溶液中成分的光學測定方法

2023-11-12 01:17:17 2

專利名稱：溶液中成分的光學測定方法
技術領域：
本發明涉及光學地測定試樣溶液中的蛋白質及尿、血液、血清、血漿、唾液、汗等體液中的各種成分的方法。
尿蛋白，正常情況下，一天排洩20～80mg，但在各種病態時，尿中排洩的蛋白質有變化。也就是，由於尿中蛋白量是診斷病態的指標，所以其測定精度及準確度要求高水平。另外，尿中排洩的各種蛋白質，對於不同疾病有各種指標，所以要個別地加以鑑別，即需要特異檢查法。
作為測定尿蛋白量的方法，以往使用在尿中添加蛋白沉澱試劑，由生成的沉澱層厚度，概測蛋白質濃度的Esbach法(使用苦味酸)及末吉法(使用氯化銀)等，但這些方法，在特異性及精度上存在問題。目前，使用比濁由水楊醯磺酸及三氯醋酸引起混濁的方法(比濁法)及利用蛋白質與色素結合的比色法。
比濁法時，根據蛋白質種類，而濁度不同。缺乏特異性。被測定物質是強鹼性時，完全中和酸性沉澱試劑，成為假陰性的原因。另外，也有混濁度的觀察未標準化，產生個人差異的問題。
對於比色法，血紅蛋白及各種球蛋白還不能像白蛋白那樣進行銳敏反應，另外，在被測定物質是高度緩衝成鹼性時，成為假陽性。而且色調的判別困難。
由於尿經過一段時間，有效成分會發生變化，改變了其性質，所以尿樣檢查需迅速進行。但是，對於比色法，是使其與pH指示劑進行反應，用其色調判定變化，對於比濁法，是通過加熱及添加酸，使蛋白質沉澱，判定其混濁度。也就是，比色法及比濁法，由於需要它們進行反應，所以繁雜、缺乏迅速性。
在臨床檢查中，作為測定體液中成分的方法，有試劑法、試紙法、化學發光法、免疫測定法、酶法、色譜法等。
試紙法所用的試紙，大多是用粘結劑等，將含在纖維素中反應試劑的反應部分固定在塑料載體上使其乾燥的。當反應部分含有溼氣時，會在試劑間發生反應，另外由於高溫及光也會變性，使靈敏度降低，所以裝有試紙的容器必須密閉、避免高溫地進行保存，必須在有效期內使用。例如尿檢查的試紙法，對於pH、蛋白質、葡萄糖、酮體、膽紅素、潛血、尿膽素原、細菌感染、比重等項目，可在1分鐘內，同時進行多項測定，但是試劑部分的反應，除了內因性的促進物質及阻礙物質之外，還由於反應溫度及溼度，受到影響，而且只能是半定量。試紙法的判定方法，主要是比色法，其反應機理主要是酶反應及氧化還原反應等化學反應。對於試劑法，主要是通過指示劑及酶、化學反應的比色法及在蛋白測定中使用的比濁法。
酶法，對於被測定物質的特異性高，且簡便，但有由於體液自身具有的色調，有隱蔽陽性反應的危險，進而，在進行氧化還原反應時，有由於內因性、外因性的各種氧化、還原反應物質，抑制反應，產生假陰性、假陽性的危險性。
但是，由於上述任何方法都是通過媒介反應進行測定的間接測定方法，所以有潛在的誤差。概括地說，在用比色法進行判定時，對比判定的結果，容易產生誤差，通過化學反應的，其特異性低。另外，由於在體液中大量存在影響其檢查的物質，所以會阻礙反應，發生假陽性反應，呈現與陽性反應不同的色調，隱蔽陽性反應。使用原來酶的體系不穩定，通過化學反應的體系，容易受到共存物質的影響。另外，在檢查項目的臨床的意義相互關聯(膽紅素與尿膽素原、蛋白與潛血、葡萄糖與酮體)時，同時進行多項試驗的綜合判定是有用的，但分別進行各項目試驗繁雜，而且容易受幹涉物的影響。多項目試紙價格高，且難判定，所以敬而遠之。
對於試劑法、試紙法及酶法，需要有作為消耗品的試劑、試紙或酶等，另外也存在使用前的試劑等的保存穩定性及使用後的廢棄問題。進而，也有由於試劑及試樣添加量等操作時的錯誤引起誤差的可能性，操作繁瑣，受到不是測定目的的抗壞血酸等其他成分的幹涉的缺點。對於試劑法及酶法，可對單成分進行定量測定，但不能同時進行多成分測定，另外，對於試紙法，可同時測定多成分但存在只能半定量的缺點。
對於化學發光法，需要發光的物質；對於通過抗原抗體反應的免疫測定法，一般需要洗淨，有工時多、幹涉物影響及非特異吸附的缺點。
對於色譜法，需要有分離等前處理，另外，混合試樣中的目的物質不能直接定量。
本發明的第1個目的在於提供一種不通過上述媒介反應，可簡單而迅速地測定溶液中蛋白質的定量方法。
本發明的第2個目的在於提供一種不需要作為消耗品的試劑、試紙或酶等，進而，沒有這些消耗品使用前保存安全性及使用後的廢棄問題，也沒有成為產生誤差原因的繁瑣操作及由其他成分的幹攏作用等問題，從而，同時定量測定體液中多種成分的方法。
本發明者們發現了被測定物質中的蛋白質和其他成分具有固有的光散射光譜。本發明就是利用其光散射光譜，由其峰強度或適當的波數範圍的累積強度，定量測定各主要成分濃度的。
測定溶液中蛋白質濃度的本發明第1種情況，是在含有蛋白質的試樣溶液中，照射單一波長的激發光，接受來自該試樣溶液的散射光，分光後得到光散射光譜，在該散射光譜中作成對於激發波長的偏移波數，使用100～3100cm-1光譜的波峰強度或其中適當範圍的積分值定量地測定蛋白質的測定方法。
來自蛋白質水溶液試樣的光散射光譜主要是寬廣的螢光光譜，但根據蛋白質的種類和激發波長，在螢光光譜上，重疊出現尖銳的喇曼散射光譜。因此，在本發明的第1種情況時，作為對象的光散射光譜，同時包括了螢光和喇曼散射。
蛋白質是白蛋白時，最好使用從激發波長偏移到810～840cm-1的光譜波峰強度或者從激發波長632.8nm偏移到256～1620cm-1或從激發波長514.4nm偏移到837～3060cm-1的光譜的適當範圍的積分值。
蛋白質是γ-球蛋白時，最好使用從激發波長偏移到175～195cm-1、425～450cm-1、640～670cm-1、820～845cm-1、845-870cm-1、1370～1400cm-1、1575～1620cm-1、1850～1900cm-1、2000～2200cm-1、2350～2400cm-1或2400～2460cm-1的光譜波峰強度。
蛋白質是血紅蛋白時，最好使用從激發波長偏移到640～670cm-1、820～845cm-1、1370～1400cm-1、1575～1620cm-1、1850～1900cm-1、2000～2200cm-1、2350～2400cm-1或2400～2460cm-1的光譜波峰強度。
同時定量測定體液中多種成分的本發明的第2種情況時，從被測定物質中的各體液中成分得到固有喇曼散射光譜，利用該光譜可以從光譜強度或光譜積累強度或者任意波數範圍多個波數的喇曼散射光譜強度定性、定量地測定各成分。
第2種情況的第1方案中，對於將要測定的體液中各成分，預先選擇該成分的濃度和喇曼散射光譜強度的相關良好的波數，作為該成分固有的測定波數，對體液照射激發光，測定被測各成分在各種測定波數下喇曼散射光譜強度，利用對各成分在各種測定波數下喇曼散射光譜強度和該成分濃度預先作成的標準曲線，同時定性、定量分析體液中的各成分。測定波數下的喇曼散射光譜強度是指喇曼散射光譜峰的峰高。代替峰高也可以測定含有該測定波數的測定波數範圍的喇曼散射光譜峰的峰面積，來定性、定量。
第2種情況的第2方案中，對於體液試樣照射激發光，以被測體液中多種各成分濃度和喇曼散射光譜強度的相關性良好的波數作為各成分固有的測定波數，測定這些測定波數下的喇曼散射光譜強度，或者測定任意波數範圍的多個波數的喇曼散射光譜強度，用多變量回歸分析同時定性、定量分析體液試樣中的多種成分。
對於被測各體液中成分，選擇其單成分水溶液的濃度和該固有喇曼散射光譜強度間的相關係數R0.8以上，優選的是0.9以上的波數作為該成分固有的測定波數。相關係數R按下式求出。R=i=1n{(xi-X)(yi-Y)}[i=1n(xi-X)2][i=1n(yi-Y)2]]>xi體液中成分的各點濃度yi對於xi喇曼散射光譜強度
