在疾病治療中作為胞毒劑,藥物預致敏劑和化學致敏劑的透明質酸的製作方法

2023-12-09 02:02:36

專利名稱：在疾病治療中作為胞毒劑,藥物預致敏劑和化學致敏劑的透明質酸的製作方法
技術領域：
本發明涉及增強化療劑的生物利用率以治療疾病。本發明尤其涉及單獨使用透明質酸或與化療劑組合使用以增強化療劑的生物利用率而治療疾病的用途。本發明還涉及治療抗藥性疾病的方法，其中通過單獨使用透明質酸或與化療劑組合使用以克服或減輕抗藥性。
背景技術：
侵害動物包括人類地許多疾病是用化療劑治療的。例如，化療劑在治療腫瘤性疾病包括結締組織或自身免疫性疾病，代謝性疾病，和皮膚病中是有利用價值的，而且這些製劑中有許多是高效的及沒有任何生物利用率的問題。
正確使用化療劑需要在選擇化療劑，確定劑量及進行治療之前，十分熟悉疾病的自然病史和病理生理學情況。對每個患者要進行仔細評價，注意可加強毒性的直接相關因素，如明顯感染或隱性感染，出血惡病質，營養不良，及嚴重代謝紊亂。另外，一些主要器官如肝，腎和骨髓的功能狀態是非常重要的。因此，要根據患者的情況，選擇適當的化療劑和設計一種有效的治療方案。這種考慮影響施用藥物的劑量和劑量。
不幸地，不是所有化療劑均是易於使用的。例如，一些化療劑本身是不應性的，即動物細胞對這些製劑不易應答，而其它化療劑有獲得性抗性。例如，已熟知對長期化療的一些患者要被迫改變化療劑，因為這些化療劑隨著時間而效力降低。然而另外一些不受固有的或獲得的抗性影響的化療劑在治療一些疾病中是無效的，因為它們具有生物利用率的天生的問題。通常受細胞抗性和生物利用率問題同時影響的疾病是癌症。
癌症是西方社會中4種致死原因之一。儘管1990-1994年美國和加拿大的癌症新發率和死亡率降低，但數據表明在1990-1994年美國有2604650人死於癌症，男性(53％)多於女性(47％)。大多數致死的常見癌症是肺癌(728641)，結腸直腸癌(285724)，乳腺癌(218786)，和前列腺癌(169943)。
在女性當中，最常見的癌症是乳腺癌(31％)，肺癌(12％)，結腸直腸癌(12％)，子宮癌(6％)，和卵巢癌(4％)，而乳腺癌和卵巢癌佔女性所有發現的癌症的大約35％。經診斷患有這種形式癌症的女性大多數接受外科手術，放療或化療等組合治療。
用於治療癌症的化療劑基本可以分為幾個主要類別，包括(1)烷化劑，如二氯甲基二乙胺，環磷醯胺，苯丙氨酸氮芥，尿嘧啶芥子，苯丁酸氮芥，二甲磺酸丁酯，卡氮芥，環己亞硝脲，甲環亞硝脲，鏈脲黴素(streptozoticin)和decrabazine；(2)抗代謝物如氨甲喋呤，氟尿嘧啶，氟脫氧尿嘧啶，阿糖胞苷，azarabine，5-碘脫氧尿苷，6-巰基嘌呤，硝基咪唑硫嘌呤，硫鳥嘌呤，和腺嘌呤阿拉伯糖苷；(3)天然產物衍生物如長春花鹼，長春新鹼，更生黴素，道諾黴素，阿黴素，光神黴素，taxanes(例如paclitaxel)，博來黴素，依託泊苷，鬼臼噻吩苷，和絲裂黴素C；和(4)混合製劑如羥基脲，procarbezine，mititane，和順鉑。
已經觀測到具有臨床多元抗藥性的重要的癌症化療劑(常規有效劑量)包括長春花鹼(0.1mg/kg/周)，長春新鹼(0.01mg/kg/周)，依託泊苷(35-50mg/m2/天)，更生黴素(0.15mg/kg/天)，阿黴素(500-600mg/m2/周)，道諾黴素(65-75mg/m2/周)，和光神黴素(0.025mg/kg/天)。
本領域技術人員已充分意識到目前沒有有效的方法克服對化療劑的細胞抗性。更重要的是沒有提高化療劑的生物利用率而不伴隨毒性或副作用提高的實用方法。因此，需要一種克服或至少減輕與獲得性或固有的細胞抗性相關的問題的方法，以及提高化療劑生物利用率的方法。
本申請人先前研究了透明質酸(HA)作為化療的藥物輸送載體的功效，發現HA當與這些藥物聯合施用時是有益的，國際專利申請PCT/AU00/00004覆蓋了這一發明，在此以其全文併入參考。HA，也稱為透明質酸，是一種包含線性鏈聚合物的天然發生的多糖，發現其遍布於動物王國中。HA是高度水溶性的，是生物系統的一種理想的藥物輸送載體。
在國際專利申請PCT/AU00/00004申請之後，本申請人驚奇地發現可單獨施用HA發揮作用。發現HA對人乳腺癌細胞，以及預致敏細胞可發揮胞毒作用，使它們對化療劑更敏感。本發明因此提供了可有效處理對化療劑有抗性或變得有抗性的細胞的方法。更重要地，通過使用本發明揭示的方法，可降低化療劑的劑量而不降低對患者的效力。本發明的方法包括單獨施用透明質酸或與化療劑結合施用。
本發明基於發現透明質酸，其衍生物，類似物及鹽不僅抑制細胞，而且還可在標準劑量或據認為效力較低的低劑量安全施用所選擇的化療劑，進行治療患者包括病人。在體內組合化療劑施用透明質酸，還可增強這些製劑對不應細胞的治療作用，因此預防隨後出現的多元抗藥性。
病變的細胞如癌細胞通常具有由於膜電壓改變而更通透的膜，或受體狀態提高，這可改變其胞內分子轉運規則，導致細胞膨脹(Lang等，1993)。儘管本申請人不希望被任何假定的理論所束縛，但其中有一些機制可解釋HA作為單獨藥劑，及作為預處理化療劑所發揮的細胞作用
1)當HA與CD44，RHAMM和結合的清除劑受體結合時，HA
的淨負電荷改變細胞膜電壓，導致細胞通透性提高，接著使
藥物更順利地流入病變的細胞。
2)當HA與病變的細胞如腫瘤細胞結合併內在化時，可以有高
滲效應導致細胞裂解。
3)HA可引起氧化性膜損害作用導致編程性細胞死亡。
4)HA內在化可升高線粒體膜電壓，導致細胞死亡或提高藥物
的保持力。
由於HA是在飽和水平施用的，因此糖胺聚糖的內在化是恆定的，這意味著在HA的容量結構域中是平衡的任何治療劑被共同內在化，導致藥物在細胞內濃縮釋放。發明概述
本發明的最寬方面是提供一種治療需要治療的患者的方法，包括給所述患者施用與化療劑結合的治療有效量的透明質酸，由此所述化療劑比單獨施用更有效。
本發明還提供了一種增強化療劑的生物利用率的方法，包括給需要治療的患者施用治療有效量的透明質酸。
透明質酸可用於明顯增強任何施用的化療劑的生物利用率。優選地，施用的化療劑選自卡氮芥(BCNU)，苯丁酸氮芥(Leukeran)，順鉑(Platinol)，阿糖胞苷，阿黴素(Adriamycin)，氟尿嘧啶(5-FU)，氨甲喋呤(Mexate)，CPT111，依託泊苷，普卡黴素(Mithracin)，和taxanes如紫杉醇。
在另一實施方案中，本發明提供了一種治療或預防多元抗藥性或抗藥性細胞的方法，包括在施用化療劑之前，同時或之後，施用治療有效量的透明質酸。
