肝癌組織特異表達基因及其應用的製作方法
2023-12-09 09:13:41 2
專利名稱：肝癌組織特異表達基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及人肝癌相關基因及應用。更具體地，本發明涉及利用肝癌中表達上調的肝癌相關基因來檢測腫瘤易感性的方法和試劑盒。
背景技術：
惡性腫瘤的死亡率在我國僅次於心、腦血管疾病名列第二。在惡性腫瘤中肝癌的死亡率列在肺癌、胃癌之後居第三位。目前對肝癌缺乏有效的診治手段。人們普遍認為癌的發生是一種多因子多步驟的複雜事件，是多種癌基因激活和抑癌基因失活的結果。
我國每年約有11萬人死於肝癌，其中男性8萬，女性3萬，佔全世界肝癌死亡人數的45％。我國肝癌高發的趨勢十分嚴峻，這是由於我國有1.2億HBV攜帶者。肝癌的分子生物學研究是近年迅速發展起來的一個新領域，它對肝癌的發生、發展及其與B型肝炎病毒的關係等提供了新的材料。目前對肝癌的致癌基因、抑癌基因的發現，以及肝癌與HBV的感染等方面研究進展較快。
正常人體原癌基因和抑癌基因互相制約，控制細胞正常的增殖、分化，組織的再生和個體發育。癌症的發生很大一部分是由於病毒或化學致癌物的作用使原癌基因激活成為癌基因，以及抗癌基因失活，引起細胞生長失控而形成。癌的發生涉及多種因素，分多階段形成，因此可能有多個癌相關基因在不同時期的激活或抑制。癌相關基因的激活或抑制，表現在與正常組織或細胞相比，基因的表達異常，出現表達量升高或降低，甚至基因結構發生突變。
由於癌症是危害人類健康的主要疾病之一。為了有效地治療和預防腫瘤(如肝癌)，目前人們已越來越關注腫瘤的早期診斷和基因治療。然而目前為止發現的肝癌相關基因的數量還很有限。
因此，本領域迫切需要開發研究新的癌症相關的和/或具有抑癌功能的人蛋白，以及相應的檢測試劑盒。
發明內容
本發明的目的是提供一種新的腫瘤相關蛋白-人肝癌相關蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供利用肝癌相關基因檢測腫瘤易感性的方法和試劑盒。
在本發明的第一方面，提供了一種體外檢測待測細胞中肝癌相關基因表達水平是否上調的方法，它包括步驟(a)檢測待測細胞中肝癌相關基因的表達水平，其中所述的肝癌相關基因選自Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48、或其組合；(b)將待測細胞中肝癌相關基因的表達水平與對照相比較，從而確定肝癌相關基因表達水平是否上調。
在另一優選例中，步驟(b)中判斷上調的標準是肝癌相關基因的表達水平比正常人群中肝癌相關基因的表達水平高1.5-100倍。
在另一優選例中，步驟(b)中判斷上調的標準是肝癌相關基因的表達水平比正常人群中肝癌相關基因的表達水平高3-50倍。
在另一優選例中，步驟(b)中判斷上調的標準是肝癌相關基因的表達水平比正常人群中肝癌相關基因的表達水平高4-25倍。
在另一優選例中，在步驟(a)中檢測Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48中2-4種肝癌相關蛋白。
在另一優選例中，步驟(a)中的待測細胞是肝細胞。
在另一優選例中，步驟(a)中的檢測是通過核酸晶片檢測法、半定量PCR法、定量PCR法、蛋白質晶片檢測法、或抗原-抗體檢測法進行。
在本發明的第二方面，提供了一種檢測腫瘤易感性的試劑盒，它包括特異性擴增肝癌相關基因轉錄本的引物和說明書，所述的肝癌相關基因選自下組Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48、或其組合。
在另一優選例中，所述的引物選自下組(i)Beclin1特異性引物，所述引物具有SEQ ID NO1和2所示的序列；(ii)Lis1特異性引物，所述引物具有SEQ ID NO3和4所示的序列；(iii)Pir51特異性引物，所述引物具有SEQ ID NO5和6所示的序列；(iv)RbAp48特異性引物，所述引物具有SEQ ID NO7和8所示的序列。
在另一優選例中，所述的試劑盒還含有擴增其他肝癌相關基因轉錄本的引物，例如擴增醛縮酶b的特異性引物(SEQ ID NO9和10)。
在另一優選例中，檢測腫瘤易感性的試劑盒包括特異性結合於肝癌相關基因的表達產物的抗體和說明書，所述的肝癌相關基因選自下組Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48、或其組合。
在另一優選例中，腫瘤易感性的試劑盒包括檢測肝癌相關基因的晶片和說明書，所述晶片選自下組(a)DNA晶片，所述晶片具有基片和點樣於基片上點樣區的點樣DNA，所述的點樣DNA包括特異性結合於肝癌相關基因轉錄本的探針，所述的肝癌相關基因選自下組Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48、或其組合；(b)蛋白質晶片，所述晶片具有基片和點樣於基片上點樣區的點樣蛋白，所述的點樣蛋白包括特異性結合於肝癌相關基因的表達產物的抗體，所述的肝癌相關基因選自下組Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48、或其組合。