X體液中成分的各點濃度平均值Y喇曼散射光譜強度的平均值對於各成分優選的測定波數或測定範圍如下對於白蛋白從590～650cm-1附近、800～860cm-1附近、2342～2402cm-1(參照

圖17)中選擇；對於球蛋白從158～218cm-1附近、402～462cm-1附近、623～683cm-1附近、807～867cm-1附近、822～862cm-1附近、1353～1413cm-1附近、1562～1622cm-1附近、1847～1907cm-1附近、2095～2155cm-1附近、2340～2400cm-1附近、2403～2463cm-1附近(參照圖47)中選擇；對於血紅蛋白從807～867cm-1附近、893～953cm-1附近、1353～1413cm-1附近、1562～1622cm-1附近、1840～1900cm-1附近、2095～2155cm-1附近、2340～2400cm-1附近、2403～2463cm-1附近(參照圖48)中選擇；對於葡萄糖從200～554cm-1附近、810～944cm-1附近、2590～2940cm-1附近(參照圖19)中選擇；對於乙醯醋酸鋰從799～859cm-1附近、1353～1413cm-1附近、1840～1900cm-1附近、2347～2407cm-1附近、2907～2967cm-1附近(參照圖45)中選擇；對於β-羥基丁酸從1420～1480cm-1附近、1557～1617cm-1附近、1600～1660cm-1附近、2870～2971cm-1附近(參照圖46)中選擇；對於丙酮從775～845cm-1附近、1050～1110cm-1附近、1207～1267cm-1附近、1399～1459cm-1附近、1680～1740cm-1附近、2911～2971cm-1附近(參照圖25)中選擇；對於雙牛膽紅素從927～987cm-1附近、1233～1293cm-1附近、1586～1616cm-1附近(參照圖49)中選擇；對於尿膽素從332～2900cm-1選擇任意的位置；對於亞硝酸鈉，從783～843cm-1附近、1318～1378cm-1附近(參照圖50)中選擇；對於尿素從501～561cm-1附近、567～627cm-1附近、978～1048cm-1附近、1033～1093cm-1附近、1138～1198cm-1附近、1583～1643cm-1附近(參照圖21)中選擇；對於尿酸從640～700cm-1附近(參照圖51)中選擇；對於葉酸從631～691cm-1附近、816～876cm-1附近、901～961cm-1附近、1355～1415cm-1附近、1562～1622cm-1附近、1847～1907cm-1附近、2093～2153cm-1附近、2339～2399cm-1附近、2400～2460cm-1附近(參照圖52)中選擇；對於抗壞血酸從800～860cm-1附近、1673～1733cm-1附近、2919～2979cm-1附近(參照圖53)中選擇；對於維生素B2從404～464cm-1附近、626～686cm-1附近、798～858cm-1附近、860～920cm-1附近、1317～1377cm-1附近、1546～1606cm-1附近、1834～1894cm-1附近、2106～2166cm-1附近、2360～2420cm-1附近、2419～2479cm-1附近(參照圖54)中選擇；對於肌酸1水合物從800～860cm-1附近、1563～1623cm-1附近(參照圖55)中選擇；對於肌酸肝從538～598cm-1附近、580～640cm-1附近、665～725cm-1附近、817～877cm-1附近、868～928cm-1附近、1021～1081cm-1附近、1550～1610cm-1附近、2868～2900cm-1附近、2900～2950cm-1附近、2950～2996cm-1附近(參照圖56)中選擇；
對於α-澱粉酶從393～453cm-1附近、631～691cm-1附近、792～852cm-1附近、868～928cm-1附近、1333～1393cm-1附近、1546～1606cm-1附近、1834～1894cm-1附近、2334～2394cm-1附近(參照圖57)中選擇；對於β-澱粉酶從376～436cm-1附近、622～682cm-1附近、783～843cm-1附近、868～928cm-1附近、1334～1394cm-1附近、1546～1606cm-1附近、1834～1894cm-1附近、2665～2725cm-1附近(參見圖58)中選擇；對於氨從3190～3250cm-1附近、3292～3350cm-1附近、3377～3437cm-1附近(參照圖59)中選擇；對於肌醇從404～464cm-1附近、805～865cm-1附近、1014～1074cm-1附近、1438～1498cm-1附近、2966～3026cm-1附近(參照圖60)中選擇；對於半乳糖從466～526cm-1附近、835～895cm-1附近、1032～1092cm-1附近、1237～1297cm-1附近、1332～1392cm-1附近、1438～1498cm-1附近、2946～3006cm-1附近(參照圖61)中選擇；對於果糖從569～629cm-1附近、772～832cm-1附近、1044～1106cm-1附近、1237～1297cm-1附近、1438～1498cm-1附近、2966～2996cm-1附近(參照圖62)中選擇。
體液檢體包括上述成分中的2個以上成分時，希望在體液檢體上照射單一波長的激發光接收來自該體液檢體的散射光，得到的喇曼散射光譜中，對於各成分，在上述設定的波數區域，且以互相不重疊的波數區域的光譜強度為基礎，算出各成分濃度。
多變量回歸分析運算是使用主成分回歸分析法(PCR法)及部分最小二乘法(PLS法)等的多變量回歸分析法，進行數據分析。對於多變量回歸分析法，由於可一次地使用多個光譜強度進行回歸分析，所以與單回歸分析相比，可進行高精度定量分析。重回歸分析最經常使用，但需要多個試樣，在各波數的光譜強度之間的相關高時，其定量分析精度變低。另一方面，多變量回歸分析法的PCR法，可將在多個波數區域中的光譜強度集束成相互無關的主成分，進而，可消除不需要的雜波數據，所以可得到高的定量分析精度。另外，PLS法，在主成分萃取時，也可利用試樣濃度數據，可得到與PCR法同樣高的定量分析精度。關於多變量回歸分析，可參考「多變量解析」(中谷和夫著、新曜社)。
為了從由於各種變動要因引起複雜變動的光譜中，取出需要的信息，用計算機進行的數據處理，起了很大作用。代表性的處理方法是在市售的近紅外裝置等中安裝了處理用的軟體。另外，作為市售的軟體，有COMO社的安斯克蘭帕。所謂的代表性的處理方法，是指上面列舉的重回歸分析及PLS法、主成分回歸分析等。
適用於定量分析的數據處理的大的流程是1)製作成校正模型2)校正模型的評價3)未知試樣的定量。
在進行校準時，需要以足夠的精度測定適當個數用作標準曲線的試樣。得到的光譜，根據需要進行前處理。作為代表性的前處理，有光譜的平滑化及微分、正規化，其中任何一種都是一般的處理。
接著，所說校準，就是建立光譜數據與目的特性的分析值之間的數學關係式即模型的處理。模型的製作是使用標準曲線製作用試樣的分析值和光譜數據，通過統計順序，而進行的。