如以下更詳細的論述，施用透明質酸和化療劑使腫瘤生長抑制至少50％，優選60％，更優選70％以上。因此，消除腫瘤生長和增殖可消除多元抗藥性細胞產生，降低癌症的復發及提高化療法的效力。
本發明還提供了一種用以提高細胞對化療劑的敏感性的包含透明質酸的藥物組合物。透明質酸和/或化療劑也可與另外的藥物載體一起施用。
本發明還提供了一種治療癌細胞的方法，包括為需要治療的患者施用治療有效量的透明質酸。
典型地，所述癌細胞是對化療藥物有抗性的癌細胞。
本發明的另一方面提供了一種克服細胞抗性的方法，包括施用治療有效量的HA。
在本申請的闡述和權利要求中，術語「包括」意為「包括但非限於」，及不排外其它添加物，組成成分，整數或步驟。附圖簡述


圖1示出暴露於750000道爾頓的HA 24小時的指數生長的乳腺癌細胞，在此階段對細胞進行照相。注意到在10ng/ml，細胞數減少，但形態學無差異。在100ng/ml和1μg/ml，上部細胞呈現滲透壓應答，表現出細胞膨脹。在2mg/ml和5mg/ml，細胞變為粒狀，質膜「有凹痕」，可能表示滲透壓應答和/或細胞死亡的開始。
圖2a-2f示出暴露於750000道爾頓的HA 30分鐘，1小時或24小時的指數生長的乳腺癌細胞，在此階段細胞用不同濃度阿黴素處理。這些圖還示出HA/藥物共溫育1或3天的效果。這些圖示出HA可使細胞對治療藥物「預致敏」和/或化學致敏。
圖3a-3d示出暴露於750000道爾頓的HA 1小時，24小時，或3天後，接著用40nM阿黴素處理1小時，24小時或3天的指數生長的乳腺癌細胞。這些圖表示出寬範圍濃度的透明質酸可作為化學致敏劑或發揮胞毒作用。
圖4示出在6周的研究期間沒有治療毒性。與用5-FU處理組相對比，證明接受HA治療的小鼠(HA作為唯一藥劑或作為化學致敏劑)表現良好，動物不喪失體重而是保持體重。
圖5示出在6周研究末，確定腫瘤質量，經HA化學致敏治療組的腫瘤明顯小於鹽水組，HA和5-FU組(p＝0.005)。通過與鹽水對照組相比原發腫瘤塊縮小，也證明HA作為唯一藥劑的效力。在開始處理的2周內，腫瘤應答無明顯不同，但之後通過HA及隨後的5-FU處理，腫瘤生長與其它方式處理的對照組相比延遲。在6周的處理期間，在腫瘤倍增周期數中注意到令人感興趣的差異。接受鹽水處理的小鼠經歷平均4次腫瘤倍增，而將HA摻入治療方案中明顯提高腫瘤倍增時間，其中HA/5-FU處理的動物經歷平均1次腫瘤倍增循環，再一次顯著表明HA對5-FU胞毒性的作用。
圖6示出共同施用HA導致非淋巴性轉移明顯降低。除了接受HA治療的小鼠之外，在原發腫瘤鄰近部位的頸部或腋下周圍觀測到新發腫瘤。發明詳述
本發明方法和組合物能用於增加細胞對化療劑如抗癌劑如紫杉醇、止痛劑、鴉片劑、激素或抗生素等的敏感性。本發明的方法和組合物特別可用於增加與細胞增生疾病(如贅生物)相關的細胞的敏感性。通過增加效力而無伴隨的對非癌細胞的毒性，本發明提供了可用於治療腫瘤和預防或降低復發和由於胞毒性所致的死亡的復發和組合物。另外，本發明通過在誘導多元抗藥性表型的任何突變出現之前消除癌細胞而消除或降低了多元抗藥性細胞數。因此，通過降低多元抗藥性細胞的出現，本發明令人滿意地克服了目前的治療形式中存在的問題。
本文所用術語「患者」是指具有需要用化療劑治療的疾病或病理狀態的任何動物，其中化療劑的效力相對於所需治療效力降低。優選地，患者患有細胞增生性疾病(例如贅生性疾病)。本發明的患者包括哺乳動物(例如牛，狗，馬，貓，豬)，優選人。
「細胞增生性疾病」是指細胞不正常生長，典型地異常生長，產生贅生物，腫瘤或癌症。
細胞增生性疾病包括例如乳腺，肺，前列腺，腎，皮膚，神經系統，卵巢，子宮，肝，胰腺，上皮細胞，胃，小腸，外分泌腺，內分泌腺，淋巴，造血系統或頭頸部組織的癌症。
通常地，贅生性疾病是這樣一種病態，其中細胞異常增殖產生稱為贅生物或腫瘤的組織塊。贅生物在結構和性質中有不同程度的差異。一些贅生物是良性的，而其它是惡性或癌性的。一種有效治療贅生性疾病的方法被認為是對研究癌症預防或治療方法有益的。
本發明的方法包括一個實施方案，(1)在施用化療劑之前，同時或隨後施用透明質酸；或(2)組合施用透明質酸和化療劑。
本文所用術語「治療有效量」是指有效產生所需治療效果的本發明的化合物的數量。例如在宿主中預防癌症或治療癌症症候群的數量或有效治療癌症的數量。
具體的「治療有效量」明顯地可由於這樣一些因素而變化，如正在治療的特定病理狀態，患者的物理狀態，治療的哺乳動物類型，治療持續時間，協同治療的性質(如果有)，和應用的特異配方，和化合物或其衍生物的結構。
本文所用「藥物載體」是將透明質酸和/或化療劑輸送至動物或人體的一種藥物合適的溶劑，懸浮劑或運載體。此載體可以是液體或固體，而且是根據計劃的施用方式選擇的。
本文所用術語「癌症」是指在哺乳動物中發現的所有類型的癌或贅生物或惡性腫瘤。癌包括肉瘤，淋巴瘤和其它癌。例如但非限於以下這些特殊類型的癌症前列腺癌，結腸癌，乳腺癌，MX-1和MCF細胞系癌，胰腺癌，成神經細胞瘤，橫紋肌肉瘤，home，肺癌，小鼠，黑素瘤，白血病，胰腺癌，黑素瘤，卵巢癌，腦癌，頭頸部癌，腎癌，間皮瘤，肉瘤，Kaposi’s肉瘤，胃癌和子宮癌。
本文所用術語「細胞」包括但非限於哺乳動物細胞(例如小鼠細胞，大鼠細胞或人體細胞)。
透明質酸和/或化療劑可以以含有常規非毒性藥物合適的載體，佐劑和運載體的劑量單位配方，經口服，局部或非腸道施用。本文所用術語非腸道包括皮下注射，氣霧劑，靜脈內，肌內，鞘內，顱內，胸骨內注射或輸注方法。
本發明還提供了用於本發明的新治療方法中的適當的局部，口服和非腸道藥物配方。本發明的化合物可以以片劑，水性或油性懸浮液，錠劑，糖錠，粉末，粒劑，乳劑，膠囊，糖漿或酏劑口服施用。口服的組合物可含有一或多種選自甜味劑，香味劑，色素和防腐劑的製劑，以產生一流的和口味好的藥物製品。片劑含有活性配料，與適於生產片劑的無毒藥物學可接受賦形劑混合。
這些賦形劑例如可以是(1)惰性稀釋劑，如碳酸鈣，乳糖，磷酸鈣或磷酸鈉；(2)成粒劑和崩解劑如穀物澱粉或藻酸；(3)粘合劑如澱粉，明膠或阿拉伯樹膠；和(4)潤滑劑如硬脂酸鎂，硬脂酸或滑石。這些片劑可以不包衣或通過已知方法包衣，以在胃腸道中延遲崩解和吸收，從而提供較長期的緩釋作用。例如，可應用延時物質如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。也可用美國專利No.4256108；4160452；和4265874所述的方法進行包衣，形成滲透壓治療片劑以控制釋放。
