG GGTAATATCC GGAAACCTCC TCGGATTCCA 3360TTGCCCAGCT ATCTGTCACT TTATTGTGAA GATAGTGGAA AAGGAAGGTG GCTCCTACAA 3420ATGCCATCAT TGCGATAAAG GAAAGGCCAT CGTTGAAGAT GCCTCTGCCG ACAGTGGTCC 3480CAAAGATGGA CCCCCACCCA CGAGGAGCAT CGTGGAAAAA GAAGACGTTC CAACCACGTC 3540TTCAAAGCAA GTGGATTGAT GTGATATCTC CACTGACGTA AGGGATGACG CACAATCCCA 3600CTATCCTTCG CAAGACCCTT CCTCTATATA AGGAAGTTCA TTTCATTTGG AGAGGACACG 3660CTGACAAGCT GACTCTAGCA GATCTCCATG GTCCGTCCTG TAGAAACCCC AACCCGTGAA 3720ATCAAAAAAC TCGACGGCCT GTGGGCATTC AGTCTGGATC GCGAAAACTG TGGAATTGAT 3780CAGCGTTGGT GGGAAAGCGC GTTACAAGAA AGCCGGGCAA TTGCTGTGCC AGGCAGTTTT 3840AACGATCAGT TCGCCGATGC AGATATTCGT AATTATGCGG GCAACGTCTG GTATCAGCGC 3900GAAGTCTTTA TACCGAAAGG TTGGGCAGGC CAGCGTATCG TGCTGCGTTT CGATGCGGTC 3960ACTCATTACG GCAAAGTGTG GGTCAATAAT CAGGAAGTGA TGGAGCATCA GGGCGGCTAT 4020ACGCCATTTG AAGCCGATGT CACGCCGTAT GTTATTGCCG GGAAAAGTGT ACGTATCACC 4080GTTTGTGTGA ACAACGAACT GAACTGGCAG ACTATCCCGC CGGGAATGGT GATTACCGAC 4140GAAAACGGCA AGAAAAAGCA GTCTTACTTC CATGATTTCT TTAACTATGC CGGAATCCAT 4200CGCAGCGTAA TGCTCTACAC CACGCCGAAC ACCTGGGTGG ACGATATCAC CGTGGTGACG 4260CATGTCGCGC AAGACTGTAA CCACGCGTCT GTTGACTGGC AGGTGGTGGC CAATGGTGAT 4320GTCAGCGTTG AACTGCGTGA TGCGGATCAA CAGGTGGTTG CAACTGGACA AGGCACTAGC 4380GGGACTTTGC AAGTGGTGAA TCCGCACCTC TGGCAACCGG GTGAAGGTTA TCTCTATGAA 4440CTGTGCGTCA CAGCCAAAAG CCAGACAGAG TGTGATATCT ACCCGCTTCG CGTCGGCATC 4500CGGTCAGTGG CAGTGAAGGG CGAACAGTTC CTGATTAACC ACAAACCGTT CTACTTTACT 4560GGCTTTGGTC GTCATGAAGA TGCGGACTTA CGTGGCAAAG GATTCGATAA CGTGCTGATG 4620GTGCACGACC ACGCATTAAT GGACTGGATT GGGGCCAACT CCTACCGTAC CTCGCATTAC 4680CCTTACGCTG AAGAGATGCT CGACTGGGCA GATGAACATG GCATCGTGGT GATTGATGAA 4740ACTGCTGCTG TCGGCTTTAA CCTCTCTTTA GGCATTGGTT TCGAAGCGGG CAACAAGCCG 4800AAAGAACTGT ACAGCGAAGA GGCAGTCAAC GGGGAAACTC AGCAAGCGCA CTTACAGGCG 4860ATTAAAGAGC TGATAGCGCG TGACAAAAAC CACCCAAGCG TGGTGATGTG GAGTATTGCC 4920AACGAACCGG ATACCCGTCC TGCACGGGAA TATTTCGGCA TTTCGCCACT GGCGGAAGCA 4980ACGCGTAAAC TCGACCCGAC GCGTCCGATC ACCTGCGTCA ATGTAATGTT CTGCGACGCT 5040CACACCGATA CCATCAGCGA TCTCTTTGAT GTGCTGTGCC TGAACCGTTA TTACGGATGG 5100TATGTCCAAA GCGGCGATTT GGAAACGGCA GAGAAGGTAC TGGAAAAAGA ACTTCTGGCC 5160TGGCAGGAGA AACTGCATCA GCCGATTATC ATCACCGAAT ACGGCGTGGA TACGTTAGCC 5220GGGCTGCACT CAATGTACAC CGACATGTGG AGTGAAGAGT