為了正確評價製作的標準曲線對於未知試樣預測的精度，通過評價用試樣，可求出對於未知試樣的測定誤差。在判定標準曲線的精度不夠時，根據需要，變更處理法的種類及參數，修正標準曲線。
認為精度足夠的標準曲線在進行未知試樣的分析時，作為由光譜數據預測目的特性值的關係式使用，用於定量未知試樣濃度。
圖1表示多變量回歸分析的一般順序的流程圖。進行標準曲線製作用試樣(分析值已知)的喇曼散射光譜測定，根據需要，進行平滑化及正規化等的前處理後，從得到的喇曼散射光譜數據(在各波數的喇曼散射光譜強度)，使用多變量回歸分析，進行校準後，製成校準模型。
接著，進行用以評價該校準模型的評價用試樣(分析值已知)的喇曼散射光譜的測定，根據需要，進行平滑化及正規化等前處理後，將得到的喇曼散射光譜數據，代入校準模型中，將評價用試樣的實測值，與來自校準模型的計算值進行比較，評價校準模型的精度。精度不夠時，回到標準曲線製作用試樣的光譜測定及前處理、校準模型製作等階段，根據需要，進行變更處理，對於校準模型加以修正，通過評價用試樣的喇曼散射光譜數據，反覆進行評價。若判定達到足夠精度時，將通過未知試樣(未知分析值)的喇曼散射光譜測定得到的喇曼散射光譜數據，代入該校準模型中，計算濃度。
本發明是將尿及血液等體液作為檢體，作為臨床檢查的手段來使用的。白蛋白和球蛋白是腎病症狀群及腎炎等指標、血紅蛋白是尿路系統等的炎症及腫瘤指標、葡萄糖是糠尿病指標、乙醯醋酸鋰、β-羥基丁酸及丙酮，是酮酸中毒指標，膽紅素是肝、膽道疾病指標、尿膽素原是肝、膽道疾病及溶血性疾病指標、亞硝酸鈉是尿路系統細菌感染等的指標。尿中尿素對於了解體內蛋白代謝、肝、腎功能等是有用的，若它們增加，可考慮服用體蛋白異化的亢進及奎寧等藥物，若減少，可導致肝實質障礙及腎功能不全。進而，尿中尿素量，也表明是尿比重的指標(「新訂臨床檢查研修手冊3」小酒井望、樂事日報社)，一般，滲透壓、折射率、尿比重相關良好，三者的判定可用比重代用(「臨床檢查法提要」金井正光、金原出版株式會社)。進而尿酸是尿路結石及高尿酸血症、葉酸是伴隨胃及腸切除的吸收不良症候群及惡性腫瘤、肌酸是類甾醇肌病、肌酸酐是肌肉疾病及腎疾病、急性胰腺炎及胰腺閉塞、氨是代謝異常及重症肝疾病等的指標。
另外，由於膽紅素不溶於水，進行實驗時，使用雙牛膽紅素。所謂的雙牛膽紅素是牛磺酸抱合型膽紅素，基本骨架相同，2個羰基是與牛磺酸進行脫水結合的。若與You-Zing Hsieh等(Langmuir 1987，3，1141-1146)進行的膽紅素的SERS(表面增強喇曼分光法)光譜進行比較，由於除了本次得到的喇曼光譜的690.065cm-1附近的峰以外，大致是相同的光譜，除此以外，可以說是來自膽紅素的峰。另外，由於認為CH2作橫向擾動的957.5cm-1附近的峰中，也含有牛磺酸部分的CH2的振動，所以對於膽紅素，可預想到相對強度會變低一些。
另外，關於尿膽素，由於尿膽素原不穩定，遇到空氣氧化變成尿膽素，所以用尿膽素進行測定。尿膽素是通過氧化尿膽素原的一個-NH-，成為-N＝的。該-NH-的峰位置是3530～3480cm-1，由於與作為溶劑的水的O-H伸縮振動(3650～3400cm-1)的位置重疊，而被隱蔽起來，所以預想兩者的光譜大致相同。
白蛋白的2372.8cm-1附近的峰，可認為是由於NH+伸縮振動引起的。
可以認為球蛋白的188.232cm-1附近的峰及432.919cm-1附近的峰是由CCC的振動、653.937cm-1附近的峰是由CH2、CH的振動、837cm-1附近的峰是由CH2的振動、852cm-1附近的峰是由CH2CH的振動，1383.49cm-1附近的峰是由醯胺III的振動、1592.41cm-1附近的峰是由醯胺II的振動、1877.64cm-1附近的峰是由CH2的振動、2125.39cm-1附近的峰是由CC的振動、2370cm-1附近的峰是由NH+的振動、2433cm-1附近的峰是由SH的振動引起的。
可認為血紅蛋白837cm-1附近的峰是由CH2的振動、923.373cm-1附近的峰是由CH3的振動、1383.49cm-1附近的峰是由醯胺III的振動、1592.41cm-1附近的峰是由醯胺II的振動、1870.82cm-1附近的峰是由CH2的振動、2125.39cm-1附近的峰是由CC的振動、2370cm-1附近的峰是由NH+的振動、2433cm-1附近的峰是由SH的振動引起的。另外，由於共振喇曼分光法的氧基血紅蛋白的光譜記載在「喇曼分光學」(P.R.CAREY著)上，可作為參考。
可以認為D-葡萄糖的405cm-1附近的峰是由CCO的振動、524cm-1附近的峰由基本骨架振動、648cm-1附近的峰由CC的振動、779cm-1附近的峰及840cm-1附近的峰是由CH的振動、914cm-1附近的峰是由CH和COH的振動、1054cm-1附近的峰是由CH的振動、1076cm-1附近的峰是由CH和COH的振動、1276cm-1附近的峰及1346cm-1附近的峰是由COH的振動、1426cm-1附近的峰是由CH2的振動、1640cm-1附近的峰是由HOH的振動、2900cm-1附近的峰是由CH和CH2的振動引起的。
可認為乙醯醋酸鋰的829.379cm-1附近的峰、1383.49cm-1附近的峰及1870.82cm-1附近的峰是由CH2的振動、2937cm-1附近的峰是由CH3和CH2的振動引起的。
可認為β-羥基丁酸的1450.98cm-1附近的峰是由CH2的振動和CO2-的振動、1587.69cm-1附近的峰是由CO2-的振動、1630cm-1附近的峰是由CO的振動、2900cm-1附近的峰是由CH2的振動、2959cm-1附近的峰是由CH3的振動引起的。
可認為丙酮的805cm-1附近的峰、1080cm-1附近的峰、1429cm-1附近的峰及2940cm-1附近的峰是由CH3的振動、1237cm-1附近的峰是由CH3C的振動、1710cm-1附近的峰是由CO的振動引起的。
可認為雙牛膽紅素的690.065cm-1附近的峰是由CC的振動、957.5cm-1附近的峰及1458.88cm-1附近的峰是由CH2的振動、1263.96cm-1附近的峰是由CH2的振動及CO的振動、1616.29cm-1附近的峰是由CC的振動及CO的振動引起的。
尿膽素其自身具有的螢光強，沒有喇曼峰。
可認為亞硝酸鈉的813cm-1附近的峰及1339.5cm-1附近的峰是由NO的振動引起的。
可認為尿素的531.939cm-1附近的峰、1008cm-1附近的峰及1168.35cm-1附近的峰是由CN的振動、597.248cm-1附近的峰是由CO的振動、1613.67cm-1附近的峰是由CO及NH2的振動引起的。
測定尿試樣時，通過以每小時的排洩量為一定的肌酸酐的濃度作為基準，將其他尿成分的濃度規格化，可校正因尿量變化的尿成分濃度。
對於本發明，可不通過酶反應及化學反應等的媒介反應和中間反應，直接定量試樣。由於不使用試劑，難以受到共存物質的影響，可排除伴隨反應的誤差。由於從取樣到測定，不需要進行反應等操作，所以可簡便，且迅速地進行測定。
本發明由於是高靈敏度的，所以對微量變化及微量成分的檢測也是有效的。這樣，本發明適用於尿中微量蛋白的定性及定量檢測。
本發明中，向體液試樣中照射激發光關於要從得到的光譜測定的多個體液成分，得到適當波數位置的強度，可定量分析體液中的成分，不需要試紙及試劑等消耗品，另外，也沒有使用後的廢棄問題。
另外，即使在有體液中其他成分的幹涉時，通過利用多變量回歸分析法等方法，可同時定性、定量分析體液中的多個成分。
圖1是適用多變量回歸分析法時的表示從光譜測定到濃度定量的程序的流程圖。