用於本發明方法中的透明質酸以及化療劑可在體內單獨或一起經非腸道注射或逐漸灌注而施用。可以經靜脈內，腹膜內，肌內，皮下，腔內或皮內注射施用。為進行體外研究，可將製劑加入或溶解於適當的生物學合適的緩衝液中，及加入細胞或組織中。
非腸道施用的製品包括無菌水溶液或非水溶液，懸浮液或乳劑。非水溶液溶劑例如是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，和可注射有機酯如油酸乙酯。水溶液載體包括水，乙醇水溶液，乳狀液或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。非腸道運載體包括氯化鈉溶液，Ringer’s葡萄糖溶液，葡萄糖和氯化鈉溶液，乳酸化的Ringer’s靜脈內運載體包括流質和營養補充物，電解質補充物(如基於Ringer’s葡萄糖液的那些補充物)等等。也可存在防腐劑和其它添加物，如抗微生物劑，抗氧化劑，螯合劑，生長因子和惰性氣體等等。
可以預想本發明可用於治療病理學相關的細胞增生性疾病，包括例如贅生物，癌(例如乳腺，肺，前列腺，腎，皮膚，神經系統，卵巢，子宮，肝，胰腺，上皮，胃，小腸，外分泌腺，內分泌腺，淋巴，造血系統或頭頸部組織的癌症)，纖維化疾病等。
本發明的方法和化合物也可用於治療與化療法相關的其它疾病，如神經變性疾病，激素失調等。因此，本發明涵蓋了改善與細胞增殖，腫瘤，癌等相關的疾病狀況的方法，包括在患病部位用足以抑制或改善細胞增殖或相關疾病的數量的透明質酸和化療劑治療患者。一般地，本文所用術語「治療」，「療法」等是指作用於對象，組織或細胞，以獲得所需的藥理和/或生理學作用。此作用可以預防性的，完全或部分預防細胞增生性疾病或跡象或症狀，和/或可以是治療性的，部分或完全治療歸因於例如異常細胞增殖的疾病，和/或副作用。所用術語「治療」涵蓋了在脊椎動物，哺乳動物尤其人體中對細胞增生性疾病的任何治療或預防，包括(a)在有患病傾向但還未診斷的對象中預防疾病發生；(b)抑制疾病，即阻止其發展；或(c)緩解或改善疾病，即使疾病消退。
本發明包括用於改善細胞增生性疾病的各種藥物組合物，所述疾病包括腫瘤，癌等。本發明的藥物組合物是通過將透明質酸，其類似物，衍生物或其鹽和一或多種化療劑，或透明質酸和一或多種化療劑的組合，用載體，賦形劑和添加劑或輔助劑形成適於施用於患者的形式而製備。通常使用的載體或輔助劑包括碳酸鎂，二氧化鈦，乳糖，甘露醇和其它糖，滑石，乳蛋白，明膠，澱粉，維生素，纖維素及其衍生物，動物和植物油，聚乙二醇和溶劑，如無菌水，乙醇，甘油和多元醇。靜脈內載體包括流質和營養補充物。防腐劑包括抗微生物劑，抗氧化劑，螯合劑和惰性氣體。其它藥物合適的載體包括水相溶液，無毒賦形劑，包括鹽，防腐劑，緩衝液等，例如Remington’s藥物科學，第15版，EastonMack出版公司，1405-1412，1461-1487(1975)，和國家處方一覽表XIV，第14版，華盛頓美國藥品協會(1975)所述，其內容在此併入參考。藥物組合物的各種成分的pH和準確濃度是根據本領域常規方法調節的。見Goodman和Gilman，藥物學治療基礎(第7版)。
藥物組合物優選以劑量單位製備和施用。固體劑量單位是片劑，膠囊和栓劑。為進行治療，根據化合物的活性，施用方式，疾病的性質和程度，患者的年齡和體重，可使用不同的日劑量。然而在一些情況下，較高或較低的日劑量可以是適當的。日劑量的施用可以通過一次單獨劑量單位形式或若干較少劑量單位單次施用及也可以特異間隔多次施用細分的劑量。
本發明的藥物組合物可以治療有效量局部施用或系統施用。所用的有效量當然依賴於疾病的程度和患者的體重和一般狀態。典型地，在體外施用的劑量可為原位施用藥物組合物提供有益的指導，可施用動物模型以確定治療特定疾病的有效劑量。例如Langer，科學2491527(1990)闡述了各種需要考慮的事項。口服配方可以是硬明膠膠囊形式，其中活性配料與惰性固體稀釋劑混合，例如碳酸鈣，磷酸鈣或高嶺土。也可以是軟明膠膠囊形式，其中活性配料與水或油基混合，如花生油，液體石臘或橄欖油。
水性懸浮液通常含有與適於產生水性懸浮液的賦形劑混合的活性物質。這種賦形劑可以是(1)懸浮劑如羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，藻酸鈉，聚乙烯吡咯烷酮，黃蓍膠和阿拉伯膠；(2)分散劑或溼潤劑，其可以是(a)天然存在的磷脂如卵磷脂；(b)烯化氧與脂肪酸的縮合產物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；(c)環氧乙烷與長鏈脂族醇的縮合產物，例如heptadecaethylenoxycetanol；(d)環氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯的縮合產物，如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸酯；或(e)環氧乙烷與衍生自脂肪酸和無水己糖醇的部分酯的縮合產物，例如聚氧化乙烯山梨聚糖一油酸酯。
藥物組合物可以是無菌可注射的水性或油性懸浮液。懸浮液可以是根據已知方法配製的，使用上述那些適當的分散劑或溼潤劑和懸浮劑。無菌可注射的製品也可以是在無毒非腸道合適的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射的溶液或懸浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。在合適的運載體和溶劑中可應用的是水，Ringer’s溶液，和等滲的氯化鈉溶液。另外，無菌的，不易揮發的油常規用作溶劑或懸浮介質。為此，可應用任何刺激性小的不易揮發的油，包括合成的一或二甘油酯。另外，脂肪酸如油酸用於可注射製品中。
本發明的透明質酸與化療劑也可一起以脂質輸送系統形式施用.如小單層脂質體、大單層脂質體和多層脂質體。脂質體可以從各種磷脂中形成，如膽固醇，硬脂胺，或磷脂醯膽鹼。
本發明的化合物劑量水平是大約0.5-10mg/kg體重，優選為大約5-20mg/kg體重/天(大約0.3g-20g/人/天)。可與載體物質組合產生單一劑量的活性配料的數量，根據治療的宿主和施用模式可以改變。例如，口服施用於人體的配方可含有大約5mg-1g的活性化合物，及適當的和常規量的載體物質，此載體物質可佔總組合物的大約5-95％。劑量單位形式一般含有大約5mg-500mg的活性配料。
