一種檢測酒精中毒和酒精成癮易感性的試劑盒的製作方法

2023-12-09 08:52:31 1

專利名稱：一種檢測酒精中毒和酒精成癮易感性的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其是一種檢測酒精中毒和酒精成癮易感性的試劑盒， 通過檢測乙酵脫氫酶2基因(aldehyde dehydrogenase 2 family, ALDH2)的單核苷酸多態性(SNP)位點 來預測個體對酒精中毒和酒精成癮的易感性。
背景技術：
飲酒是人類重要的生活方式之一。當一次飲入過量的酒精或酒類飲料，引起的中樞神經系統由興奮轉 為抑制的狀態，稱為酒精中毒或乙醇中毒。
酒精中毒會對中樞神經系統產生抑制作用，引起昏睡和昏迷，極高濃度乙醇抑制延腦中樞會引起呼吸、 循環功能衰竭。另外乙醇在肝細胞內代謝生成大量還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),使之與氧化型的 比值(NADH/NAD)增高，甚至可髙達正常的2 3倍。相繼可發生如乳酸增高、酮體蓄積導致的代謝性酸中 毒；糖異生受阻後可出現低血糖。
酒精成癮會造成飲酒後產生輕鬆、興奮的欣快感。繼續飲酒後，產生耐受性，需要增加飲酒量才能達 到原有的效果。同時會造成對酒精的心理依賴和軀體依賴為了獲得飲酒後的特殊快感，渴望飲酒，這是 心理依賴，軀體依賴是指反覆飲酒使中樞神經系統發生了某種生理、生化變化，以致需要乙醇持續地存在 於體內，以避免發生特殊的稱之為戒斷症候群的病徵。長期大量飲酒時進食減少，可造成明顯的營養缺乏。 同時乙醇對黏膜和腺體分泌有刺激作用，可引起食管炎、胃炎、胰腺炎。乙醇在體內代謝過程中產生自由 基，可引起細胞膜脂質過氧化，造成肝細胞壞死，肝功能異常。
ALDH2為aldehyde dehydrogenase 2 family (mitochondrial)(乙醛脫氫酶2，線粒體乙醛脫氨酶) 編碼基因，主要功能是在肝臟內將乙醇代謝產物乙醛進一步脫氫成為乙酸，進入外周組織的三羧酸循環， 分解產生C02和水。該基因的缺陷或活性下降會導致大量飲酒後體內的乙醛無法被及時代謝，從而導致一 系列對肝臟、血管、中樞神經系統的損傷。該基因的缺陷型在東亞人群包括中國、韓國、日本具有廣泛 的分布，帶有這類基因型的個體通常更容易發生酒精中毒，而較少發生酒精成癮和因此而引起的酒精性疾 病。SNP(single nucleotide polymorphism),即單核苷酸多態性標記，是一類基於單鹼基變異引起的DNA 多態性，被遺傳學界稱為第三代遺傳標記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態性， 包括單鹼基轉換、顛換，以及單鹼基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的一類多態性標記，佔 大約90%。這些基因組序列變異可以導致個體間表型的差異以及不同個體對疾病，特別是複雜疾病的易感 性、和對環境因素、藥物反應的差異。
關於中國人群關聯分析均一致表明，ALDH2缺陷基因型與飲酒不適，酒後臉紅相關。國內外大樣本研 究均表明ALDH2基因上的rs671號SNP位點(SEQ ID NO: 1所示序列中第161位)基因型與ALDH2基因發 生缺陷有顯著關係，rs671號SNP位點是位於第十二號染色體上ALDH2基因上的一個G/A多態，引起ALDH2 基因編碼的蛋白第504個胺基酸由Arg(R)變為Lys(K)。低頻等位基因型A編碼的蛋白活性較低，對乙醛 代謝的能力下降，引起飲酒的不適感，臉紅綜合症等，容易導致酒精中毒。另外一方面，低頻等位基因型 A攜帶者由於飲酒的不適感使得該種人不易酒精成癮，酒精性疾病反而減少。
因此ALDH2基因上的rs671號SNP位點的多態性可用於評估個體對酒精中毒和酒精成癮的易感性，目 前已通過中國科學院國家生物基因檢測技術應用評估認證中心的認證。