圖2是概略表示實施本發明的測定裝置的方框圖。
圖3是表示使用全息陷波濾波器作為測定對象光學調節部的濾波裝置，對於試樣，與激發光成180度方向，接受測定對象光的測定裝置的配置圖。
圖4是表示使用全息陷波濾波器作為測定對象光學調節部的濾波裝置，對於試樣，與激發光成90度的方向，接受測定對象光的測定裝置的配置圖。
圖5A是表示使用全息分光器作為測定對象光學調節部的濾波裝置，對著試樣，與激發光成180度的方向，接受測定對象光的測定裝置的配置圖。
圖5B是表示在圖5A的全息分光器部分的概略斷面圖。
圖6A是表示使用帶通濾波器作為測定對象光學調節部的濾波裝置，對著試樣，與激發光成90度方向，接受測定對象光的測定裝置的配置圖。
圖6B是表示帶通濾波器的概略斷面圖。
圖7是表示使用帶通濾波器作為測定對象光學調節部的濾波裝置，對著試樣與激發光成180度方向，接受測定對象光的測定裝置的配置圖。
圖8是表示使用流動室時，被測定物質的流入及排出路徑的透視圖。
圖9是從白蛋白水溶液試樣得到的光散射光譜，A是以He-Ne雷射的632.8nm的波長光作為激發光照射的情況、(B)是以Ar雷射的514.5nm波長光作為激發光照射的情況。
圖10是表示圖9(A)的光散射光譜時的光譜強度或面積與試樣中白蛋白濃度的相關關係的圖，(A)是偏移波數在829cm-1位置的光譜強度的結果、(B)是偏移波數256～1620cm-1範圍面積的結果。
圖11是從γ-球蛋白水溶液試樣得到的光散射光譜，(A)是以He-Ne雷射的632.8nm波長光作為激發光照射的情況、(B)是以Ar雷射的514.5nm波長光作為激發光照射的情況。
圖12(A)～(C)是表示在圖11(A)的光散射光譜中，偏移波數分別為837.257cm-1、1383.49cm-1、1592cm-1位置的光譜強度與試樣中的γ-球蛋白濃度的相關關係圖。
圖13(D)～(F)是表示在圖11(A)的光散射光譜中，偏移波數分別為1877cm-1、2125cm-1、2370cm-1位置的光譜強度與試樣中的γ-球蛋白濃度的相關關係圖。
圖14是從血紅蛋白水溶液試樣得到的光散射光譜，(A)是以He-Ne雷射的632.8nm的波長光作為激發光照射的情況，(B)是以Ar雷射的514.5nm波長光作為激發光，照射的情況。
圖15(A)～(C)是表示在圖14(A)的光散射光譜中，偏移波數分別為1870cm-1、2125cm-1、2370cm-1的位置的光譜強度與試樣中的血紅素濃度的相關關係圖。
圖16是表示正常尿的喇曼光譜圖。
圖17是表示在正常尿中，將白蛋白增量約15mg/ml的試樣的喇曼光譜圖。
圖18是表示尿中的白蛋白濃度和波數為2370.75cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖19是在正常尿中，將葡萄糖增量到飽和量的試樣的喇曼光譜圖。
圖20是表示尿中的葡萄糖濃度與波數為0～4000cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖21是表示在正常尿中，將尿素增量約300mg/ml的試樣的喇曼光譜圖。
圖22是表示尿中的尿素濃度與波數1008cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖23是表示在正常尿中，將丙酮增量到60％(V/V)的試樣的喇曼光譜圖。
圖24是表示尿中丙酮濃度和波數1080cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖25是表示在正常尿中，將丙酮增量到37.5％(V/V)的試樣的喇曼光譜圖。
圖26是表示在正常尿中，將丙酮增量到17％(V/V)、將尿素增量到25mg/ml及將葡萄糖增量到416μg/ml的試樣的喇曼光譜圖。
圖27是表示在正常尿中，將丙酮增量到17％(V/V)、將尿素增量到50mg/ml及將葡萄糖增量到1.17mg/ml的試樣的喇曼光譜圖。
圖28是表示尿中的尿素濃度與波數1008cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖29是表示尿中的尿素濃度與波數為1063cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖30是表示尿中的尿素濃度與波數在1168cm-1的喇曼散射光譜強度的相關圖。
圖31是表示尿中的尿素濃度與波數為531cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖32是表示尿中的尿素濃度與波數為597cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖33是表示尿中的尿素濃度與波數為1613cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖34是表示尿中的丙酮濃度與波數為805cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖35是表示尿中的丙酮濃度與波數為1237cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖36是表示尿中的丙酮濃度與波數為1429cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖37是表示尿中的丙酮濃度與波數為2941cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖38是表示尿中的葡萄糖濃度與波數為2924cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖39是表示在正常尿中，將白蛋白增量約0.66mg/ml和將乙醯醋酸鋰增量約1.4mg/ml的試樣的喇曼光譜圖。
圖40是表示尿中的白蛋白濃度與波數為620cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖41是表示尿中的乙醯醋酸鋰濃度與波數為829cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖42是表示在正常尿中，將尿膽素增量約0.13mg/ml和將雙牛膽紅素增量約0.286mg/ml的試樣的喇曼光譜圖。
圖43是表示尿中的尿膽素濃度與波數為2370cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖44是表示尿中的雙牛膽紅素濃度與波數為1263cm-1的喇曼散射光強度的相關圖。
圖45是表示在正常尿中，將乙醯醋酸鋰增量13.3mg/ml的試樣的喇曼光譜圖。
圖46是表示在正常尿中，將β-羥基丁酸，增量到16％(V/V)的試樣的喇曼光譜圖。
圖47是表示在正常尿中，將球蛋白增量30mg/ml的試樣的喇曼光譜圖。
圖48是表示在正常尿中，將血紅蛋白增量30mg/ml的試樣的喇曼光譜圖。
圖49是表示在正常尿中，將雙牛膽紅素增量0.3mg/ml的試樣的喇曼光譜圖。
圖50是表示在正常尿中，將亞硝酸鈉增量55.28mg/ml的試樣的喇曼光譜圖。
圖51是表示在蒸餾水中，將尿酸增量到飽和量的試樣的喇曼光譜圖。
圖52是表示在蒸餾水中，將葉酸增量到飽和量的試樣的喇曼光譜圖。
