一種治療腦損傷的合成肽的製作方法

2023-12-03 18:36:41

本發明屬於生物醫藥技術領域，具體涉及合成肽及其在製備治療腦損傷藥物中的用途。

背景技術：

甘氨酸是化學結構最簡單的胺基酸，但具有複雜的功能。甘氨酸在中樞神經系統中是一種重要的抑制性神經遞質，在控制神經元興奮性方面發揮重要作用。動物實驗發現甘氨酸具有明顯的神經保護作用，並且在一些臨床試驗中也發現甘氨酸可明顯改善認知功能障礙和痴呆，尤其是可以作為一個常規的精神安定劑治療精神分裂症。除此之外，甘氨酸還可以治療心臟損傷和腦卒中。

L-半胱氨酸是一種神經調節物質，也是一種具有神經保護作用的抗氧化劑。同時，它也是腦內穀胱甘肽的重要合成單位，合成的穀胱甘肽對於腦缺血再灌注損傷和帕金森病都有明顯的治療作用。

L-苯丙氨酸是人體必需胺基酸之一，屬芳香族胺基酸。已有研究表明，L-苯丙氨酸可作為抗癌藥物的載體將藥物分子直接導入癌瘤區，其效果是其他胺基酸的3～5倍。

儘管甘氨酸和半胱氨酸都有明顯的腦保護作用，但是外周給甘氨酸(800mg/kg)和半胱氨酸(500mg/kg)劑量過大，導致副反應嚴重，限制了它們的臨床應用。

技術實現要素：

本發明針對現有技術存在的問題，提供了一類新的合成肽，它是由甘氨酸，半胱氨酸，丙氨酸和苯丙氨酸四種天然胺基酸為原料脫水縮合而成，在生物學上是有活性的，在診斷學上是有用的並具有治療腦損傷的作用。這些肽類特別穩定並易透過血腦屏障，因此通過靜脈途徑給藥仍是有效的。

本發明的第一方面，提供了一種合成肽，其結構特徵，自N端至C端如下式I：

X1-X2-L-Ala-(L-Cys-Gly)n-X3(I)，式中，

X1是無或L-Phe

X2是無或L-Cys

X3是無或L-Phe

X1、X3不能同時為無，n≤8，n為L-Cys-Gly的排列在序列中的重複次數，該類合成肽中存在三種蛋白水解酶切割位點，一個是L-Cys與Gly的連接點,一個是L-Cys與L-Ala的連接點，一個是肽兩端L-Phe與式I中其它任意胺基酸的連接點，蛋白水解酶切割後產生游離Gly和L-Cys作為藥物或藥理活性基團，L-Ala是疏水性胺基酸，促進合成肽穿透細胞膜，L-Phe作為穿透細胞膜的載體，可攜帶合成肽分子穿過血腦屏障，進入大腦。