ATCAGTGTGC ATGGCTGGAT 5280ATGTATCACC GCGTCTTTGA TCGCGTCAGC GCCGTCGTCG GTGAACAGGT ATGGAATTTC 5340GCCGATTTTG CGACCTCGCA AGGCATATTG CGCGTTGGCG GTAACAAGAA AGGGATCTTC 5400ACTCGCGACC GCAAACCGAA GTCGGCGGCT TTTCTGCTGC AAAAACGCTG GACTGGCATG 5460AACTTCGGTG AAAAACCGCA GCAGGGAGGC AAACAATGAA TCAACAACTC TCCTGGCGCA 5520CCATCGTCGG CTACAGCCTC GGTGGGGAAT TCGAGCTCGC CCGGGGATCC TCTAGCTAGA 5580GCTTTCGTTC GTATCATCGG TTTCGACAAC GTTCGTCAAG TTCAATGCAT CAGTTTCATT 5640GCGCACACAC CAGAATCCTA CTGAGTTCGA GTATTATGGC ATTGGGAAAA CTGTTTTTCT 5700TGTACCATTT GTTGTGCTTG TAATTTACTG TGTTTTTTAT TCGGTTTTCG CTATCGAACT 5760GTGAAATGGA AATGGATGGA GAAGAGTTAA TGAATGATAT GGTCCTTTTG TTCATTCTCA 5820AATTAATATT ATTTGTTTTT TCTCTTATTT GTTGTGTGTT GAATTTGAAA TTATAAGAGA 5880TATGCAAACA TTTTGTTTTG AGTAAAAATG TGTCAAATCG TGGCCTCTAA TGACCGAAGT 5940TAATATGAGG AGTAAAACAC TTGTAGTTGT ACCATTATGC TTATTCACTA GGCAACAAAT 6000ATATTTTCAG ACCTAGAAAA GCTGCAAATG TTACTGAATA CAAGTATGTC CTCTTGTGTT 6060TTAGACATTT ATGAACTTTC CTTTATGTAA TTTTCCAGAA TCCTTGTCAG ATTCTAATCA 6120TTGCTTTATA ATTATAGTTA TACTCATGGA TTTGTAGTTG AGTATGAAAA TATTTTTTAA 6180TGCATTTTAT GACTTGCCAA TTGATTGACA ACATGCATCA ATCGACCTGC AGCCCAAGCT 6240TGAGCTCAGG ATTTAGCAGC ATTCCAGATT GGGTTCAATC AACAAGGTAC GAGCCATATC 6300ACTTTATTCA AATTGGTATC GCCAAAACCA AGAAGGAACT CCCATCCTCA AAGGTTTGTA 6360AGGAAGAATT CTCAGTCCAA AGCCTCAACA AGGTCAGGGT ACAGAGTCTC CAAACCATTA 6420GCCAAAAGCT ACAGGAGATC AATGAAGAAT CTTCAATCAA AGTAAACTAC TGTTCCAGCA 6480CATGCATCAT GGTCAGTAAG TTTCAGAAAA AGACATCCAC CGAAGACTTA AAGTTAGTGG 6540GCATCTTTGA AAGTAATCTT GTCAACATCG AGCAGCTGGC TTGTGGGGAC CAGACAAAAA 6600AGGAATGGTG CACAATTGTT AGGCGCACCT ACCAAAAGCA TCTTTGCCTT TATTGCAAAG 6660ATAAAGCAGA TTCCTCTAGT ACAAGTGGGG AACAAAATAA CGTGGAAAAG AGCTGTCCTG 6720ACAGCCCACT CACTAATGCG TATGACGAAC GCAGTGACGA CCACAAAAGA ATTCCCTCTA 6780TATAAGAAGG CATTCATTCC CATTTGAAGG ATCATCAGAT ACTGAACCAA TCCTTCTAGA 6840AGATCTCCAC AATGGCTTCC TCTATGCTCT CTTCCGCTAC TATGGTTGCC TCTCCGGCTC 6900AGGCCACTAT GGTCGCTCCT TTCAACGGAC TTAAGTCCTC CGCTGCCTTC CCAGCCACCC 6960GCAAGGCTAA CAACGACATT ACTTCCATCA CAAGCAACGG CGGAAGAGTT AACTGCATGC 7020AGGTGTGGCC TCCGATTGGA AAGAAGAAGT TTGAGACTCT CTCTTACCTT CCTGACCTTA 7080CCGATTCCGG TGGTCGCGTC AACTGCATGC AGGCCATGGC TGAGAACCAC AAGAAGGTTG 7140GTATCGCTGG AGCTGGAATC GTTGGTGTTT GCACTGCTTT GATGCTTCAA CGTCGTGGAT 