圖53是表示在蒸餾水中，將L-抗壞血酸增量到飽和量的試樣的喇曼光譜圖。
圖54是表示在蒸餾水中，將維生素B2增到飽和量的試樣的喇曼光譜圖。
圖55是表示在蒸餾水中，將肌酸1水合物增到飽和量的試樣的喇曼光譜圖。
圖56是表示在蒸餾水中，將肌酸酐增到飽和量的試樣的喇曼光譜圖。
圖57是表示在蒸餾水中，將α-澱粉酶增到飽和量的試樣的喇曼光譜圖。
圖58是表示在蒸餾水中，將β-澱粉酶增到飽和量的試樣的喇曼光譜圖。
圖59是表示在蒸餾水中，將氨增量到25％(V/V)的試樣的喇曼光譜圖。
圖60是表示在蒸餾水中，將肌醇增到飽和量的試樣的喇曼光譜圖。
圖61是表示在蒸餾水中，將半乳糖增到飽和量的試樣的喇曼光譜圖。
圖62是表示在蒸餾水中，將果糖增到飽和量的試樣的喇曼光譜圖。
圖63是表示各體液中成分的測定波數的圖。
圖64是表示對於提取的體液中成分，各自濃度和喇曼散射光強度的相關係數的圖表。
圖65是表示尿中的多個成分的通過多變量回歸分析法算出的計算值和實測值的相關圖。
圖2～圖7中，表示實施本發明測定裝置的幾個例子。
圖2是概略地表示該測定裝置的圖，它配備有設置有將激發光源及來自該激發光源的光束分割成試樣用光束及校正用光束的光束分離器的激發光源部2、在試樣上照射試樣用光束的試樣部4、備有從在試樣上照射試樣用光束產生的散射光中除去與激發光相同波長成分，並取出含有螢光及喇曼散射光的測定對象光的濾波器及調節光束的光學系統的測定對象光學調節部6、在激發光源部2調節通過半反射鏡分割的校正用光束的校正光學調節部8、將從測定對象光學調節部6射出的光束及從校正光學調節部8射出的校正用光束置於同一光軸上的合波裝置10、備有將由合波裝置10射出的光束進行分光的分光器及檢出用該分光器分光的光譜光的檢出器的1個分光處理部12及以通過分光處理部12的檢出器檢出的分光光譜中的激發光成分的檢出強度為基準，具有校正測定對象光強度功能的數據處理部14。
校正用光束是用以校正光源的發光強度變動的，只要不進行這樣的校正，就不需要在激發光源部的光束分離器、校正光調節部8及合波裝置10。
測定對象光學調節部6的濾波裝置，優選的是從其激發光波長包括在陷波區域的全息陷波濾波器、隱蔽激發光波長及其相近的短波長的截止濾波器、具有使激發光波長成分透過、除去，使測定對象光成分反射的特性的帶通濾波器、及通過透射或反射除去激發光波長的全息光束分離器中選取任何一種。
另外，分光處理部12，優選的是配置多道光檢出器、同時檢出要測定的波長區域的多色儀。分光處理部12是多色儀時，可同時檢出要測定的波長區域，同時可檢出規定區域的測定對象光光譜和激發光。其結果，測定對象光的各波長的檢出時間和激發光的檢出時間沒有差異。但即使測定對象光的各波長的檢出時間和激發光的檢出時間有差異時，作為分光處理部12，也可以配置波長掃描型的分光器及單道光檢出器，依次檢出要測定的波長區域。
全息陷波濾波器是只遮蔽所希望的波長區域，可透過其他區域波長光的。通過在該遮蔽區域(陷波區域)含有激發光波長那樣設定，從測定對象光學調節部6射出的光束，不含有激發光成分，只含有測定對象光成分。另一方面，由於校正用光束、只含有從光源來的激發光，不經過試樣，所以不依靠試樣，可忠實地表示來自光源的強度變化。
圖3～圖7中，詳細地表示圖2方框圖的具體的例子。
圖3是表示使用在陷波區域含有激發光波長的全息陷波濾波器，或含有激發光波長並屏蔽其短波長側的截止濾波器作為測定對象光學調節部6的濾波裝置，對於試樣，與激發光成180度方向接受測定對象光的實施例。在激發光源部2設置光源22，設置半反射鏡26作為將來自光源22的激發光分割成試樣用光束20s及校正用光束20r的光束分離器。作為光源22，例如可使用雷射裝置。作為雷射裝置，可使用連續發振的Ar離子雷射、Kr離子雷射、He-Ne雷射、He-Cd雷射、NdYAG雷射、半導體雷射、或脈衝雷射等，可從近紫外區域到近紅外區域的廣泛波長範圍的雷射中選擇利用。作為雷射裝置以外的光源，也可將滷素燈等發生多波長的光源與分光器等的波長選擇裝置組合使用。
在激發光源部2上，為了將試樣用光束20s集束在試樣部4的試樣5上，在光源聚光透鏡24及集束透鏡28中間設置半反射鏡。將試樣5放入室中並設置在試樣部4。
來自激發光源部2的試樣用光束20s，用配置在測定對象光學調節部6的半反射鏡32進行反射，照射在試樣部4的試樣5上。對於測定對象光學調節部6，為了將來自能透過半反射鏡32的來自試樣5的散射光集束到分光器的入口狹縫50上，設有聚光透鏡34、36。對於測定對象光學調節部6，作為在集光透鏡34和36之間除去與激發光相同波長成分並取出測定對象光的濾波器，是配置在陷波區域含有激發光波長那樣設定的全息陷波濾波器38.全息陷波濾波器例如可從KAISER OPTICAL SYSTEMS。INC.(美國)得到。全息陷波濾波器38，具有可完全遮蔽含有陷波區域的波長光，透過80％以上的陷波區域以外的波長區域的光的特性。
在測定對象光學調節部6的集光透鏡36和分光器的入口狹縫50之前，配置半反射鏡40，作為合波裝置，測定對象光透過該半反射鏡40，入射到分光器52中。
在激發光源部2設置將用半反射鏡26分割的校正用光束20r導向合波裝置的半反射鏡40的校正光學調節部8，在校正光學調節部8中設置有使光量衰減的減光濾波器42、遮蔽在激發光源部2的半反射鏡26發生的波長光，並在光源22是雷射裝置時用以遮蔽雷射側帶的帶通濾波器46、及彎曲光路的鏡子44。用校正光學調節部8，經過半反射鏡40，導入到入口狹縫50的校正用光束20r，通過光源聚光透鏡24，聚光到入口狹縫50上。
用半反射鏡40，將從測定對象光學調節部6射出的測定對象光及從校正光學調節部8導入的校正用光束20r，導入到同一光軸上，經過入口狹縫50，導入到分光處理部12的分光器52中。分光器52是多色儀，它配置有將入射光分光的衍射柵板54及多道光輸出器56，所說的多道光輸出器56為了在規定的波長區域同時檢出由衍射柵板54分光的光譜光，沿著衍射柵板54的分散方向配置多個光檢出元件。圖2的衍射柵板54是凹面衍射柵板，但也可以是將平面衍射柵板與球面鏡組合的稱為策爾尼-塔納型的分光器及使用透過型衍射柵板的分光器。
60是控制各部的動作，處理光檢出器56檢出的信號的處理運算控制部，在其中也包括以通過光檢出器56檢出的分光光譜中的激發光成分的檢出強度為基準，校正測定對象光的檢出強度的作為數據處理部的功能，運算校正光源的變動的喇曼散射光譜，由測定對象光強度，進行試樣的定性及定量。62是輸出用處理運算控制部60處理的數據的列印及顯示等的輸出裝置。
在圖3的實施例中，也可使用具有遮蔽激發光及比其短波長側的尖銳波長特性的尖銳截止濾波器代替全息陷波濾波器38。
以下說明該實施例的動作原理，來自光源部2的試樣用光束24s，用配置在測定對象光學調節部6的半反射鏡32進行反射，照射在試樣部4的試樣5上。來自試樣5的散射光經過測定對象光學調節部6，除去與激發光相同波長的成分，經過半反射鏡40，從入口狹縫50，入射到分光器52中。另一方面，在激發光源部2用半反射鏡26分割的校正用光束20r，經過校正光學調節器8，調節光量，再經過半反射鏡40，從入口狹縫50，入射到分光器52中。通過校正用光束20r來校正由於激發光強度的變動而引起的光譜光強度的變動，檢出各成分的光散射光譜強度。