本發明中胺基酸縮寫簡稱如下：

甘氨酸：Gly，G；L-半胱氨酸：L-Cys，C；L-苯丙氨酸：L-Phe，F；L-丙氨酸：L-Ala，A。

本發明中提到的Cys、Phe、Ala都是L型的。

在另一優選例中，合成肽可以選自以下任意一種：

(a)NH2-L-Phe-L-Ala-L-Cys-Gly-COOH；

(b)NH2-L-Phe-L-Cys-L-Ala-L-Cys-Gly-COOH；

(c)NH2-L-Cys-L-Ala-L-Cys-Gly-L-Phe-COOH；

(d)NH2-L-Phe-L-Ala-(L-Cys-Gly)4-COOH；

(e)NH2-L-Phe-L-Ala-(L-Cys-Gly)8-COOH；

(f)NH2-L-Ala-(L-Cys-Gly)4-Phe-COOH；

(g)NH2-L-Phe-L-Cys-L-Ala-L-Cys-Gly-L-Phe-COOH；

本發明的另一方面是提供該類合成肽在製備治療神經系統疾病藥物中的應用。

優選地，提供該類合成肽在製備治療缺血性腦卒中，出血性腦卒中，腦創傷，阿爾茨海默病，帕金森病及其他神經退行性疾病藥物中的應用。

所述藥物為注射劑。

優選地，該類合成肽用於治療神經系統疾病時採用靜脈注射的方式給藥。

本發明在具體實施例中提供通過固相合成製備本發明各類合成肽的方法。具體以L-Phe-L-Ala-L-Cys-Gly的實施例進行描述。

為了確定本專利其它合成肽是否也有腦保護作用，我們建立了皮層神經元離體糖氧剝奪(OGD)模型，神經元在OGD損傷情況下，用500μM的各合成肽處理神經元，用cck8去評價細胞的活力，從而判斷各合成肽對神經元有無保護作用。由圖2可見，各合成肽均有保護作用，其中FACG,FCACG,CACGF,FCACGF合成肽對損傷神經元具有明顯保護作用。

本發明用SD大鼠作為實驗對象，採用腦中動脈阻斷法(MCAo)製備腦缺血大鼠模型，缺血3小時後靜脈注射藥物，1小時後取腦，腦組織冰凍切片，在螢光顯微鏡下觀察腦片中螢光物質強度。

採用靜脈注射FITC(異硫氰酸螢光素,紫外激發可發綠色螢光；8μmol/kg)標記大鼠腦神經細胞，結果可見未缺血大鼠腦組織中未見螢光標記的神經細胞；缺血大鼠腦組織中鏡下可見極少量FITC標記的綠色螢光神經細胞；腦缺血後注射FITC-CG，鏡下也只觀察到極少量螢光細胞；腦缺血後注射FITC-FCG和FITC-FACG(8μmol/kg),鏡下可見大量螢光標記的神經細胞，並且後者比前者鏡下觀察到的螢光細胞數量更多，螢光信號更強(見附圖3)，表明Phe作為穿透細胞膜的載體，可攜帶CG穿透血腦屏障，進入大腦，並且Ala作為疏水性胺基酸，在大鼠缺血情況下，通過靜脈注射方式，進一步增加FCG透過血腦屏障的能力，使FACG更高效的進入大腦。

為了說明FACG通過靜脈注射方式透過血腦屏障進入大腦後，被蛋白水解酶水解為Gly和L-Cys，，使腦內的Gly和L-Cys的水平上升，我們建立大鼠腦缺血模型，後隨即分為兩組，一組為對照組，缺血5h後靜脈注射生理鹽水；另一組為實驗組，靜脈注射12mg/kg FACG,24h後取腦，用HPLC測定大鼠腦缺血損傷區Gly和L-Cys的含量。結果表明大鼠腦缺血後，靜脈給FACG組，大鼠腦缺血區Gly和Cys的含量均高於缺血後給生理鹽水組，說明靜脈給缺血大鼠FACG後，FACG透過血腦屏障，進入大腦，水解生成Gly和L-Cys。(見附圖4)

本發明用SD大鼠作為實驗對象，靜脈注射給予FACG(12mg/kg)、依達拉奉(臨床腦卒中治療藥物；6mg/kg)，採用MCAo腦缺血大鼠模型，缺血後5h，靜脈一次性注射上述藥物。24h後，處死動物，取腦，後TTC染色，梗死體積用([(VC－VL)/V C]表示,VC是對照半球體積，,VL是損傷半球非梗死體積)。

結果可見,注射生理鹽水的腦缺血大鼠，梗死體積0.359±0.041；給予12mg/kg FACG，梗死體積0.021±0.008；注射6mg/kg依達拉奉，梗死體積為0.141±0.015；相對於靜脈給生理鹽水和依達拉奉組，給GCAF四肽藥組有更低的梗死體積，並且有統計學意義(p<0.05)(見表2，附圖5)。

總之，本發明有如下優點：

(1)本發明提供的合成肽可以通過靜脈注射，以L-Phe為穿透細胞膜的載體，L-Ala是疏水性胺基酸，促進合成肽穿透細胞膜，透過血腦屏障，進入大腦，在腦內蛋白水解酶的作用下水解生成游離的甘氨酸和半胱氨酸發揮神經保護作用，減少腦的缺血灌注損傷，起到治療腦卒中的目的。此外，甘氨酸除可用於腦卒中治療外，還可明顯改善認知功能障礙和痴呆，尤其是可以作為一個常規的精神安定劑治療精神分裂症。而L-半胱氨酸以及以它為基礎合成的穀胱甘肽作為一種強抗氧化劑，能明顯改善帕金森病患者的氧化應激損傷和腦缺血再灌注損傷。