7200TCAAGGTTAC CTTGATTGAT CCAAACCCAC CAGGTGAAGG TGCTTCTTTC GGTAACGCTG 7260GTTGCTTCAA CGGTTCCTCC GTTGTTCCAA TGTCCATGCC AGGAAACTTG ACTAGCGTTC 7320CAAAGTGGCT TCTTGACCCA ATGGGTCCAT TGTCCATCCG TTTCAGCTAC TTTCCAACCA 7380TCATGCCTTG GTTGATTCGT TTCTTGCTTG CTGGAAGACC AAACAAGGTG AAGGAGCAAG 7440CTAAGGCACT CCGTAACCTC ATCAAGTCCA CTGTGCCTTT GATCAAGTCC TTGGCTGAGG 7500AGGCTGATGC TAGCCACCTT ATCCGTCACG AAGGTCACCT TACCGTGTAC CGTGGAGAAG 7560CAGACTTCGC CAAGGACCGT GGAGGTTGGG AACTTCGTCG TCTCAACGGT GTTCGTACTC 7620AAATCCTCAG CGCTGATGCA TTGCGTGATT TCGATCCTAA CTTGTCTCAC GCCTTTACCA 7680AGGGAATCCT TATCGAAGAG AACGGTCACA CCATCAACCC ACAAGGTCTC GTGACTCTCT 7740TGTTTCGTCG TTTCATCGCT AACGGTGGAG AGTTCGTGTC TGCTCGTGTT ATCGGATTCG 7800AGACTGAAGG TCGTGCTCTC AAGGGTATCA CCACCACCAA CGGTGTTCTT GCTGTTGATG 7860CAGCTGTTGT TGCAGCTGGT GCACACTCCA AGTCTCTTGC TAACTCCCTT GGTGATGACA 7920TCCCATTGGA TACCGAACGT GGATACCACA TCGTGATCGC CAACCCAGAA GCTGCTCCAC 7980GTATTCCAAC TACCGATGCT TCTGGAAAGT TC8012(2)關於SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度89個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO2GGATTGTGTT TGGGTTTTGT CTGTGTGTTT AATGTGTTTA AGGGATGAAT TAGAATGCTC 60TTAATCAACC TACAGCTGAT TTGGACCGG89(2)關於SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度697個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO3CGGTCCAAAT TTGTTTACAT TGTGTCCAAA TTTCGGCTGA TTTGGACTTC CCTAGCTATG 60CCAACTAAGC TAATAAAAAA CATGAAACAA CAATTACAAA CTGTCGAGCA CACCTTCTAC 120AAACTAGCTT AGATTTCTAT TGGAAGTTAC AAAACAGTAA AACTACCAAT AGGATACTAA 180ATTAAACATA TTAAACTATT ACTCCTCAAA AGCTTGTACA ATTTGCAGAA GAAATGATGG 240TTGCCCAAAA GCTTCAAAGG GAACCTGCTG GGAAGCCTGC TGGGACGCTG GGGATGCTGG 300CAGCAGCATA CCTTGGCTTG AAGTACTCTT CTCTCATTGG TTTTGCTTCC CTTGCCCATG 360TGGTCTTCAT ATGGCCTCAT TACTTCCCAA GGGCTTCAAA TCAGTAGGTG GTGGCAACCA 420AAAGCATCAA AAACATCTCC TAAAACTAGC TTATACAACC GGATTACATG AGCTTATACT 480AGCTTAACTC TTAAAGCATG ATTAACATAA TGATGTTTAA GGTGTCATTA AGTATTACTA 540ATCTTGCTTA AGTAGAGATT AACATAGGAT TAGCCTAATC AAGTTGCTTA AGTAAGGTTT 600TAGAATAAAC CGAGCTAGTT AGGCTTAAGT AGAGATTAAC ATAGGATTAG CCTAATCAAG 660TTGCTTAAGT AAGGTTTTAG AATAAACCGA GCTAGTT 697(2)關於SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度8798個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線形