圖4是與圖3的實施例相同，是使用全息陷波濾波器或截止濾波器作為測定對象光學調節部6的濾波裝置的實施例，是表示對著試樣在與激發光成90度方向，接受測定對象光的實施例。此時，將試樣用光束20s照射在試樣5上不需要將來自試樣5的散射光入射到測定對象光學調節部6的聚光透鏡34的半反射鏡32，試樣用光束20s用激發光光源部2的光源聚光透鏡24及集束透鏡28集束，直接照射到試樣5上，來自試樣5的散射光直接入射到測定對象光學調節部6的聚光透鏡34上。
在圖3中帶通濾波器46配置在校正光學調節部的光路上，但在圖4中，配置在通過光束分離器26將來自激發光源部的激發光源的光束分割成試樣用光束及校正用光束之前的光路上。通過將帶通濾波器46配置在圖4的位置上，可遮蔽來自試樣用光束及校正用光束兩方面雷射的側帶。
另外，在圖4中，在校正光學調節部的光路上進而配置聚光透鏡45，但該透鏡45是將校正用光束聚光到狹縫50的位置的光量調節用透鏡，在校正用光束的光量足夠大時，不需要該透鏡45。
圖5A是表示使用具有反射激發光並透過喇曼光的特性的全息光束分離器70作為測定對象光學調節部6的濾波裝置，對著試樣與激發光成180度方向接受測定對象光的實施例。
全息光束分離器70，如圖5B所示，將試樣用光束20s進行反射，照射在試樣5上，在含有測定對象光和瑞利散射光的來自試樣5的散射光72中，只透過測定對象光74，入射到測定對象光學調節部6的聚光透鏡34中。
圖6A是表示使用具有透過並除去激發光波長成分反射測定對象光成分的特性的帶通濾波器82，作為測定對象光學調節部6的濾波裝置，對著試樣，在與激發光成90度方向，接受測定對象光的實施例。
帶通濾波器82，如圖6B所示，配置在透射聚光型鏡80的鏡面側，在與透射聚光型鏡80相反側，配置光束終止器84。來自含有測定對象光及瑞利散射光的試樣5的散射光72，用聚光透鏡34a、34b，進行聚光，從透射聚光型鏡80的背面，通過其入射孔，入射到帶通濾波器82中。在帶通濾波器82中，瑞利光76透過並被光束終止器84吸收，測定對象光74反射，在透過聚光型鏡80的鏡面上聚光，經過半反射鏡40，從入口狹縫50，入射到分光器中。在校正光學調節部8中，為了將光路彎曲180度，配置2個鏡子44a、44b。
圖7與圖6A相同是使用具有使激發光波長成分透過並除去而反射測定對象光成分的特性的帶通濾波器82作為測定對象光學調節部6的濾波裝置的例子，是對著試樣在與激發光成180度方向上，接受測定對象光的實施例。將試樣用光束20s照射在試樣5上，配置將來自試樣5的散射光入射到測定對象光學調節部6的聚光透鏡34a上的半反射鏡32。
圖8是表示使用流動室時，被測定物質111的流入及排出的路徑圖。被測定物質111，從檢體液流入管線132，流入到室支架130內的流動室中，從開在室支架130的側面的激發光入射窗134入射的激發光，照射在該流動室中，在流動室中激發起的喇曼光，從喇曼光射出窗136出來，進入到測定對象光學調節部6中。測定後，被測定物質111，通過檢體液排出管線138，廢棄到廢液瓶140中。另外，該檢體液排出管線138，也可直接與下水道等水路相通。
在圖8的流動室中，將相對於激發光的測定對象光的受光方向θ，作成90°，但不受此限制，只要在0°≤θ＜360°的任何位置上，有喇曼光射出窗136就可以。
圖9～圖15，表示對於作為尿中蛋白的白蛋白、γ-球蛋白及血紅素的各自的水溶液進行測定的結果。
實施例1圖9和圖10是關於白蛋白水溶液(來自人體血清)的測定結果。圖9(A)是作為激發光源，使用He-Ne雷射(輸出7mW)，將其632.8nm的波長光作為激發光，照射在試樣水溶液上得到的光散射光譜、圖9(B)是在相同試樣中，作為激發光源，使用Ar雷射(輸出10mW)將其514.5nm的波長光作為激發光，照射在試樣水溶液，得到的光散射光譜。任何一種光譜，都從激發波長在100～3100cm-1或其以上範圍作成寬的形狀。
圖10(A)是表示利用圖9(A)的光散射光譜，測定其偏移波數為829cm-1的位置的光譜強度與試樣中白蛋白濃度的相關關係的結果。圖10(B)是表示，在同樣的圖9(A)的光譜中，測定偏移波數為256～1620cm-1範圍的面積與試樣中白蛋白濃度的相關關係的結果。
圖10的相關關係，表示了任何相關係數R為0.99以上的良好的結果，通過將這些相關關係作為標準曲線來利用，可定量分析試樣中的白蛋白濃度。
實施例2圖11～圖13，是關於γ-球蛋白水溶液(來自人體血清)的測定結果。圖11(A)是使用He-Ne雷射(輸出7mW)作為激發光源，將其632.8nm波長光作為激發光照射在試樣水溶液中得到的喇曼光譜、圖11(B)，是在相同試樣中，使用Ar雷射(輸出10mW)作為激發光源，以其514.5nm的波長光作為激發光照射在試樣水溶液中得到的光散光譜.
圖11(A)的光譜，是在從激發波長100～4000cm-1的寬形狀光譜中，從激發波長偏移到175～195cm-1、425～450cm-1、640～670cm-1、820～845cm-1、845-870cm-1、1370～1400cm-1、1575～1620cm-1、1850～1900cm-1、2000～2200cm-1、2350～2400cm-1及2400～2460cm-1的位置上，具有尖銳峰。圖11(B)的光譜，成為從激發波長到100～4000cm-1的寬形狀。
圖12和圖13的(A)～(F)是表示利用圖11(A)的光譜，測定其偏移波數分別為837.257cm-1、1383.49cm-1、1592cm-1、1877cm-1、2125cm-1及2370cm-1位置的光譜強度與試樣中γ-球蛋白濃度的相關關係的結果。
(D)的相關關係的相關係數R表0.97以上、其以外的相關關係的相關係數R表示為0.99以上的優良結果。即使對於在其他的偏移波數位置的峰強度及適當的波數範圍的積分強度，也可得到與γ-球蛋白濃度之間的優良的相關關係。
通過將這些相關關係作為標準曲線進行利用，可定量分析試樣中的γ-球蛋白濃度。
實施例3圖14和圖15是關於血紅蛋白水溶液(來自牛血清)的測定結果。圖14(A)是使用He-Ne雷射(輸出7mW)作為激發光源，將其632.8nm波長光作為激發光，照射在試樣水溶液上，得到的光散射光譜，圖14(B)是對於相同的試樣，使用Ar雷射(輸出10mW)作為激發光源，將其514.5nm波長光作為激發光，照射在試樣水溶液得到的光散射光譜。
圖14(A)的光譜，是激發波長在100～4100cm-1的寬形狀光譜中，在雷射波長偏移到640～670cm-1、820～845cm-1、1370～1400cm-1、1575～1620cm-1、1850～1900cm-1、2000～2200cm-1、2350～2400cm-1及2400～2460cm-1的位置上具有尖銳峰。圖14(B)的光譜，作成激發波長在100～4100cm-1的寬形狀。
圖15(A)～(C)，是表示利用圖14(A)的光散射光譜，測定其移位波數分別為1870cm-1、2125cm-1及2370cm-1位置的光譜強度與試樣中的血紅蛋白濃度的相關關係的結果。
任何相關關係的相關係數R都顯示0.99以上的優良結果。通過利用這些相關關係作為標準曲線，可定量分析試樣中的血紅蛋白濃度。
實施例4正常尿的喇曼測定圖16是正常尿的喇曼光譜。1000cm-1附近的峰是來自尿素的，1650cm-1附近及3000～3700cm-1附近的峰是來自作為溶劑的水的。
實施例5使用喇曼分光法定量尿中白蛋白圖17和18，是對於正常尿進行白蛋白的增量試驗的結果。圖17是表示在正常尿中，將白蛋白增量約15mg/ml的試樣的光譜。由於尿中存在的多個成分以不同的濃度而存在，所以成為複合的光譜。圖18表示研究該光譜的2370cm-1的強度與濃度的相關關係的結果。