(2)副作用小：本發明只需要12mg/kg的FACG靜脈注射劑量，即可達到顯著的治療效果。

(3)安全：該合成肽的胺基酸殘基取自20種組成人體蛋白質的胺基酸，安全無毒。

(4)經濟：該合成肽由固相合成而得，成本較低且便於質量管理。

附圖說明

圖1為本專利肽FACG和FCACGF的HPLC圖譜以及質譜圖；

圖2為合成肽對皮層神經元存活的影響圖；

圖3為FITC標記的合成肽在大鼠腦缺血情況下，透過血腦屏障，進入大腦的示意圖；

圖4為HPLC色譜圖

A為空白的DNFB，B為Gly和L-Cys標準品，C為大鼠腦缺血側損傷區Gly和L-Cys的含量；峰1表示Gly的流出峰，峰2表示L-Cys的流出峰。

圖5為缺血大鼠注射各藥物後對大鼠腦梗死體積改變的示意圖；

具體實施方式

通過以下詳細說明結合附圖可以進一步理解本發明的特點和優點。所提供的實施例僅是對本發明方法的說明，而不以任何方式限制本發明揭示的其餘內容。

【實施例1】本專利以L-苯丙氨酸-L-丙氨酸-L-半胱氨酸-甘氨酸四肽(FACG)為例說明固相合成肽的製備過程如下：

一、複合物I Fmoc-Gly-樹脂的合成：

本專利三肽用固相合成的方法，稱取取代度為0.4mmol/g的2-氯三苯甲基氯樹脂(2-Chlorotrityl Chloride Resin)10.7g，將樹脂放入多肽反應管中，加入二氯甲烷(DCM)160.5ml,震蕩30分鐘；通過沙芯抽濾掉DCM溶劑，加入12mmol的Fmoc-Gly-OH胺基酸，再加入40mmol的N,N-二異丙基乙胺(DIEA)，最後加入少量二甲基甲醯胺(DMF)溶解，振蕩1h。用DMF和DCM交替清洗6遍。加160.5ml20％哌啶(哌啶溶解在DMF溶液中)，5分鐘後抽掉哌啶，再次加入160.5ml20％哌啶，等15分鐘後抽掉哌啶溶液，從管中取反應後的樹脂十幾粒，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化鉀溶液，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加熱5min,變深藍色為陽性反應，說明Fmoc-Gly-OH與樹脂聯接成功，形成複合物I Fmoc-Gly-樹脂。

二、複合物II Fmoc-Cys(Trt)-Gly-樹脂的合成：

多肽反應管分別用160.5ml DMF洗兩次，160.5ml甲醇洗兩次，160.5ml DMF再洗兩次；後在Fmoc-Gly-樹脂複合物上聯接第二個胺基酸，在反應管中加入少量用DMF溶解的12mmolFmoc-Cys(Trt)-OH和12mmol苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)，後立即加入N-甲基嗎啉(NMM)40mmol,反應30min，反應管分別用160.5ml DMF洗一次，160.5ml甲醇洗兩次，160.5ml DMF再洗兩次。加160.5ml20％哌啶(哌啶溶解在DMF溶液中)，5分鐘後抽掉哌啶，再次加入160.5ml20％哌啶，等15分鐘後抽掉哌啶溶液，從管中取反應後的樹脂十幾粒，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化鉀溶液，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加熱5min,變深藍色為陽性反應，說明Fmoc-Cys(Trt)-OH與Fmoc-Gly-樹脂聯接成功，形成新的複合物II Fmoc-Cys(Trt)-Gly-樹脂。