發明內容
基於ALDH2基因上的rs671號SNP位點的多態性可用於評估個體對酒精中毒和酒精成癮的易感性的基 礎上，本發明提供一種檢測酒精中毒和酒精成癮易感性的試劑盒。
該試劑盒包括檢測ALDH2基因SEQ ID NO: 1中第161位SNP位點基因型的特異性引tl對及特異性
螢光探針、TaQ醸、dNTP混合液、MgCl2溶液、螢光定量PCR反應緩衝液、去離子水。
本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對SEQ ID NO: 1中第161位SNP位點而設計，能特異性擴增 出包含SEQ ID NO: 1中第161位SNP位點的DNA片段的引物對。設計這類引物對是本領域技術人員能夠 輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物對。特異性引物對可用常規 的合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的引物不限於這一對引物。
本試劑盒中所述的特異性螢光探針是指針對SEQ ID NO: 1中第161位SNP位點而設計，能通過螢光 定量PCR技術特異性檢測出這個SNP位點酒精中毒易感基因型的探針。設計這類探針是本領域技術人員能 夠輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 4所示序列的T叫man探針。特異性螢光探針可用 常規的合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的特異性螢光探針不限於這一條探針，所 有可用於螢光定量PCR檢測SEQ ID NO: 1中第161位SNP位點基因型的探針均在本發明範圍內。
本發明試劑盒的組分和含量包括 ljxl 10 X螢光定量PCR反應緩衝液， 0.1^1 25mM dNTP混合液， 0.5nl 25mM MgCl2溶液， 0.02nl (5units/nl) Taq DNA聚合酶， 20nM特異性引物對各0. 225^1, l(HiM特異性螢光探針O. 25nl, 去離子水5. 68fd。
本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規 條件，或按照廠商所建議的條件。
實施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用矽膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。 步驟2:螢光定量PCR反應
使用可檢測酒精中毒和酒精成癮易感性的螢光定量PCR檢測試劑盒，其中，含有下列引物對和螢光探
針
有義引物5' - TTTGGTGGCTACMGATGT -3， (SEQ ID NO: 2) Tm值為 54*C
反義引物5， - CTCCGAGCCACCAGCA -3' (SEQ ID NO: 3) Tm值為54°C
螢光操針5， - GCTGCAGGCATACACTAMGT -3， (SEQ ID NO: 4) Tm值為62'C
螢光定量PCR反應體系為總體積10nl，包含濃度為20ng/nl的DM模板2^1、 1 pi 10 X螢光定量PCR 反應緩衝液、0. lul 25mM dNTP混合液、0.5^1 25raM MgCl2溶液、0.02^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20nM的有義引物0.225^1、 20nM的反義引物0.225nl、 10jxM的螢光探針0. 25^x1,去離子水5.68pl。
在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為5(TC、 2分鐘，95'C、 10分鐘，進行60個循環的 95'C、 30秒，60'C、 l分鐘。反應結束後在ABI7900型螢光定量PCR儀上讀取樣品螢光量。
步驟3: SNP基因型分析
將螢光定量PCR儀上顯示的最終樣品螢光量和正常對照相對比，螢光探針最終的螢光信號明顯高於正 常對照，說明被檢測DNA的ALDH2基因上的rs671號SNP位點基因攜帶有A型，為酒精中毐易感型，同時
也是酒精成癮不易感型。
實施例2.指導人們主動預防酒精中毒和酒精成癮的服務 目前在上海主健生物工程有限公司已經開展了這項服務。 步驟l: DNA提取
對被檢測者進行服務前諮詢，由被檢測者籤署知情同意書，填寫飲酒習慣問巻調査表。依照取樣盒中 的指示使用口腔採樣拭進行口腔上皮細胞取樣，採用矽膠吸附法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。
步驟2:基因分型檢測
使用本發明提供的試劑盒，對被檢測者DNA的ALDH2基因上的rs671號SNP位點進行螢光定量PCR檢 測，確定該SNP位點的基因型。
步驟3:指導人們主動預防酒精中毒和酒精成癮
通過對被檢測者SNP基因型的分析，出具基因分型檢測報告和被檢測者個體化健康指導報告。基因檢 測報告詳細說明了被檢測者酒精中毒和酒精成癮易感程度的高低。個體化健康指導報告以被檢測者的基因 分型檢測結果為基礎，結合其飲酒習慣問巻調査結果，評估被檢測者酒精中毒和酒精成癮遺傳易感的相對 風險。同時制定出針對於被檢測者的個性化健康行動方案，方案包括在飲酒習慣、生活方式上的改進建議 等，並為被檢測者普及預防酒精中毒和酒精成癮的健康知識。
序列表
<110〉上海主健生物工程有限公司
<120〉 一種檢測酒精中毒和酒精成癮易感性的試劑盒
4
1 240 <212〉 DNA
<213〉人屬,人種(Homo sapiens, human) 〈400〉 1
gggagtgtaa cccataaccc ccaagagtga tttctgcaat ctcgtttcaa attacagggt 60 caactgctat gatgtgtttg gagcccagtc accctttggt ggctacaaga tgtcggggag 120 tggccgggsg ttgggcgagt acgggctgcs ggcatacact gaagtg3aaa ctgtgagtgt 180 gggscctgct gggggctcag ggcctgttgg ggcttg鄉g tctgctggtg gctcggeigcc 240
<210〉 2 19 ■ 人工序列