然而應意識到對任何特殊患者的特異劑量水平依賴於各種因素，包括應用的具體化合物的活性，年齡，體重，一般狀況，性別，飲食，施用時間，施用途徑，排洩速度，藥物組合，及進行治療的疾病的程度。
另外，本發明的一些化合物可與水或常用有機溶劑形成溶劑化物。這種溶劑化物涵蓋在本發明範圍內。
本發明的化合物可另外與其它化合物組合，提供一種實用組合。這包括化療劑的任何化學相容的組合，只要這種組合不消除本發明的透明質酸的活性。
本發明通過參考以下非限制性實施例得以進一步闡述。然而應意識到以下實施例只是例證了本發明，而無任何限制本發明之意。特別地，儘管本發明相對於癌症進行了詳細闡述，但應清楚地明了本發明並非只限於治療癌症。例如，HA可用於治療其它症狀。實施例1製備透明質酸和5-氟尿嘧啶溶液
用於所有體外和體內研究的HA均得自Kyowa Kogyo(Yamaguchi，日本)。5-FU得自Sigma，St.Louis，美國。阿黴素得自Cytomix，Northcote，澳大利亞墨爾本。使用的HA標準分布圖如表1所示。
表1散裝透明質酸乾粉的說明單
HA溶液的10mg/ml原液是通過將乾粉狀的HA(模式Mr，7.5×105kDa)溶解於無熱原的注射等級水中製備的。為保證溶液均質，將HA在4℃溶解過夜隨後渦旋。為保證HA在製備原液期間保持其分子量，將溶液在Sephacryl S-1000大小排阻凝膠上分析，柱規格為1.6cm×70cm，樣品大小2ml，流速18ml/h，級分大小2ml。通過糖醛酸分析檢測層析柱級分中的透明質酸。
糖醛酸分析用於定量檢測收集自凝膠過濾層析步驟的級分中透明質酸的存在。然後將每個級分的25μl等份移至96孔平板中，接著在這些級分中加入250μl的咔唑試劑(在H2SO4中的3M咔唑/0.025M硼酸鹽)。將96孔平板在80℃溫育45-60分鐘。用具有550nm濾膜的Dynatech MR7000平板讀出器閱讀此96孔平板。當在背景吸光度之上吸光度＞3標準偏差時，認為此吸光度是顯著的。背景是通過取等量樣品在Vo和Vt之前和之後計算的，其中平均數是16(Fraser等，1998)。
5-FU的原液是通過將粉末狀的5-FU溶解於0.1M的NaOH(pH8.9)中，並用無熱原注射等級的0.9％w/v NaCl將濃度調節為1mg/ml而製備的。將此原液通過0.22μm濾膜過濾以保證無菌性。通過在上述細胞系特異性生長培養基中加入所需體積的原液，將5-FU稀釋。
在0.9％ NaCl中的10mg/ml的阿黴素溶液得自Cytomix。實施例2測試透明質酸對癌細胞形態的作用
基於HA結合親和性(Culty等，1994)，和HA受體CD44和RHAMM的表達(Wang等，1996)，選擇人乳腺腺癌細胞系MDA-MB-468，MDA-MB-435和MDA-MB-231。這些細胞系的特性示於表2。
表2人乳腺癌細胞系的透明質酸結合和受體表達
aCulty等，1994
bWang等1996
將細胞系MDA-MB-231，MDA-MB-468和MDA-MB-435常規培養，並以單層細胞在175cm2培養瓶中，在補加10％胎牛血清(FCS)和抗生素/抗真菌試劑的Leibovitz L-15培養基中，於37℃具有100％(v/v)空氣的控制溼度的溫育器中傳代培養。
具有穀氨醯胺的Leibovitz-L-15培養基(10×濃縮物)，RPMI(10×濃縮物)，Eageles基本培養基(EBM，10×濃縮物)，20mMHEPES，0.09％ w/v碳酸氫鹽，Hanks』平衡鹽溶液(HBSS，10×濃縮物)和無鈣和鎂的Dulbecco’s磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，10×濃縮物)，均購自Sigma(St.Louis，Mo.，美國)。將粉末狀濃縮物溶解於所需體積的反滲透去離子的無熱原的蒸餾水中，產生單一濃度的溶液，通過0.22μm高壓過濾器滅菌(Millipore公司，MA，美國)，並貯藏於4℃。FCS購自澳大利亞CSL公司。將FCS貯藏於-20℃。含有10000單位/ml青黴素，10mg/ml鏈黴素和25μg/ml兩性黴素U的抗生素/抗真菌溶液(100×濃縮物)得自Sigma(St Louis，美國)。含有在0.9％w/v NaCl中的5g/L豬胰蛋白酶和2g/L EDTA的胰蛋白酶/EDTA溶液(10×濃縮物)得自Sigma(St Louis，Mo.，美國)。所有乳腺癌細胞系均得自美國組織培養物保藏中心(Rockville，美國)。所有塑料一次性培養瓶均得自Greiner(澳大利亞)。8孔的組織培養顯微鏡玻片得自Linbro(Flow實驗室，VA，美國)。
為進行測試，將MDA-MB-468，MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞系在補加10％ FCS的90％Leibovitz L-15培養基中生長。當鋪滿時，將培養物用HBSS洗1次，並在0.25％胰蛋白酶/0.05％ EDTA中用胰蛋白酶消化。用自動細胞計數器(ZM-2 Coulter計數器)，通過加入15ml鹽水+0.2ml細胞懸浮液，計數細胞懸浮液。
將細胞以以下數目再懸浮
MDA-MB-46825000個細胞/ml培養基
MDA-MB-23112000個細胞/ml培養基
MDA-MB-43512000個細胞/ml培養基
將細胞鋪板於48孔平板中(1cm2表面積)，每孔加入1ml細胞懸浮液。使細胞附著24小時，之後除去培養基，洗單層細胞。實驗培養基是含有0-1μM阿黴素或5-FU的生長培養基，加入或不加入0-1μM的HA(Mw 750000)。將細胞在不同時間和不同濃度接觸HA和藥物的若干組合(表3)。
表3透明質酸和藥物與人乳腺癌細胞溫育的條件
在溫育和培養之後，將單層細胞用HBSS洗及在0.25％胰蛋白酶/0.05％ EDTA中經胰蛋白酶消化。用自動細胞計數器(ZM-2 Coulter計數器)，加入15ml鹽水+0.2ml細胞懸浮液，計數細胞懸浮液。結果以％無藥物對照組表示，其如下計算
或根據試驗以％藥物對照表示，如下計算
將如實施例2所述指數生長的人乳腺癌細胞MDA-MB-231，與0-5mg/ml HA(模式Mr 750000D)溫育24小時。在第24小時，計數細胞並用得自Eastman Kodak公司，Rochester，美國的CPR，1600膠捲照相。
當HA與乳腺癌細胞溫育30分鐘，1小時，24小時或3天時，觀測到不同應答，其中乳腺癌細胞數降低0-29％(見表4)。
表4HA對人乳腺癌細胞系的胞毒性作用*表中結果是2-3次獨立測定的平均值。