三、複合物III Fmoc-L-Ala-Cys(Trt)-Gly-樹脂的合成：

多肽反應管分別用160.5ml DMF洗兩次，160.5ml甲醇洗兩次，160.5ml DMF再洗兩次；後在Fmoc-Cys(Trt)-Gly-樹脂上聯接第三個胺基酸，在反應管中加入少量用DMF溶解的12mmolFmoc-L-Ala-OH和12mmolHBTU，後立即加入N-甲基嗎啉(NMM)40mmol,反應30min，反應管分別用160.5ml DMF洗一次，160.5ml甲醇洗兩次，160.5ml DMF再洗兩次。加160.5ml20％哌啶(哌啶溶解在DMF溶液中)，5分鐘後抽掉哌啶，再次加入160.5ml20％哌啶，等15分鐘後抽掉哌啶溶液，從管中取反應後的樹脂十幾粒，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化鉀溶液，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加熱5min,變深藍色為陽性反應，說明Fmoc-L-Ala-OH與複合物II聯接成功，形成新的複合物IIIFmoc-L-Ala-Cys(Trt)-Gly-樹脂。

四、複合物IV Fmoc-L-Phe-L-Ala-Cys(Trt)-Gly-樹脂的合成：

多肽反應管分別用160.5ml DMF洗兩次，160.5ml甲醇洗兩次，160.5ml DMF再洗兩次；後在Fmoc-L-Ala-Cys(Trt)-Gly-樹脂上聯接第四個胺基酸，在反應管中加入少量用DMF溶解的12mmolFmoc-L-Phe-OH和12mmolHBTU，後立即加入N-甲基嗎啉(NMM)40mmol,反應30min，反應管分別用160.5ml DMF洗一次，160.5ml甲醇洗兩次，160.5ml DMF再洗兩次。加160.5ml20％哌啶(哌啶溶解在DMF溶液中)，5分鐘後抽掉哌啶，再次加入160.5ml20％哌啶，等15分鐘後抽掉哌啶溶液，從管中取反應後的樹脂十幾粒，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化鉀溶液，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加熱5min,變深藍色為陽性反應，說明Fmoc-L-Phe-OH與複合物III Fmoc-L-Ala-Cys(Trt)-Gly-樹脂聯接成功，形成新的複合物IV Fmoc-L-Phe-L-Ala-Cys(Trt)-Gly-樹脂。

五、得到粗品肽：

多肽反應管分別用160.5ml DMF洗兩次，160.5ml甲醇洗兩次，160.5ml DMF再洗兩次,抽乾10min,配製切割液107ml,配方分別是TFA(三氟乙酸)94.5％；水2.5％；EDT(1,2-乙二硫醇)2.5％；TIS(三異丙基矽烷)1％,將樹脂裝入燒瓶或者離心管中，倒入切割液，恆溫震蕩2h,將切割液用氮氣儘量吹乾，乙醚層析，再用乙醚洗6次，然後常溫揮幹，得到1.2g粗品肽Phe-Ala-Cys-Gly。

五、純化粗品肽Phe-Ala-Cys-Gly

儀器：LC3000型高效液相色譜儀

柱子：Gemini-NX C18 10um 120A 4.6*250mm

流動相A:0.1％TFA in 100％Acetonitrile

流動相B:0.1％TFA in 100％Water

根據上述純化條件，將粗品肽(1.2g),進入到HPLC內(每次進樣100mg),進行分離純化，收集主峰餾分，放凍幹機上凍幹(48h),最後得到99％以上的純品600mg。

圖1A L-苯丙氨酸-L-丙氨酸-L-半胱氨酸-甘氨酸四肽(FACG)四肽的HPLC圖譜以及質譜圖，HPLC圖中可見該四肽純度為99.5％；質譜圖結果可見，[M+H]+397.00，因此該物質分子量為396，與L-苯丙氨酸-L-丙氨酸-L-半胱氨酸-甘氨酸四肽理論分子量相符。

圖1B L-苯丙氨酸-L-半胱氨酸-L-丙氨酸-L-半胱氨酸-甘氨酸-L-苯丙氨酸六肽(FCACGF)六肽的HPLC圖譜以及質譜圖，HPLC圖中可見該四肽純度為98.72％；質譜圖結果可見，[M+H]+647.10，因此該物質分子量為646.10，與L-苯丙氨酸-L-半胱氨酸-L-丙氨酸-L-半胱氨酸-甘氨酸-L-苯丙氨酸六肽理論分子量相符。