(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO4GGATTGTGTT TGGGTTTTGT CTGTGTGTTT AATGTGTTTA AGGGATGAAT TAGAATGCTC60TTAATCAACC TACAGCTGAT TTGGACCGGA ACGACAATCT GATCCCCATC AAGCTTGAGC 120TCAGGATTTA GCAGCATTCC AGATTGGGTT CAATCAACAA GGTACGAGCC ATATCACTTT 180ATTCAAATTG GTATCGCCAA AACCAAGAAG GAACTCCCAT CCTCAAAGGT TTGTAAGGAA 240GAATTCTCAG TCCAAAGCCT CAACAAGGTC AGGGTACAGA GTCTCCAAAC CATTAGCCAA 300AAGCTACAGG AGATCAATGA AGAATCTTCA ATCAAAGTAA ACTACTGTTC CAGCACATGC 360ATCATGGTCA GTAAGTTTCA GAAAAAGACA TCCACCGAAG ACTTAAAGTT AGTGGGCATC 420TTTGAAAGTA ATCTTGTCAA CATCGAGCAG CTGGCTTGTG GGGACCAGAC AAAAAAGGAA 480AGGTGCAGAA TTGTTAGGCG CACCTACCAA AAGCATCTTT GCCTTTATTG CAAAGATAAA 540GCAGATTCCT CTAGTACAAG TGGGGAACAA AATAACGTGG AAAAGAGCTG TCCTGACAGC 600CCACTCACTA ATGCGTATGA CGAACGCAGT GACGACCACA AAAGAATTCC CTCTATATAA 660GAAGGCATTC ATTCCCATTT GAAGGATCAT CAGATACTGA ACCAATCCTT CTAGAAGATC 720TAAGCTTATC GATAAGCTTG ATGTAATTGG AGGAAGATCA AAATTTTCAA TCCCCATTCT 780TCGATTGCTT CAATTGAAGT TTCTCCGATG GCGCAAGTTA GCAGAATCTG CAATGGTGTG 840CAGAACCCAT CTCTTATCTC CAATCTCTCG AAATCCAGTC AACGCAAATC TCCCTTATCG 900GTTTCTCTGA AGACGCAGCA GCATCCACGA GCTTATCCGA TTTCGTCGTC GTGGGGATTG 960AAGAAGAGTG GGATGACGTT AATTGGCTCT GAGCTTCGTC CTCTTAAGGT CATGTCTTCT 1020GTTTCCACGG CGTGCATGCT TCACGGTGCA AGCAGCCGTC CAGCAACTGC TCGTAAGTCC 1080TCTGGTCTTT CTGGAACCGT CCGTATTCCA GGTGACAAGT CTATCTCCCA CAGGTCCTTC 1140ATGTTTGGAG GTCTCGCTAG CGGTGAAACT CGTATCACCG GTCTTTTGGA AGGTGAAGAT 1200GTTATCAACA CTGGTAAGGC TATGCAAGCT ATGGGTGCCA GAATCCGTAA GGAAGGTGAT 1260ACTTGGATCA TTGATGGTGT TGGTAACGGT GGACTCCTTG CTCCTGAGGC TCCTCTCGAT 1320TTCGGTAACG CTGCAACTGG TTGCCGTTTG ACTATGGGTC TTGTTGGTGT TTACGATTTC 1380GATAGCACTT TCATTGGTGA CGCTTCTCTC ACTAAGCGTC CAATGGGTCG TGTGTTGAAC 1440CCACTTCGCG AAATGGGTGT GCAGGTGAAG TCTGAAGACG GTGATCGTCT TCCAGTTACC 1500TTGCGTGGAC CAAAGACTCC AACGCCAATC ACCTACAGGG TACCTATGGC TTCCGCTCAA 1560GTGAAGTCCG CTGTTCTGCT TGCTGGTCTC AACACCCCAG GTATCACCAC TGTTATCGAG 1620CCAATCATGA CTCGTGACCA CACTGAAAAG ATGCTTCAAG GTTTTGGTGC TAACCTTACC 1680GTTGAGACTG ATGCTGACGG TGTGCGTACC ATCCGTCTTG AAGGTCGTGG TAAGCTCACC 1740GGTCAAGTGA TTGATGTTCC AGGTGATCCA TCCTCTACTG CTTTCCCATT GGTTGCTGCC 1800TTGCTTGTTC CAGGTTCCGA CGTCACCATC CTTAACGTTT TGATGAACCC AACCCGTACT 1860GGTCTCATCT TGACTCTGCA GGAAATGGGT GCCGACATCG AAGTGATCAA CCCACGTCTT 1920GCTGGTGGAG AAGACGTGGC