當人乳腺癌細胞與HA溫育時，還觀測到特異性形態學改變(見圖1)，如質膜膨脹，胞質成分的顆粒度較大。
當人乳腺癌細胞接觸HA 30分鐘，1小時，24小時或3天後，隨後接觸阿黴素，顯然地HA增強藥物的胞毒性(圖3&表5)。
表5在乳腺癌細胞系中HA對阿黴素胞毒性的作用
所有數字均代表2-3次獨立的試驗的範圍，其中數值是IC50減少倍數，這是通過將HA加入藥物中或在加入藥物之前用HA預致敏癌細胞而得的。實施例3透明質酸在體內的效力
基於實施例2中體外藥物敏感性實驗結果，對透明質酸作為單獨藥劑及作為化學致敏劑，在體內治療人乳腺癌的治療效力進行評價。
從實施例2的結果中，選擇癌細胞系MDA-MB-468作為癌細胞接種物，以產生所有人腫瘤異種移植的裸鼠。將細胞常規生長，並如實施例2所述傳代培養。為注射入小鼠中，將細胞生長至100％鋪滿，在0.025％胰蛋白酶/0.01％ EDTA溶液中經胰蛋白酶消化，洗2次，在Beckman TJ-6臺式離心機中以400gav離心10分鐘，用ZM型Coulter計數器計數，並以1×108個細胞/ml再懸浮於無血清的Leibovitz L-15培養基中。
將得自澳大利亞墨爾本Walter和Eliza Hall研究所的6-8周齡的無胸腺CBA/WEHI雌性裸鼠，保持在特異的無病原的條件下，無限制地給予無菌食物和水。每個小鼠注射一次含有5×106個細胞的50μl注射液。用26號針頭將細胞注射入在第一個乳頭下的乳腺脂肪墊中(Lamszus等，1997)。通過測定三維直徑(d1d2d3)每周對腫瘤進行測定。腫瘤體積用以下公式估算
(1/6)π(d1d2d3)
在接種癌細胞後約4-8周，開始用5-FU±HA處理。用於每項研究的小鼠的平均腫瘤大小示於表6。
表6在每項研究開始時人乳腺癌腫瘤的概況
在誘導腫瘤後大約8周，將攜帶腫瘤的兩個小鼠給予致死劑量的戊巴比妥。在3分鐘內殺死小鼠，經手術切除腫瘤，並立即在10％福馬林緩衝液中固定12小時。將固定的腫瘤在70-100％系列的乙醇中脫水過夜，隨後用石蠟包埋，製成2-4μm的切片。將切片置於玻片上，脫蠟，並加入水。將玻片用PBS洗3×5分鐘。用10％胎牛血清溫育10分鐘封閉嗜異蛋白，隨後用PBS漂洗。
用於觀測HA和HA合酶抗體的二級抗體得自Dako(Californie，美國)。3，3′-二氨基聯苯胺(Sigma，Fast DAB)片劑得自Sigma，St.Louis，美國。
在室溫應用檢測抗體60分鐘。檢測抗血清或抗體是抗RHAMM，CD44H和CAE的抗血清或抗體。將玻片用PBS洗3×5分鐘，並通過在甲醇中的0.3％H2O2中浸泡20分鐘阻斷內源性過氧化物酶活性。再用PBS洗後，在室溫應用綴合過氧化物酶的豬抗兔二級抗血清60分鐘，隨後用PBS洗3×5分鐘。Sigma Fast 3，3′-二氨基聯苯胺片劑(DAB)是根據生產者的指導製備的，並在室溫應用DAB溶液5-10分鐘。將玻片用自來水洗10分鐘，用蘇木精負染，脫水並封固。
各個5-FU注射液是根據各個小鼠的質量製備的，目的是將30mg/kg的5-FU分液在50μl注射液中輸送(相當於平均60kg體重的人用治療劑量10.5mg/kg；Inaba等，1988)。製備包含終HA濃度等於12.5mg/kg小鼠體重的HA注射液，以便可以實現將12.5mg/kgHA在50μl中輸送。就注射至體內的HA的數量而言，在實驗期間可觀測飽和動力學(Fraser等，1983)。
一種最常用的治療人乳腺癌的方案是在一個28天周期的第1天和第8天施用環磷醯胺，氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶。在人乳腺癌中，開始治療方案是6個周期，此時再確定患者的情況，因此我們嘗試儘可能地模擬人體治療方案，即在長期效力研究中將小鼠進行6個周期(6個月)治療，和6個周期(6周)的短期效力研究。考慮到小鼠的生活周期是大約2年，我們同時開始短期和長期治療方案(見表7)。
表7治療施用方案
將小鼠隨機分成7組每組8隻動物進行短期研究，及5組每組8隻動物進行長期研究(參考表7的劑量和治療施用時間表)。
治療不要超過6個月，因為已經證實超過6個月的化療一般不伴有更大的益處(Harris等，1992)。
在進行長期研究應用處理的當天，對動物稱重並測定腫瘤體積。在6周的研究期間，每天對動物進行稱重及測定腫瘤體積。將動物單獨置於注射盒中，並通過尾靜脈施用注射液。實驗證明在患者對化療的反應中，應激是一個主要因素(Shackney等，1978)，因此我們保證在每個籠中分配相同數目的小鼠，根據實驗階段每個籠中小鼠的數目可以是5-8隻。
當動物由於疾病進展的程度不得不進行安死術時，或當6個月(長期)或6周(短期)治療方案結束時，實驗到達終點。由於動物保護規範，通過獨立的動物保護人員隔周監測一次動物，其確定疾病進展程度。以下標準用於確定動物是否已經達到需要致死的實驗終點階段
1)腫瘤已經非常大以至於使動物不能行動；
2)動物不吃不喝，而且體重已經明顯下降；
3)腫瘤大小超過身體的10％。
在實驗終點，將動物通過腹膜內注射0.1ml的戊巴比妥(60mg/ml)進行麻醉，收集血液，隨後用頸椎脫位法處死小鼠。
在處死小鼠後，立即切下小鼠的腫瘤，肝，心，脾，膀胱，左右腎，子宮，肺，胃，小腸，腦和淋巴結，並置於用0.06M磷酸鹽(pH7.5)和1.0％w/v十六烷基氯化吡啶緩衝的4％福馬林中。將組織固定16-24小時，之後進行組織學加工。將固定的組織用100％乙醇脫水，並包埋於石蠟中製成2-4μm的切片，將切片置於顯微玻片上。用蘇木精核染色法和伊紅胞質染色法對組織切片進行染色，示出可表示治療毒性的任何病理學特徵。
從每隻動物收集9-11個淋巴結，確保收集的是自腫瘤區域輸出的所有淋巴結。通常有兩種方法用於檢測淋巴結轉移
i)對大體器官結構進行常規蘇木精和伊紅染色；及
ii)用癌症標記如癌胚抗原(CEA)進行免疫組織化學分析。
在本研究中這兩種轉移檢測方法均使用。不是所有的可商購的CEA抗體均與人乳腺癌細胞反應，所以我們測試了5種不同的抗體的反應性(DAKO，Amershan和KPL)。
P.Allen博士(認證的病理學家)測試了蘇木精和伊紅染色的淋巴結，其中對每個淋巴結進行顯微鏡檢腫瘤細胞的存在情況。對CEA免疫染色的淋巴結進行顯微鏡檢，其中計數任何陽性染色的淋巴結，並認為此陽性是轉移的淋巴結。