實施例6使用喇曼分光法的尿中葡萄糖的定量圖19及圖20是對於正常尿進行葡萄糖增量試驗的結果。圖19是表示對於正常尿將葡萄糖增量到飽和的試樣的光譜。圖20是研究該光譜波數0～4000cm-1的喇曼光譜強度與濃度的相關關係的結果。
實施例7使用喇曼分光法的尿中尿素的定量圖21及圖22是對於正常尿進行尿素的增量試驗的結果。圖21是表示對於正常尿，將尿素增量300mg/ml的試樣的光譜。圖22是研究該光譜的1008cm-1強度與濃度的相關關係的結果。
實施例8使用喇曼分光法的尿中丙酮的定量圖23及24是對於正常尿，進行丙酮增量試驗的結果。圖23是表示對於正常尿進行丙酮增量60％(V/V)的試樣的光譜。圖24是研究該光譜1080cm-1的強度與濃度的相關關係的結果。
實施例9使用喇曼分光法的尿中丙酮、尿素及葡萄糖的同時定量圖25～27是對於正常尿，分別以不同濃度添加丙酮、尿素及葡萄糖進行測定的結果。圖25是對於正常尿，添加丙酮達37.5％(V/V)的試樣的光譜。圖26是對於正常尿，添加丙酮為17％(V/V)、尿素為25mg/ml、葡萄糖為416μg/ml的試樣的光譜，圖27是添加丙酮為17％(V/V)、尿素為50mg/ml、葡萄糖為1.17mg/ml的試樣光譜。
圖28～圖33是關於尿素在1008cm-1、1063cm-1、1168cm-1、531cm-1、597cm-1及1613cm-1的波數位置上，喇曼光譜強度與濃度的相關結果。
另外，圖34～37，是關於丙酮在805cm-1、1237cm-1、1429cm-1及2941cm-1的波數位置，同樣地取得相關結果，圖38是關於葡萄糖在2924cm-1的波數位置，同樣地取得相關結果。任何一個相關係數R都是0.9以上，得到了優良的結果。
實施例10使用喇曼分光法的尿中蛋白及乙醯醋酸鋰的同時定量圖39～41是對於正常尿，分別以不同濃度添加白蛋白及乙醯醋酸鋰進行測定的結果。圖39是添加白蛋白為0.66mg/ml、乙醯醋酸鋰為1.4mg/ml的試樣的光譜。
圖40是研究關於白蛋白的620cm-1的強度與濃度的相關關係的結果。
另外，圖41是研究關於乙醯醋酸鋰在829cm-1的強度與濃度相關關係的結果。任何一個相關係數R都是0.9以上，得到了優良結果。
實施例11使用喇曼分光法的尿中尿膽素及雙牛膽紅素的同時定量圖42～44是對於正常尿，分別以不同濃度添加尿膽素及雙牛膽紅素，進行測定的結果。圖42是將尿膽素添加到0.13mg/ml、將雙牛膽紅素添加到0.286mg/ml的試樣的光譜。
圖43是研究關於尿膽素，2370cm-1的強度與濃度的相關關係的結果。另外，圖44是研究關於雙牛膽紅素，1263cm-1的強度與濃度的相關關係的結果。任何一個的相關係數都是0.9以上，得到優良的結果。
實施例12使用喇曼分光法的尿中成分的檢出圖45～50是對於正常尿，分別添加乙醯醋酸鋰(13.3mg/ml)、β-羥基丁酸(16％，V/V)、球蛋白(30mg/ml)、血紅蛋白(30mg/ml)、雙牛膽紅素(0.3mg/ml)、亞硝酸鈉(55.28mg/ml)，進行測定的結果。
確認任意峰的強度變化，可確認其是否存在。例如，對於圖45的乙醯醋酸鋰，在829cm-1時，出現正常尿光譜得不到的喇曼峰。由此，可確認乙醯醋酸鋰的存在。同樣，只要確認分別出現在圖46的β-羥基丁酸的1630cm-1的峰、特別是圖47的球蛋白的852cm-1的峰、圖48的血紅蛋白時的1592cm-1的峰、圖49的雙牛膽紅素時的1616cm-1的峰、圖50的亞硝酸鈉時的813cm-1的峰，就可確認其是否存在。
實施例13使用喇曼分光法的體液中成分的檢出圖51～62是對於蒸餾水，將尿酸、葉酸、L-抗壞血酸、維生素B2、肌酸1水合物、肌酸酐、α-澱粉酶、β-澱粉酶分別添加到飽和量、氨添加到25％(V/V)、肌醇、半乳糖、果糖，分別添加到飽和量，進行測定的結果。
與實施例12相同，確認任意的峰的強度變化可確認其是否存在。通過分別確認對於圖51的尿酸，出現670cm-1的峰、對於圖52的葉酸，出現661cm-1的峰、對於圖53的抗壞血酸，出現1703cm-1的峰、對於圖54的維生素B2，出現890cm-1的峰、對於圖55的肌酸1水合物，出現830cm-1的峰、對於圖56的肌酸酐，出現695cm-1的峰、對於圖57的α-澱粉酶出現1864cm-1的峰、對於圖58的β-澱粉酶，出現898cm-1的峰、對於圖59的氨，出現3407cm-1的峰、對於圖60的肌醇，出現443cm-1的峰、對於圖61的半乳糖，出現495cm-1的峰、對於圖62的果糖，出現599cm-1的峰，可確認其是否存在。
圖63是表示各成分的測定波數的圖表。選擇用虛線圍起來的波數位置，可以避免峰的重複、混合。另外，只要在測定總蛋白量時選擇2370cm-1附近、測定總酮體時選擇2940cm-1附近進行測定，就可以。
另外，如圖64所示，對於任何種被測定物質，所得到的相關係數列於一覽表中，可確認本發明的精度。
使用多變量回歸分析等的解釋方法，可進一步精確地進行測定。
實施例14使用多變量回歸分析的尿中多種成分的同時測定在正常尿中，分別以任意組合添加尿素150mg/dl、300mg/dl、450mg/dl，添加亞硝酸鈉600mg/dl、1.2g/dl、1.8mg/dl，添加丙酮300mg/dl、600mg/dl、900mg/dl，進行光譜測定，用多變量回歸分析，進行濃度的定量。
尿中存在的任意物質濃度C，可用下式近似計算。C=i=1nk(i)A(i)]]>K(λi)波數λi時的比例常數A(λi)波數λi時的喇曼光強度K(λi)是在多變量回歸分析的步驟中決定的以使與分析值已知試樣的濃度、與推定濃度的相關係數保持最高。此外，這種計算是預先存貯在市售的處理用軟體中後自動進行的，對於每次要得到濃度的尿中物質，適用此公式。
按照圖54的流程圖進行從光譜測定到濃度定量的處理。本例中，不進行一切前處理，作為處理用的軟體是使用パ-キンエルマ社的QUANT+。作為處理方法，採用PCR法。另外在進行全面評價時，可以省去對校正模型精度的評價。
圖65是本例中得到的計算值與實測值(參照值)的相關圖，相關係數R和SEP對於尿素是0.986和18.13、對於亞硝酸鈉是0.992和57.17、對於丙酮是0.956和69.74。其中SEP是預測標準偏差，用以下計算式算出SEP=i=1n(di-D)2/(n-1)2]]>di用校正模型的計算值與實測值之差Ddi的平均值n評價用試樣的數SEP值小的表示校準模型的精度高。
權利要求
1.蛋白質的測定方法，其特徵是在含有蛋白質的試樣溶液中照射單一波長的激發光，接受來自該試樣溶液的散射光，分光後得到散射光譜，在該散射光譜中，相對於激發波長的偏移波數來說，使用100～3100cm-1的光譜波峰強度或其中適當範圍的積分值定量測定蛋白質。
2.根據權利要求1的蛋白質的測定方法，其中的蛋白質是白蛋白，使用從激發波長偏移到810～840cm-1的光譜波峰強度或者從激發波長632.8nm偏移到256～1620cm-1或從激發波長514.5nm偏移到837～3060cm-1的光譜的適當範圍的積分值。
3.根據權利要求1的蛋白質的測定方法，其中的蛋白質是γ-球蛋白，使用從激發波長偏移到175～195cm-1、425～450cm-1、640～670cm-1、820～845cm-1、1370～1400cm-1、1575～1620cm-1、1850～1900cm-1、2000～2200cm-1、2350～2400cm-1或2400～2460cm-1的光譜波峰強度。