TGACTTGCGT GTTCGTTCTT CTACTTTGAA GGGTGTTACT 1980GTTCCAGAAG ACCGTGCTCC TTCTATGATC GACGAGTATC CAATTCTCGC TGTTGCAGCT 2040GCATTCGCTG AAGGTGCTAC CGTTATGAAC GGTTTGGAAG AACTCCGTGT TAAGGAAAGC 2100GACCGTCTTT CTGCTGTCGC AAACGGTCTC AAGCTCAACG GTGTTGATTG CGATGAAGGT 2160GAGACTTCTC TCGTCGTGCG TGGTCGTCCT GACGGTAAGG GTCTCGGTAA CGCTTCTGGA 2220GCAGCTGTCG CTACCCACCT CGATCACCGT ATCGCTATGA GCTTCCTCGT TATGGGTCTC 2280GTTTCTGAAA ACCCTGTTAC TGTTGATGAT GCTACTATGA TCGCTACTAG CTTCCCAGAG 2340TTCATGGATT TGATGGCTGG TCTTGGAGCT AAGATCGAAC TCTCCGACAC TAAGGCTGCT 2400TGATGAGCTC AAGAATTCGA GCTCGGTACC GGATCCTCTA GCTAGAGCTT TCGTTCGTAT 2460CATCGGTTTC GACAACGTTC GTCAAGTTCA ATGCATCAGT TTCATTGCGC ACACACCAGA 2520ATCCTACTGA 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TCCAGCTCTC GCTCCTGCCA GTTCTGAAGA ACGTTACTCC AAGTGGATGG 8160GTTTCCGTCC AAGCATCCCA GATTCCCTTC CAGTGATTGG TCGTGCTACC CGTACTCCAG 8220ACGTTATCTA CGCTTTCGGT CACGGTCACC TCGGTATGAC TGGTGCTCCA ATGACCGCAA 8280CCCTCGTTTC TGAGCTCCTC GCAGGTGAGA AGACCTCTAT CGACATCTCT CCATTCGCAC 8340CAAACCGTTT CGGTATTGGT AAGTCCAAGC AAACTGGTCC TGCATCCTAA GTGGGAATTC 8400GAGCTCGGTA CCGGATCC8418(2)關於SEQ ID NO6的信息(i)序列特徵
(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO6CACCGGTCTT TTGGAAGGTG AAG 23(2)關於SEQ ID NO7的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO7AACGAGACCC ATAACGAGGA AGC 23(2)關於SEQ ID NO8的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO8AAACAGTCCC GTGCATCCCC AAC 23(2)關於SEQ ID NO9的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO9GACGCTCTCC TTGATTCTGT CCC 23(2)關於SEQ ID NO10的信息(i)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無
(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO10CAAGAAGGTT GGTATCGCTG 20(2)關於SEQ ID NO11的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO11TCTTTTGTGG TCGTCACTGC GTT 23(2)關於SEQ ID NO12的信息(i)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO12GCGAGCTCTA ATACGACTCA CTAT 24(2)關於SEQ ID NO13的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO13CGCGAGCTCA ATTAACCCTC ACT 23(2)關於SEQ ID NO14的信息(i)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO14TCTGTACCCT GACCTTGTTG 20(2)關於SEQ ID NO15的信息(i)序列特徵(A)長度20個鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO15CGTGGATACC ACATCGTGAT 20(2)關於SEQ ID NO16的信息(i)序列特徵(A)長度19個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO16ACCTTGGCTT GAAGTACTC 19(2)關於SEQ ID NO17的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形