用圓規每天或每周監測腫瘤體積，並如前述計算腫瘤體積。在6周研究期末，確定腫瘤質量，其中經HA化學致敏處理的腫瘤體積明顯小於鹽水組，HA和5-FU處理組的腫瘤體積(p＝0.005)，如圖6所示。在處理的前兩周，腫瘤應答無明顯不同，但之後經HA隨後5-FU處理的腫瘤生長與其它組相比明顯延遲。在處理的6周期間，腫瘤倍增周期數令人感興趣地不同。接受鹽水處理的小鼠經歷平均4次腫瘤倍增，而在治療方案中摻入HA明顯延長腫瘤倍增時間，其中HA/5-FU處理的動物經歷平均1次腫瘤倍增周期，再一次顯明了HA對5-FU胞毒性的作用。
所有動物均顯示淋巴結中的淋巴結轉移瘤在原發腫瘤的鄰近。淋巴結累及百分率(每隻動物轉移的淋巴結數目)在經HA隨後5-FU處理，5-FU和HA處理後明顯降低，而鹽水組表明淋巴結累及數量提高6倍。其它處理組表明百分率明顯較低，為12.2-14.3％(Dunnett’s多重對比試驗，p＝＜0.001)。
共施用HA導致非淋巴結轉移明顯降低。除了接受HA處理的小鼠之外，在原發腫瘤鄰近的區域的頸部或腋下發現了新腫瘤。胃腸道毒性
5-FU的一個最常見的毒性作用是對胃腸道的毒性作用，其中可發生出血性腸炎和小腸穿孔(Martindale，1993)。每天監測動物的胃腸道紊亂情況如腹瀉，及每周更嚴重的毒性表現如體重減輕。體重減輕是通過減去腫瘤重計算淨重而監測的，腫瘤重是根據1g×腫瘤體積(cm3)計算的，如Shibamoto等，1996所述。為表明任何體重變化，根據以下公式將動物體重根據開始處理時的體重而歸化
在6周研究期間注意到無治療毒性。與經5-FU處理組相比，接受HA治療的小鼠(即HA作為唯一藥劑或作為化學致敏劑)行為更良好而體重不減輕，而是還保持其體重(圖4)。血液骨髓抑制
與5-FU治療相關的一個主要毒性是骨髓抑制，隨之而來的是白細胞數減少，這需要評定任何治療相關的血液毒性。將動物麻醉，用針頭和注射器從心臟和大血管中收集血液。將血液在小鼠粘性鹽水(M)中1/50稀釋，並在血細胞計數器上計數估算白細胞數。通過計數嗜中性粒細胞，淋巴細胞和紅細胞進行血液分類計數。將全部估算的血細胞亞群與關於小鼠血液公布的數據相對比。
不管怎樣處理，總白細胞計數和亞群計數無明顯差異。治療對器官質量的影響
為保證治療不導致器官萎縮或漲大，在動物死後切除器官並稱重。每個器官的質量以總淨體重的％計算，並與只用鹽水治療組(1組)的器官質量相對比。
計算所有患病動物的存活時間(天或周)，即在開始治療後動物的存活時間。在每種治療組中的所有動物均度過6周的治療程序。
與器官質量相關，HA治療不導致任何明顯毒性。接受5-FU的小鼠呈現脾擴大(質量增加61％)，而聯合施用HA和5-FU將這種擴大明顯抵消31％(t檢驗，p＜0.001)。5-FU治療導致子宮萎縮(22％)，而HA/5-FU治療再一次顯示將此毒性作用降低10％(t檢驗，p＝0.04)。還清楚地說明在治療方案中加入HA，當聯合施用或提前一天施用時，與鹽水治療組相比，明顯降低原發腫瘤的大小(t檢驗，p＝0.006)。在這些治療當中注意到器官質量方面無其它差異。實施例4透明質酸濃度對5-FU體外效力的影響
將MDA-MB-468，MDA-MB-435和MDA-MB-231細胞如實施例2所述培養。當培養物達到70-80％鋪滿時，將它們用1×HBSS在37℃洗滌，並在10ml的0.25％胰蛋白酶/0.05％ EDTA中經胰蛋白酶消化，直至細胞充分脫附。在加入1ml FCS以中和胰蛋白酶後，計數細胞，在1200rpm離心5分鐘，並如下重懸
MDA-MB-23112000個細胞/ml培養基；
MDA-MB-46825000個細胞/ml培養基；
MDA-MB-43512000個細胞/ml培養基。
然後將細胞鋪板於48孔平板中，並根據供應商的指導溫育。在24小時後，除去培養基並用以下測試培養基置換
MDA-MB-46840nM阿黴素；
MDA-MB-23150nM阿黴素；
MDA-MB-43510nM阿黴素。40nM阿黴素培養基450ml(原液阿黴素是1.7mM，因此1700000/40＝42500；450000/42500＝10.6μl的1.7mM阿黴素+450ml培養基)。原液HA是700000道爾頓的14.3μM HA。結論
此研究充分證明HA在體外和體內均可增強抗癌藥物5-FU和阿黴素的胞毒性。更具體地
1)作為唯一藥劑，HA在體外和體內均能發揮對癌細胞的胞毒
作用(圖5)；
2)對HA單獨治療或化學致敏治療的療效進行評價表明，其
對正常組織無毒性，及不增強藥物的毒性分布圖。事實上，
接受治療的小鼠顯示在6周的治療期間體重明顯增加，而
且淋巴結轉移降低。聯合施用HA和5-FU對降低原發腫瘤
體積具有明顯的作用；
3)在治療方案中摻入HA的小鼠不顯示任何繼發性腫瘤形成
(圖6)。未來研究
進行使用HA在體內治療乳腺癌的實驗。這些實驗針對於HA濃度和分子量對阿黴素的胞毒性的作用。藉助於這些研究，也可確定藥物和HA的接觸時間和方案，以及HA的作用機制，即受體介導的轉運和/或對細胞膜的作用。也收集了關於HA在化學致敏抗藥性癌細胞中的作用的其它數據。第1部分
所有研究均是在表達不同水平的HA受體CD 44和RHAMM的乳腺癌細胞系上進行的。測試細胞系，如MDA-MB435，MDA-MB-231MDA-MB-468，ZRL-751和一些表達MDR-1的乳腺癌細胞系。
評價HA/阿黴素接觸時間和濃度對抗藥性和藥物敏感性乳腺癌細胞的作用。將4種MDR-1陽性和4種MDR-1陰性細胞系接觸1，2.5，5，10，20，40，60，80和100nM的阿黴素，測試以下變量
1)接觸藥物±100nM HA 1小時，隨後無藥物培養3天；
2)恆定接觸藥物±100nM HA 3天，接觸100nM HA 30分鐘，隨
後接觸藥物1小時，細胞無藥物培養3天；
3)接觸100nM HA 24小時，隨後接觸藥物1小時，細胞無藥物
培養3天。
這些實驗將確定最佳HA接觸時間和方案，當與HA組合時阿黴素胞毒性提高的量度，及HA是否能克服乳腺癌細胞中的流量泵的抗性。
目前阿黴素的IC50已經確定為90nM。使用90nM的阿黴素，HA(700kD)的濃度可以是1，3，10，30，100，300nM，1μM，3μM，10μM，30μM，和100μM。待測試的溫育變量是
1)接觸HA 30分鐘，隨後接觸藥物1小時，細胞無藥物培養3天；
2)接觸HA 24小時，隨後接觸藥物1小時，細胞無藥物培養3
天；
3)接觸HA±藥物1小時，細胞無藥物培養3天。
對任何脫附的細胞測試細胞存活性，因為已經提示HA在癌細胞脫附和遷移中能起關鍵作用。如果脫附的細胞是存活的，用FACS表面表位鑑別方法確定HA受體狀態。用短的HA寡糖進行相似的實驗，即用4糖，6糖，12糖，5600Da，50000Da，100000Da，250000Da的寡糖。