採用同樣的固相合成的方法，本實驗室合成了本專利實施例中其它合成肽。

【實施例2】本專利合成肽對原代皮層神經元的細胞毒性試驗

本實施例用培養10天的原代皮層神經元作為實驗對象，建立了皮層神經元離體糖氧剝奪(OGD)模型，神經元在OGD損傷情況下，用500μM的各合成肽處理神經元，用cck8去評價細胞的活力，從而判斷各合成肽對神經元有無保護作用。本實施例所用合成肽如下：

表1本實施例涉及的合成肽

一、主要實驗試劑和儀器

實驗中各合成肽均由本實驗室自主合成；Neurobasal,由Gibco公司提供；B27，Gibco公司提供；FBS,由invitrogen公司提供；glutamax,invitrogen公司提供；Glutamic acid,由sigma公司提供；多聚賴氨酸，由sigma公司提供。培養箱，來自於SANYO公司，培養條件是37℃,5％CO2；酶標儀,美國Bio-Tek公司；CCK8試劑盒，日本同仁化學；其餘部分試劑全為國藥集團化學試劑有限公司提供的分析純試劑。

二、主要溶液的配製

1、HBSS:Hank，S平衡液：NaCl 8.0g,KCl 0.4g,Glucose 1.0g,KH2PO40.06g,Na2HPO4 0.06g,加雙蒸水溶解，用NaHCO3調PH至7.3，定容到1000ml.

2、分離液：HBSS 500ml,Hepes 1.78g,Sucrose 2.5g,Glucose 10.0g,PH調至7.4，最後加入200ml雙蒸水，4度保存。

3、ECS溶液：NaCl 8.01g,CaCl2 0.222g,KCl 0.4g,MgCl2 0.095g,HEPES2.98g,Glucose 3.27g,加雙蒸水溶解，PH7.4，定容至1000ml,用0.22um的濾膜過濾除菌。

無糖ECS溶液：NaCl 8.01g,CaCl2 0.222g,KCl 0.4g,MgCl2 0.095g,HEPES2.98g,加雙蒸水溶解，PH7.4，定容至1000ml,用0.22um的濾膜過濾除菌。

4、Glutamic acid儲備液(11.8mM):稱0.1736g的穀氨酸用雙蒸水溶解，NaOH調PH至7.0，定量到100ml,分裝1060μl/tube,貯存在4度。

5、0.5％FBS培養基：B27取1ml,FBS 250ul,glutamax 500ul,glutamic acid106μl,用neurobasal定量到50ml,4度保存。

6、無FBS培養基：B27取1ml,glutamax 500μl,用neurobasal定量到50ml，4度保存。

7、0.15M硼酸鹽緩衝液：稱取28.6g的硼砂，用雙蒸水溶解，攪拌3-5min,用HCl調PH至8.4，定容到500ml。

8、多聚賴氨酸：把5mg的多聚賴氨酸固體溶解到500ml的硼酸鹽緩衝液中，過濾除菌，-20℃保存。

三、實驗動物

動物SPF級ICR雌性小鼠，體重25-30g。武漢大學動物實驗中心提供，動物合格證號為No.42000500006525，生產許可證號：SCXK(鄂)2014-0004。

四、實驗原理

cck8的原理：該試劑中含有WST-8(化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽)，它在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臢產物(Formazan)。顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。

五、實驗方法

神經元的原代培養：培養前一天晚上用多聚賴氨酸包被培養皿，過夜；第二天早上取出已包被的多聚賴氨酸，接種前用PBS洗2-3遍。取懷孕17-18d的ICR雌性小鼠，頸椎脫臼處死後，取胎鼠大腦，置於分離液中，打開顱腔後取出全腦置於另一盛有分離液的玻璃培養皿中，在解剖鏡下分離剝離腦膜，取大腦皮層置另一盛有分離液的玻璃小皿中；用眼科鑷夾碎皮層組織成1mm3大小，吸管吸取組織置一15ml的離心管中，靜置幾秒，讓組織沉澱下來，棄去分離液，加入1-2ml的0.5％FBS培養基，用吸管吹打20-30次，液體變渾濁停止，然後再靜置10-20秒，使大的組織塊下沉，取上清用濾網過濾，過濾後的液體先數細胞，以4*105/ml的細胞密度把細胞接種到已包被的皿中。第二天從各皿中棄一半體積的培養基，換成無FBS的培養基，之後，每三天換一次全培養基，換的都是無FBS的培養基。