(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO17TCAACCTACA GCTGATTTGG ACC 23(2)關於SEQ ID NO18的信息(i)序列特徵(A)長度22個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO18GGACCGGAAC GACAATCTGA TC 22(2)關於SEQ ID NO19的信息(i)序列特徵(A)長度22個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無
(xi)序列描述SEQ ID NO19CTAGGGAAGT CCAAATCAGC CG 22(2)關於SEQ ID NO20的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO20TTTGGACCGG AACTTTCAG AAG 23(2)關於SEQ ID NO21的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO21CTAACTTGCG CCATCGGAGA AAC 23(2)關於SEQ ID NO22的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO22GACTTGTCAC CTGGAATACG GAC 23(2)關於SEQ ID NO23的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO23ATTCTTGAGC TCATCAAGCC 23(2)關於SEQ ID NO24的信息(i)序列特徵(A)長度22個鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型 DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO24AAGGTTGGTA TCGCTGGAGC TG 22(2)關於SEQ ID NO25的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO25TCTCCACAAT GGCTTCCTCT ATG 23(2)關於SEQ ID NO26的信息(i)序列特徵(A)長度671個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線形
(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO26CAAGATGGAT TGCACGCAGG TTCTCCGGCC GCTTGGGTGG AGAGGCTATT CGGCTATGAC 60TGGGCACAAC AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCCGTGT TCCGGCTGTC AGCGCAGGGG 120CGCCCGGTTC TTTTTGTCAA GACCGACCTG TCCGGTGCCC TGAATGAACT CCAGGACGAG 180GCAGCGCGGC TATCGTGGCT GGCCACGACG GGCGTTCCTT GCGCAGCTGT GCTCGACGTT 240GTCACTGAAG CGGGAAGGGA CTGGCTGCTA TTGGGCGAAG TGCCGGGGCA GGATCTCCTG 300TCATCTCACC TTGCTCCTGC CGAGAAAGTA TCCATCATGG CTGATGCAAT GCGGCGGCTG 360CATACGCTTG ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCACCAAG CGAAACATCG CATCGAGCGA 420GCACGTACTC GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG ATCTGGACGA AGAGCATCAG 480GGGCTCGCGC CAGCCGAACT GTTCGCCAGG CTCAAGGCGC GCATGCCCGA CGGCGAGGAT 540CTCGTCGTGA CCCATGGCGA TGCCTGCTTG CCGAATATCA TGGTGGAAAA TGGCCGCTTT 600TCTGGATTCA TCGACTGTGG CCGGCTGGGT GTGGCGGACC GCTATCAGGA CATAGCGTTG 660GCTACCCGTG A 671(2)關於SEQ ID NO27的信息(i)序列特徵(A)長度739個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型 DNA(基因組)(iii)假設無(iii)反義無(xi)序列描述 