這些實驗將表明體外最佳HA藥物比率，最佳HA接觸時間和方案，HA分子量對阿黴素胞毒性的作用。
在確定最佳HA濃度後，將IC50的阿黴素用於一系列時程實驗中，以觀測HA對阿黴素代謝的作用。
將細胞接觸〔14C〕阿黴素30分鐘，1小時，2小時，4小時，8小時，16小時和24小時。實驗條件是
1)將細胞接觸HA 30分鐘，隨後接觸藥物；
2)將細胞接觸HA 24小時，隨後共同接觸HA/阿黴素。
除去細胞，低滲裂解並在113000gav離心1小時。計數膜沉澱和上清，並用HPLC分析代謝物。
另外將細胞在蓋玻片上生長，它們將接觸阿黴素±HA(如上述接觸方案)，及使用時程聚焦照像追蹤藥物的胞質吸收和運動。
鑑別在MDR-1陽性和陰性乳腺癌細胞系上的HA受體，對CD44s，CD44v6，CD44v10和RHAMM受體進行FACS定量。另外用FITC/HA和FACS分析確定HA/受體結合數量和飽和動力學。
通過將細胞接觸
1)HA 30分鐘，隨後接觸藥物；
2)HA 24小時，隨後接觸藥物；
3)HA/阿黴素我們可以確定這些物質阻斷CD44s和RHAMM受體。任何存活細胞的受體狀態用表面表位FACS分析定量。如果HA受體的阻斷降低正常觀測到的阿黴素和HA之間的協同作用，則膜結合的和胞質阿黴素定量為±HA受體阻斷。
用〔3H〕HA和凝膠過濾層析±受體阻斷研究細胞系對HA的降解。
將分子量為4糖，6糖，12糖，5600Da，50000Da，100000Da，250000Da，750000Da和1500000Da的HA與乳腺癌細胞系在預定的「觀測效應」濃度溫育，以下為研究的參數胞外和胞內Ca2+流量(細胞探針分析)。另外也進行細胞骨架成分的調節(細胞骨架基因的微陣列)，對細胞體積的作用(Coulter大小分析)和癌細胞的遷移率(Boyden Chamber matrigel分析)分析。
通過將乳腺癌細胞系在預定的「觀測效應」濃度與分子量為4糖，6糖，12糖，5600Da，50000Da，100000Da，250000Da，750000Da和1500000Da的HA溫育，證明HA對細胞周期的作用。將細胞用碘化鉀標記，進行FACS分析。確定在一個細胞周期的每個階段的細胞數。
用最佳HA/阿黴素製品進行脂質體阿黴素和HA/阿黴素製品的體外效力對比，使用Liposome公司在脂質體阿黴素的臨床前試驗中使用的劑量範圍。第2部分
在將HA/阿黴素抗癌治療用於I期人乳腺癌試驗之前，必需進行初步的毒性試驗。此試驗集中於
1)在小鼠身體器官和體液中透明質酸對阿黴素吸收的作用；
2)確立阿黴素的初步劑量範圍。確定HA是否將阿黴素定向於
在裸鼠體內的人乳腺腫瘤異種移植物；
3)對比商購的脂質體阿黴素與HA/阿黴素在小鼠體內的吸收情
況；
4)對比脂質體阿黴素和HA/阿黴素的短期效力。
根據Inaba等所述(1988)，用於裸鼠的阿黴素劑量為4mg/kg，等於用於人體的60mg/m2劑量。攜帶人體腫瘤的裸鼠用阿黴素±HA注射。使用4mg/kg濃度的阿黴素±12.5mg/kg的HA。實驗方案包括以下治療組
1)4mg/kg阿黴素；
2)4mg/kg阿黴素+12.5mg/kg HA；
3)4mg/kg脂質體阿黴素。
所用的阿黴素±HA將定量地注射入小鼠的尾靜脈內。
在間隔2，15，30，60分鐘和1.5，2，4，8，24和48小時(每個時間點4隻動物)，通過IP注射0.1ml戊巴比妥而處死。取出所有器官，骨骼肌，淋巴結，骨髓，尿液和血液，並用HPLC和螢光確定阿黴素含量。
在裸鼠中(WEHI CBA品系)產生人乳腺腫瘤。將小鼠如下述注射
1)小鼠LD50為10mg/kg；
2)4mg/kg阿黴素；
3)4mg/kg阿黴素+12.5mg/kg HA；
4)8mg/kg阿黴素；
5)8mg/kg阿黴素+12.5mg/kg HA；
6)4mg/kg脂質體阿黴素
7)鹽水
8)12.5mg/kg HA。
上述是在一周周期的第2，4，6天定量注射入小鼠尾靜脈內的(8隻動物/組)。
每天監測小鼠的腫瘤體積，體重，攝食和功能性。
在8周研究期完成後，將小鼠通過IP注射0.1ml戊巴比妥處死。取出所有器官，腫瘤，骨骼肌，淋巴結，骨髓，尿液和血液，進行病理學分析。第3部分
為回答一些關於HA對結腸癌細胞的抗癌治療作用的基礎問題，應進行以下實驗。
研究HA/5-FU接觸時間和濃度對抗藥性和藥物敏感性結腸癌細胞的作用。
將3個抗性細胞系和3個敏感性細胞系接觸1，2.5，5，10，20，40，60，80和100nM的5-FU，測試以下變量
1)接觸藥物±100nM HA 1小時，隨後無藥物培養3天；
2)恆定接觸藥物±100nM HA 3天；
3)接觸100nM HA 30分鐘，隨後接觸藥物1小時，將細胞無藥
物培養3天；
4)接觸100nM HA 24小時，隨後接觸藥物1小時，細胞無藥物
培養3天。
使用如上述確定的IC50的5-FU，HA(700kD)濃度可以是1，3，10，30，100，300nM，1μM，3μM，10μM，30μM和100μM。測試以下溫育變量
1)接觸HA 30分鐘，隨後接觸藥物1小時，將細胞無藥物培養
3天；
2)接觸HA 24小時，隨後接觸藥物1小時，將細胞無藥物培養
3天
3)接觸藥物±HA1小時，將細胞無藥物培養3天。
對任何脫附的細胞測試細胞存活性，因為已經提示HA在癌細胞脫附和遷移中起關鍵作用。如果脫附的細胞是存活的，用FACS表面表位鑑別方法確定HA受體狀態。
用短的HA寡糖進行相似實驗，即用4糖，6糖，12糖，5600Da，50000Da，100000Da，250000Da。
在確定最佳HA濃度後，將IC50的5-FU用於一系列時程實驗中，以觀測HA對阿黴素代謝的作用。
將〔3H〕5-FU接觸細胞30分鐘，1小時，2小時，4小時，8小時，16小時和24小時。實驗條件是
1)將細胞接觸HA 30分鐘，隨後接觸藥物；
2)將細胞接觸HA 24小時，隨後共同接觸HA/5-FU。
除去細胞，低滲裂解並在113000gav離心1小時。計數膜沉澱和上清，並用HPLC分析代謝物。
另外將細胞生長於蓋玻片上，在此將它們接觸5-FU±HA(如上述接觸方案)，及用時程聚焦照像追蹤藥物的胞質吸收和運動。
使用FITC/HA和FACI分析，鑑別抗性和敏感性結腸癌細胞系上的HA受體，FACS定量CD44s，CD44v6，CD44v10和RHAMM受體，定量HA/受體結合和飽和動力學。