細胞處理過程：取培養10天的96孔板的原代神經元，簡單分為三組，分別是Control,OGD,OGD+各合成肽組，合成肽濃度都為500μM,每組重複5個復孔，每個孔先用PBS洗2-3遍，control組加入ECS,放入含5％CO2的培養箱內37°C繼續培養1h,OGD組加入無糖ECS,放入95％N2/5％CO2的培養箱內37℃培養1h，後control組換新的ECS繼續培養12h,而OGD組換新的ECS後轉入含5％CO2的培養箱內37℃繼續培養12h，其他OGD+合成肽組加入各合成肽藥物(肽溶解在ECS中)也轉入含5％CO2的培養箱內37℃繼續培養12h，每孔加入CCK8 10μl,2h後在450nm處測吸光值。

六、實驗結果

結果見圖2，神經元在OGD損傷情況下，用500μM的各合成肽處理神經元，發現各合成肽均有保護作用，其中FACG,FCACG,CACGF,FCACGF合成肽對損傷神經元具有明顯保護作用。

【實施例3】建立大鼠腦缺血模型，靜脈注射螢光標記的合成肽,從整體上觀察合成肽透過血腦屏障的能力

一、實驗主要試劑及儀器

FITC,武漢明皓生物科技股份有限公司；FITC-CG,FITC-FCG,FITC-FACG,武漢明皓生物科技股份有限公司；OCT膠，北京中杉金橋生物技術有限公司；病理組織切片機，德國Leitz,1512型；螢光顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；多聚甲醛，國藥集團化學試劑有限公司。

二、實驗原理

FITC(異硫氰酸螢光素):為黃色或橙黃色結晶粉末，分子量為389.4，最大吸收光波長為490～495nm,最大發射光波長為520～530nm,呈現明亮的黃綠色螢光，是目前應用最廣泛的螢光素。

FITC-FACG:就是FACG進行螢光標記，FITC與FACG四肽結合，結合後不影響FACG四肽的結構和功能，通過在螢光顯微鏡下觀察，具有強烈的黃綠色螢光，可用於FACG的定位或定量的檢測。

血腦屏障(Blood Brain Barrier)：指腦毛細血管壁與神經膠質細胞形成的血漿與腦細胞之間的屏障和由脈絡叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障，這些屏障能夠阻止某些物質(多半是有害的)由血液進入腦組織，維持中樞神經系統正常的生理狀態。但是，由於許多治療中樞神經系統疾病的藥物難以透過血腦屏障，限制了它們在臨床上的應用。

三、實驗結果

結果可見圖3，Control為正常動物靜脈注射生理鹽水組，切片後鏡下觀察，無螢光標記的神經細胞；缺血後靜脈注射FITC 8μmol/kg組，鏡下可觀察到有極少量螢光標記的神經細胞；腦缺血後注射FITC-CG，鏡下也只觀察到極少量螢光細胞；腦缺血後注射FITC-FCG和FITC-FACG(8μmol/kg),鏡下可見大量螢光標記的神經細胞，並且後者比前者鏡下觀察到的螢光細胞數量更多，螢光信號更強(見附圖3)，表明Phe作為穿透細胞膜的載體，可攜帶CG穿透血腦屏障，進入大腦，並且Ala作為疏水性胺基酸，在大鼠缺血情況下，通過靜脈注射方式，進一步增加FCG透過血腦屏障的能力，使FACG更高效的進入大腦。

【實施例4】建立大鼠腦缺血模型，靜脈注射FACG後檢測腦內甘氨酸和半胱氨酸的水平

一、實驗儀器及試劑

美國Agilent1100高效液相色譜儀，UV檢測器及色譜數據處理系統；Gly,Cys標準品(美國sigma公司)；2,4-二硝基氟苯(成都西亞試劑有限公司)；乙腈，甲醇(色譜級，國藥集團化學試劑有限公司)；超純水；其餘試劑均為分析純。