<223〉引物 <400〉 2
tttggtggct acaag8tgt 19
〈210〉 3 16 <212〉 DNA 人工序列

<223〉引物 ■〉 3
ctccgagcca ccagca 16
<210〉 4 21 <212〉 DNA 人工序列

探針 4
gctgcaggca tacactaaag t 2權利要求
1.一種檢測酒精中毒和酒精成癮易感性的試劑盒，包括檢測ALDH2基因SEQ ID NO1中第161位SNP的特異性引物對及特異性螢光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、螢光定量PCR反應緩衝液、去離子水。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的特異性引物對是指針對SEQIDNO: 1中第161 位SNP位點而設計，能特異性擴增出包含SEQ ID NO: 1中第161位SNP位點的DNA片段的引物對。
3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的特異性螢光探針是指針對SEQ ID NO: l中第 161位SNP位點而設計，能通過螢光定量PCR技術特異性檢測出這個SNP位點酒精中毒易感基因型的探針。
4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所含的特異性引物對選自具有SEQ ID NO: 2和3所 示序列的引物對。
5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所含的特異性螢光探針選自具有SEQ IDNO: 4所示 序列的Taqman探針。
6. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於試劑盒的組分和含量包括lul 10 X螢光定量PCR反 應緩衝液，0. lpl 25mM dNTP揮合液，0. 5^1 25raM MgCL溶液，0. 02^1 (5units/jil) Taq DNA聚合酶， 20jiM特異性引物對各0.225nl， 10nM特異性螢光探針0.25jxl，去離子水5.68fil。本試劑盒供一人份檢測 應用，試劑盒的保存溫度為-20'C。
全文摘要
本發明公開了一種檢測酒精中毒和酒精成癮易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測ALDH2基因SEQ ID NO1中第161位SNP位點基因型的特異性引物對及特異性螢光探針、用於螢光定量PCR檢測的常規組件等。本發明的試劑盒通過檢測分析個體的ALDH2基因上SNP位點基因攜帶型來預測個體對酒精中毒和酒精成癮的易感性。
文檔編號G01N33/68GK101109705SQ20061002920
公開日2008年1月23日 申請日期2006年7月21日 優先權日2006年7月21日
發明者馮哲民, 屹 樓, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司