SEQ ID NO27GGACCGGAAC GACAATCTGA TCCCCATCAA GCTTGAGCTC AGGATTTAGC AGCATTCCAG 60ATTGGGTTCA ATCAACAAGG TACGAGCCAT ATCACTTTAT TCAAATTGGT ATCGCCAAAA 120CCAAGAAGGA ACTCCCATCC TCAAAGGTTT GTAAGGAAGA ATTCTCAGTC CAAAGCCTCA 180ACAAGGTCAG GGTACAGAGT CTCCAAACCA TTAGCCAAAA GCTACAGGAG ATCAATGAAG 240AATCTTCAAT CAAAGTAAAC TACTGTTCCA GCACATGCAT CATGGTCAGT AAGTTTCAGA 300AAAAGACATC CACCGAAGAC TTAAAGTTAG TGGGCATCTT TGAAAGTAAT CTTGTCAACA 360TCGAGCAGCT GGCTTGTGGG GACCAGACAA AAAAGGAATG GTGCAGAATT GTTAGGCGCA 420CCTACCAAAA GCATCTTTGC CTTTATTGCA AAGATAAAGC AGATTCCTCT AGTACAAGTG 480GGGAACAAAA TAACGTGGAA AAGAGCTGTC CTGACAGCCC ACTCACTAAT GCGTATGACG 540AACGCAGTGA CGACCACAAA AGAATTCCCT CTATATAAGA AGGCATTCAT TCCCATTTGA 600AGGATCATCA GATACTGAAC CAATCCTTCT AGAAGATCTA AGCTTATCGA TAAGCTTGAT 660GTAATTGGAG GAAGATCAAA ATTTTCAATC CCCATTCTTC GATTGCTTCA ATTGAAGTTT 720CTCCGATGGC GCAAGTTAG 739
權利要求
1.表達cp4/epsps酶活性的甜菜植株及其後代。
2.根據權利要求1所述的植株，對每公頃約4升至約18升Roundup的處理有耐受性。
3.根據權利要求1所述的植株，其特徵在於當使用以SEQ IDNo18和SEQ ID No2的序列為特徵的寡核苷酸引物對時，以其基因組DNA為模板的PGR擴增產生739bp的DNA片段。
4.根據權利要求3所述的植株，其中以SEQ ID No27的核苷酸序列為特徵的DNA形成植物基因組的部分。
5.根據權利要求1所述的植株，其特徵在於當使用以SEQ IDNo20和SEQ ID No24的序列為特徵的寡核苷酸引物對時，以其基因組DNA為模板的PCR擴增產生834bp的DNA片段。
6.根據權利要求1所述的植株，其特徵在於當使用以SEQ IDNo17和SEQ ID No22的序列為特徵的寡核苷酸引物對時，以其基因組DNA為模板的PCR擴增產生1057bp的DNA片段。
7.根據權利要求1所述的植株，其特徵在於當使用以SEQ IDNo19和SEQ ID No25的序列為特徵的寡核苷酸引物對時，以其基因組DNA為模板的PCR擴增產生1224bp的DNA片段。
8.根據權利要求1所述的植株，其中以SEQ ID No1的核苷酸序列為特徵的DNA形成植物基因組的部分。
9.根據權利要求8所述的植株，其中所述的核苷酸序列取代了高度重複的DNA序列。
10.根據權利要求8所述的植株，其中基因組的部分與以SEQ IDNo2和SEQ ID No3的核苷酸序列為特徵的所述的核苷酸序列直接相連。
11.根據權利要求9所述的植株，其中DNA的特徵在於SEQ IDNo4的核苷酸序列形成植物基因組的部分。
12.根據權利要求1-11中的任意一項所述的植株的種子。
13.根據權利要求8所述的植株的種子，以登記號NCIMB97087006/2保藏。
14.產生根據權利要求1所述的甜菜植株的方法，包括(a)用攜帶含有編碼cp4/epsps的DNA片段的載體的農桿菌轉化體外培養的甜菜子葉；(b)在草甘膦存在時再生芽；(c)將芽轉移到溫室的土壤中；(d)用草甘膦處理苗；(e)以0-9的等級對植株活力和葉褪綠進行目測評級；(g)選擇植株活力和葉褪綠評級為9的植株；並且(h)通過傳統育種技術繁殖所選植株。
15.根據權利要求14所述的方法，其中編碼cp4/epsps蛋白的載體是含有具有SEQ ID No5中給出的核苷酸序列的DNA片段的載體。
16.根據權利要求14所述的方法，其中通過PCR分析再生芽中編碼cp4/epsps的DNA的存在。
17.草甘膦耐受性甜菜植株及其後代，可通過用使cp4/epsps在植物中表達的基因進行農桿菌介導的轉化得到，其中所述的植株缺失左和右T-DNA邊界序列。
全文摘要
本發明涉及轉基因甜菜植株,該植株由於cp4/epsps酶活性的表達而對每公頃約4至約18升Roundup的處理有耐受性。植物可以其特異整合位點為特徵。本發明進一步涉及可從所述植株得到的種子和產生所述植株的方法。
文檔編號A01H1/04GK1242803SQ98801636
公開日2000年1月26日 申請日期1998年10月29日 優先權日1997年10月31日
發明者M·曼納洛弗, P·P·坦寧, P·斯狄恩 申請人:諾瓦提斯公司