4.根據權利要求1的蛋白質的測定方法，其中的蛋白質是血紅蛋白，使用從激發波長偏移到640～670cm-1、820～845cm-1、1370～1400cm-1、1575～1620cm-1、1850～1900cm-1、2000～2200cm-1、2350～2400cm-1或2400～2460cm-1的光譜波峰強度。
5.測定方法，其特徵是對於要測定的體液中的各成分，預先選擇該成分濃度與喇曼散射光譜強度相關良好的波數作為該成分固有的測定波數，對於體液試樣照射激發光，測定將要測定各成分的各個測定波數下的喇曼散射光譜強度或各個測定波數範圍的喇曼散射光譜累積強度，對於各成分，利用對各個測定波數下的喇曼散射光譜強度或各個測定波數範圍的喇曼散射光譜累積強度與該成分的濃度預先作成的標準曲線，同時定性、定量地分析體液中的各成分。
6.根據權利要求5的測定方法，其特徵是通過多變量回歸分析，同時定性、定量地分析體液試樣中的多種成分。
7.根據權利要求5所述的測定方法，其特徵是它是在權利要求1或2所記載的各成分濃度與喇曼散射光譜強度良好的波數是相關係數R為0.8以上、優選的是0.9以上的波數的方法，其中相關係數R是用下式計算出的值R=i=1n{(xi-X)(yi-Y)}[i=1n(xi-X)2][i=1n(yi-Y)2]]]>xi體液中成分的各點濃度yi對於xi的喇曼散射光譜強度X體液中成分的各點濃度平均值Y喇曼散射光譜強度的平均值
8.根據權利要求5的測定方法，其特徵是作為要測定的體液成分，含有白蛋白、球蛋白、血紅蛋白、葡萄糖、乙醯醋酸鋰、β-羥基丁酸、丙酮、雙牛膽紅素、尿膽素、亞硝酸鈉、尿素、尿酸、葉酸、抗壞血酸、維生素B2、肌酸1水合物、肌酸酐、α-澱粉酶、β-澱粉酶及氨中的至少一種成分，各成分測定的波數或測定的波數範圍如下對於白蛋白從590～650cm-1附近、800～860cm-1附近、2342～2402cm-1附近選擇；對於球蛋白從158～218cm-1附近、402～462cm-1附近、623～683cm-1附近、807～867cm-1附近、822～862cm-1附近、1353～1413cm-1附近、1562～1622cm-1附近、1847～1907cm-1附近、2095～2155cm-1附近、2340～2400cm-1附近、2403～2463cm-1附近選擇、對於血紅蛋白從807～867cm-1附近、893～953cm-1附近、1353～1413cm-1附近、1562～1622cm-1附近、1840～1900cm-1附近、2095～2155cm-1附近、2340～2400cm-1附近、2403～2463cm-1附近選擇；對於葡萄糖從200～554cm-1附近、810～944cm-1附近、2590～2940cm-1附近選擇；對於乙醯醋酸鋰從799～859cm-1附近、1353～1413cm-1附近、1840～1900cm-1附近、2347～2407cm-1附近、2907～2967cm-1附近選擇；對於β-羥基丁酸從1420～1480cm-1附近、1557～1617cm-1附近、1600～1660cm-1附近、2870～2971cm-1附近選擇；對於丙酮從775～845cm-1附近、1050～1110cm-1附近、1207～1267cm-1附近、1399～1459cm-1附近、1680～1740cm-1附近、2911～2971cm-1附近選擇；對於雙牛膽紅素從927～987cm-1附近、1233～1293cm-1附近、1586～1616cm-1附近選擇；對於尿膽素從332～2900cm-1的任意位置選擇；對於亞硝酸鈉，從783～843cm-1附近、1318～1378cm-1附近選擇；對於尿素從501～561cm-1附近、567～627cm-1附近、978～1048cm-1附近、1033～1093cm-1附近、1138～1198cm-1附近、1583～1643cm-1附近選擇；對於尿酸從640～700cm-1附近選擇；對於葉酸從631～691cm-1附近、816～876cm-1附近、901～961cm-1附近、1355～1415cm-1附近、1562～1622cm-1附近、1847～1907cm-1附近、2093～2153cm-1附近、2339～2399cm-1附近、2400～2460cm-1附近選擇；對於抗壞血酸從800～860cm-1附近、1673～1733cm-1附近、2919～2979cm-1附近選擇；對於維生素B2從404～464cm-1附近、626～686cm-1附近、798～858cm-1附近、860～920cm-1附近、1317～1377cm-1附近、1546～1606cm-1附近、1834～1894cm-1附近、2106～2166cm-1附近、2360～2420cm-1附近、2419～2479cm-1附近選擇；對於肌酸1水合物從800～860cm-1附近、1563～1623cm-1附近選擇；對於肌酸肝從538～598cm-1附近、580～640cm-1附近、665～725cm-1附近、817～877cm-1附近、868～928cm-1附近、1021～1081cm-1附近、1550～1610cm-1附近、2868～2900cm-1附近、2900～2950cm-1附近、2950～2996cm-1附近選擇；對於α-澱粉酶從393～453cm-1附近、631～691cm-1附近、792～852cm-1附近、868～928cm-1附近、1333～1393cm-1附近、1546～1606cm-1附近、1834～1894cm-1附近、2334～2394cm-1附近選擇；對於β-澱粉酶從376～436cm-1附近、622～682cm-1附近、783～843cm-1附近、868～928cm-1附近、1334～1394cm-1附近、1546～1606cm-1附近、1834～1894cm-1附近、2665～2725cm-1附近選擇；對於氨從3190～3250cm-1附近、3292～3350cm-1附近、3377～3437cm-1附近選擇；對於肌醇從404～464cm-1附近、805～865cm-1附近、1014～1074cm-1附近、1438～1498cm-1附近、2966～3026cm-1附近選擇；對於半乳糖從466～526cm-1附近、835、895cm-1附近、1032～1092cm-1附近、1237～1297cm-1附近、1332～1392cm-1附近、1438～1498cm-1附近、2946～3006cm-1附近選擇；對於果糖從569～629cm-1附近、772～832cm-1附近、1044～1106cm-1附近、1237～1297cm-1附近、1438～1498cm-1附近、2966～2996cm-1附近選擇。
9.測定方法，其特徵是對體液照射激發光，測定預先選擇任意波數範圍的多個波數下的喇曼散射光譜強度，用多變量回歸分析同時定性、定量分析體液試樣中的多種成分。
全文摘要
對於含有蛋白質的試樣溶液5，照射來自光源22的單一波長的激發光，接受來自該試樣溶液5的散射光，用分光器52分光後，得到光散射光譜。該散射光譜中，相對於激發波長的偏移波數來說，使用100～3100cm
文檔編號G01N21/64GK1157919SQ9610865
公開日1997年8月27日 申請日期1996年6月28日 優先權日1995年6月28日
發明者K·王, 竇曉鳴 申請人:株式會社京都第一科學