二、實驗方法

胺基酸標準品儲備液的配製 精密稱取Gly,Cys標準品各10mg,置於10ml容量瓶中，用甲醇/水(1:1)溶解並稀釋至刻度，使配成濃度為1mg/ml的儲備液。

衍生化試劑的配製 DNFB用乙腈配成0.5％的溶液，避光保存。

樣品預處理和衍生化 建立大鼠腦缺血模型，後隨即分為兩組，一組為對照組，缺血5h後靜脈注射生理鹽水；另一組為實驗組，靜脈注射13mg/kgCGPF,24h後取腦，在冰上分離大鼠缺血腦損傷區，用生理鹽水製備組織勻漿，15000rpm，4度離心20min，取上清，一部分測BCA,另一部分再加入兩倍體積甲醇,15000rpm，4度離心10min,除去蛋白，所得上清液即用來測定甘氨酸和半胱氨酸的含量。

色譜條件 色譜柱：大連依利特Hypersil BDS C18(4.6×200mm,5μm)；流動相:A為0.05mol/L的醋酸鈉緩衝液(pH＝6.5),B為乙腈-水(1:1,V/V),梯度洗脫程序B由初始時的16％經10min增至45％,25min至85％，30min至16％；流速:1mL/min；檢測波長:360nm；柱溫:30℃，取30μL進樣分析。該色譜條件下，甘氨酸和半胱氨酸在30min內得到有效分離，保留時間為：Gly(10.21min),L-Cys(23.71min)所得色譜圖見圖4。

線性關係 精密量取Gly和Cys混合標準儲備液，用甲醇/水(1:1)將儲備液分別稀釋成0.1,1,4,10,40,200ug/ml的對照液。衍生後各取30ul進樣，以上述色譜條件進行測定，以峰面積(Y)與標準品濃度(X)進行線性回歸。結果表明，Gly和Cys在0.1～200ug/ml範圍內線性關係良好，相關係數Gly為0.9991，Cys為0.9997。

三、實驗結果

樣品測定 大鼠腦缺血損傷區Gly和Cys的含量測定結果見表1。

表1大鼠腦缺血損傷區Gly和Cys的含量

與模型組相比，**P<0.01，#P<0.05

大鼠腦缺血後，靜脈給FACG組，大鼠腦缺血損傷區Gly和Cys的含量均高於缺血後給生理鹽水組，說明靜脈給缺血大鼠FACG後，FACG透過血腦屏障，進入大腦，水解生成Gly和Cys。

【實施例5】建立大鼠腦缺血模型，確定FACG對腦缺血後的保護作用

一、實驗藥品及試劑

FACG,由本實驗自主合成；水合氯醛，國藥集團化學試劑有限公司；TTC,武漢科瑞生物技術有限公司提供；無菌生理鹽水，武漢濱湖雙鶴藥業有限責任公司；肝素鈉注射液，南京新百藥業有限公司提供；依達拉奉注射液，國藥集團國瑞藥業有限公司，30mg/一支。

二、實驗動物

動物SPF級SD雄性大鼠，體重240-260g。武漢大學動物實驗中心提供，動物合格證號為NO.42000500006247，生產許可證號：SCXK(鄂)2014-0004。鼠飼料，購於武漢大學實驗動物中心。

三、實驗方法

240-260g的大鼠隨機分組：假手術組，缺血組，缺血加藥組，假手術組和缺血組靜脈都給400μl的生理鹽水，缺血加藥組的藥物濃度分別是FACG組12mg/kg,依達拉奉組6mg/kg,藥物均溶解在400μl生理鹽水中，缺血5h後靜脈一次性給予。

動物給藥方式的選擇：動物的外周給藥方式主要有三種，分別是口服，腹腔注射和靜脈注射。傳統口服藥物和腹腔注射藥物，藥物都需要先由腸道吸收後進入血液，藥物在吸收過程中需要一定的時間並且會有一定程度的損耗，進入血液中的藥物就少了。而靜脈注射藥物相對於傳統給藥方式，藥物是直接進入血液，血液中藥物濃度100％，並且直接發揮作用。在藥物的有效濃度範圍內，選擇靜脈給藥所需的藥物濃度更低，作用時間更短，副作用小，因此本實驗選擇靜脈給藥。