用抑制性抗體阻斷CD44s和RHAMM受體，參照以下方案應用5-FU±HA
1)將細胞接觸HA 30分鐘，隨後接觸藥物；
2)將細胞接觸HA 24小時，隨後共同接觸HA/5-FU。
計數細胞。用表面表位FACS分析定量存活的細胞的受體狀態。
如果HA受體的阻斷降低在5-FU和HA之間正常觀測到的協同作用，膜結合的和胞質的5-FU將被定量為±HA受體阻斷。
用〔3H〕HA和凝膠過濾層析±受體阻斷研究細胞系對HA的降解。
HA對質膜的作用
將分子量為4糖，6糖，12糖，5600Da，50000Da，100000Da，250000Da，750000Da，和1500000Da的透明質酸，與乳腺癌細胞系在預定的「觀測效力」濃度溫育，以下是待研究的參數
1)胞外和胞內Ca2+流量(細胞探針分析)；
2)細胞骨架成分的調節(細胞骨架基因的微陣列)；
3)對細胞體積的作用(Coulter大小分析)；
4)癌細胞的遷移率(Boyden Chamber matrigel分析)；
5)HA受體的定量(FACS)；
6)膜電壓(已經確定的方法)。
進行HA新佐劑治療對抑制器官轉移的作用的研究。與其它治療組相對比，接受HA治療的小鼠表明
1)與其它治療組相比淋巴結轉移降低；
2)抑制新腫瘤形成；
3)體重增加；
4)行為更好。
這些結果充分表明HA抗癌療法作為降低癌擴散的一種有效方法的可能性。通過專性選擇臨床前模型，有一限制，從而繼發性癌擴散通常發生在淋巴結周圍。使用我們能檢測到癌是否擴散到每個器官和骨的模型是有利的。通過使用已知為BAG載體轉移模型的模型，我們能監測癌是否擴散到器官和骨。
簡單來說，BAG載體由新黴素抗性LacZ基因組成，該基因可穩定轉染入人乳腺癌細胞中。在將其經心內注射至裸鼠後，隨後進行6周治療程序，可通過PCR檢測在任何轉移的細胞/器官中LacZ基因。檢測骨損害的Faxitron掃描可檢測任何骨轉移。
以下治療在一周周期的第1，2天給予，共6周。治療組(5隻動物/組)由以下組成
1.鹽水
2.第1，2天30mg/kg 5-FU；
3.第1，2天12.5mg/kg HA；
4.30mg/kg 5-FU+12.5mg/kg HA(在第1，2天共同施用)；
5.在第1天12.5mg/kg HA，第2天30mg/kg 5-FU，第3天
12.5mg/kg HA，第4天30mg/kg 5-FU；
6.在第1，3天12.5mg/kg HA；
7.在第2，4天30mg/kg5-FU；
8.在第1，2天15mg/kg MTX；
9.15mg/kg MTX+12.5mg/kg HA(在第1，2天共同施用)；
10.第1天12.5mg/kg HA，第2天15mg/kg MTX，第3天
12.5mg/kg HA；第4天15mg/kg MTX；
11.在第2，4天15mg/kg MTX；
12.在第1，2天15mg/kg MTX，30mg/kg 5-FU，30mg/kg環
磷醯胺；
13.在第1，2天15mg/kg MTX，30mg/kg5-FU，30mg/kg環
磷醯胺+12.5mg/kg HA；
在第1天12.5mg/kg HA，第2天(15mg/kg MTX，30mg/kg 5-
FU，30mg/kg環磷醯胺)，第3天12.5mg/kg HA，第4天(15mg/kg
MTX，30mg/kg 5-FU，30mg/kg環磷醯胺)。新佐劑療法
在馬上進行心內注射之前給予下述物質
1)12.5mg/kg HA；
2)15mg/kg MTX；
3)15mg/kg MTX，12.5mg/kg HA；
4)30mg/kg 5-FU；
5)30mg/kg 5-FU，12.5mg/kg HA；
6)15mg/kg MTX，30mg/kg 5-FU，30mg/kg環磷醯胺；
7)15mg/kg MTX，30mg/kg 5-FU，30mg/kg環磷醯胺+12.5mg/kg
HA。
在6周治療期間每天監測小鼠的體重和健康情況。在一個治療周期完成後，對每個小鼠掃描骨損害情況。在掃描後，取出每個器官和體液。保留器官的充分橫切片以進行進一步病理學分析，同時將剩餘組織均質並進行競爭性PCR，以檢測LacZ基因。
對顯示轉移的任何器官進行組織學加工，並用半乳糖苷酶染色LacZ基因觀測癌細胞的建群模式。參考文獻
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權利要求
1.一種治療需要治療的患者的抗藥性疾病的方法，包括給所述患者施用與化療劑結合的治療有效量的透明質酸，由此所述化療劑比單獨施用時更有效。
2.一種增強化療劑生物利用率的方法，包括給需要治療的患者施用治療有效量的透明質酸。
3.一種治療或預防多元抗藥性或抗藥性細胞的方法，包括在施用化療劑之前，同時或之後施用足夠量的透明質酸。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中化療劑選自卡氮芥(BCNU)，苯丁酸氮芥(Leukeran)，順鉑(Platinol)，阿糖胞苷，阿黴素(Adriamycin)，氟尿嘧啶(5-FU)，氨甲喋呤(Mexate)，CPT111，依託泊苷，普卡黴素(Mithracin)，和taxanes。
5.權利要求1的方法，其中抗藥性疾病是一種細胞增生性疾病。
6.權利要求5的方法，其中細胞增生性疾病選自乳腺癌，肺癌，前列腺癌，腎癌，皮膚癌，中樞神經癌，卵巢癌，子宮癌，肝癌，胰腺癌，上皮癌，胃癌，小腸癌，外分泌腺癌，內分泌腺癌，淋巴癌，造血系統癌或頭頸部組織癌。
7.權利要求1-6任一項的方法，其中患者是哺乳動物。
8.權利要求7的方法，其中哺乳動物選自牛，狗，馬，貓，豬和人。
9.權利要求1-8任一項的方法，其中透明質酸是在施用化療劑之前，同時或隨後施用的。
10.權利要求1-9任一項的方法，其中透明質酸和/或化療劑是經口服，局部或非腸道施用的。
11.權利要求10的方法，其中透明質酸和/或化療劑是與藥物合適的載體，佐劑或運載體一起施用的。
12.權利要求10或11的方法，其中非腸道施用是通過皮下注射，氣霧劑，靜脈內，肌內，鞘內，顱內，胸骨內注射或輸注方法施用的。
全文摘要
本發明涉及增強治療疾病的化療劑的生物利用率的方法。具體地,本發明涉及增強化療劑的生物利用率的方法,其包括給予需要治療的患者治療有效量的透明質酸。
文檔編號A61K45/00GK1388760SQ0180235
公開日2003年1月1日 申請日期2001年7月13日 優先權日2000年7月14日
發明者特蕾西·布朗, 理察·福克斯 申請人:美迪泰克研究有限公司