大腦中動脈栓塞(MCAO)模型的製備：首先採用10％的水合氯醛根據動物體重(0.035ml/kg)進行腹腔注射麻醉，麻醉成功後用改良的線栓法製備大腦中動脈缺血模型。選擇與SD大鼠體重匹配的線栓，術前先侵泡在盛有肝素的EP管中。在頸外動脈遠心端剪一小口後，將前端有圓頭的線栓從小口處，調整方向後插入頸內動脈，線栓插入深度為線栓頭端到黑色標記處，長約17-19mm。栓塞90min後，再小心將線栓撥出。縫好皮膚，塗抹絡合碘，術後放置在電熱毯上，對SD大鼠進行保溫處理。

假手術建模：進行缺血手術操作，線栓從頸外動脈插入頸內動脈後迅速拔出不留置線栓。

檢測指標採用Zea Longa方法進行神經功能缺失評分：

0分，沒有任何神經功能缺失；

1分，明顯可見SD大鼠左前肢內收，前爪不能外展；

2分，明顯可見SD大鼠向左側未缺血側成追尾狀地轉圈；

3分，明顯可見SD大鼠向左側未缺血側成傾倒狀；

4分，明顯可見SD大鼠的意識障礙，無自主行走。

該檢測指標用於評價SD大鼠MCAO缺血模型是否成功，缺血動物選擇1-2分作為實驗動物。

另一指標為TTC染色：TTC染料參與正常組織中的琥珀酸脫氫反應呈紅色。缺血組織內蛋白變性壞死，脫氫酶活性顯著下降，無法發生琥珀酸脫氫反應，因此不呈現紅色而呈白色。TTC染色可以檢測哺乳動物組織的缺血梗死程度。

染色步驟如下：

1.冰上快速提取完整的腦組織放入一次性細胞培養皿中。

2.將組織放入-20℃冰箱中20min。

3.將組織放在室溫中數秒，等待腦組織的硬度稍微變軟

4.用刀片在冠狀面截取8等分的腦片，每片2mm。

5.將TTC染料倒入培養皿中，使腦片懸浮在液體中，腦片上表面和下表面都需接觸TTC液體。

6.放入37℃恆溫箱中15min-20min(避光)。

7.取出後傾倒染料，用生理鹽水漂洗後換上4％PFA 4℃固定過夜。

8.第二天取出用掃瞄儀進行數據圖像採集並採用ImageJ軟體分析梗死體積(梗死體積＝[(VC－VL)/V C],VC是對照半球體積，,VL是損傷半球非梗死體積)。

四、實驗結果

結果可見圖5，未給藥的腦缺血組，梗死體積為0.359±0.041；靜脈注射FACG 12mg/kg的缺血大鼠，梗死體積是0.021±0.008；靜脈注射6mg/kg依達拉奉，梗死體積為0.141±0.015；相對於靜脈給生理鹽水，依達拉奉組，給FACG四肽藥組有更低的梗死體積，並且有統計學意義(p<0.05)。結果表明FACG四肽可改善腦卒中，且作用明顯優於臨床用藥依達拉奉(見表2，附圖5)。

表2合成肽對缺血大鼠的保護作用及與依達拉奉的比較

與模型組相比，**P<0.01，*P<0.05。

【實施例5】L-苯丙氨酸-L-丙氨酸-L-半胱氨酸-甘氨酸四肽注射液製備

L-苯丙氨酸-L-丙氨酸-L-半胱氨酸-甘氨酸四肽注射液，100g L-苯丙氨酸-L-丙氨酸-L-半胱氨酸-甘氨酸四肽凍乾粉分裝到1000個已滅菌的管制凍幹瓶中，真空封瓶，儲存於-20或-80℃，每瓶含L-苯丙氨酸-L-丙氨酸-L-半胱氨酸-甘氨酸四肽100mg,用氯化鈉注射液或5％葡萄糖溶解,靜脈緩慢滴注。