本發明的其它方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
圖1顯示了微矩陣雜交技術分析人肝癌組織與癌旁正常組織的基因表達差異。
圖2顯示了Beclin1，RbAp48，Aldolase b和Pir51四種基因在肝癌和癌旁正常組織中的表達檢測。T為肝癌組織，N為癌旁正常組織。
圖3顯示了Beclin1，RbAp48，Aldolase b，和Pir51四種基因在肝癌細胞中的表達檢測。
圖4顯示了Lis1基因在正常肝(N)，肝癌(K)和癌旁正常肝組織中(L)中的表達檢測。膜上總RNA的量，分別為5μg/點，10μg/點，20μg/點。β-actin(β-肌動蛋白)基因的雜交結果為對照。
具體實施例方式
本發明人經過深入而廣泛的研究，新發現並分離了一組與肝癌相關基因及其編碼的蛋白質，這一組基因(Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48)是在肝癌中特異性高表達，因此是可作為肝癌發生發展(尤其是早期診斷)的標記和基因治療的靶標。
此外，本發明人還發現並分離了在肝癌中特異性低表達(甚至不表達)的肝癌相關基因Aldolase b(醛縮酶b)，因此所述基因也可作為肝癌發生發展(尤其是早期診斷)的標記和基因治療的靶標。
具體而言，本發明涉及利用cDNA微矩陣技術篩選正常肝和肝癌中表達差異基因，獲得了8400個基因的表達圖譜。把正常肝組織和肝癌組織的基因表達譜進行對比，通過比較分析發現有256個基因表達上調，267個基因表達下調，這些基因的表達上調或下調都大於4倍。本發明中公開了5個經鑑定的基因在40％以上樣品中表達有差異。這5個五個基因的差異表達百分率Lis1為40％，Beclin1為50％，RbAp48為50％，Pir51為60％，Aldolase b為70％。
本發明還採用Northern blot方法和RT-PCR方法檢測上述基因在正常肝組織和肝癌組織中的表達。
在Northern blot方法中，先分離提取來源於同一病人的肝癌組織和癌旁的正常肝組織的總RNA，經含甲醛的1％瓊脂糖電泳分離後，轉移到尼龍膜上並固定，然後用基因的特異片段製備探針雜交，根據雜交信號確定基因的表達強弱。
結果顯示Beclin1和RbAp48在50％以上所選腫瘤樣品中表達水平顯著上升，而正常肝組織中檢測不到；Aldolase b(醛縮酶b)在70％所選腫瘤樣品中，其表達水平顯著降低。
在RT-PCR檢測方法中，先將分離製備的總RNA反轉錄合成cDNA，然後用我們表1提供的基因特異的引物，進行半定量PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，比較電泳條帶的強弱，確定基因表達產物的高低。
結果顯示，pir51基因在60％所選腫瘤樣品中表達上調。Lis1基因在70％所選腫瘤樣品中表達上調。
本發明人還在6種肝癌細胞系L02、Bel-7402、Bel-7404、SMMC-7721、HepG2、Huh7中用RT-PCR及Northern blotting雜交方法檢測5種基因的表達情況。
結果發現Lis1在6種細胞中都有表達；Beclin1在L02，Bel-7402，HepG2，SMMC-7721中表達，在Bel-7404，Huh7中不表達；Pir51在L02，Bel-7402，Bel-7404，SMMC-7721，HepG2中表達；RbAp48在L02，Bel-7404，Huh7，HepG2，Bel-7402細胞中表達；而Aldolase b只在HepG2細胞中有微弱表達，其它肝癌細胞中不表達。這些結果與組織樣品中的檢測結果是吻合的。
因此，Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48是在肝癌中特異性高表達的肝癌相關基因，醛縮酶b是在肝癌中特異性低表達(甚至不表達)的肝癌相關基因。
定義如本文所用，術語「本發明的肝癌相關基因」指在肝癌中表達上調的Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48。有時，該術語還包括在肝癌中表達下調的Aldolaseb(醛縮酶b)基因。
如本文所用，術語「本發明的肝癌相關蛋白」指在肝癌中表達上調的Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48蛋白。有時，該術語還包括在肝癌中表達下調的Aldolase b(醛縮酶b)蛋白。
如本文所用，「核酸」指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。除非另外說明，該術語已包括能夠與天然核苷酸類似方式發揮作用的天然核苷酸的類似物。
「亞序列」指含有更長序列核酸中一部分核酸的核酸序列。
「探針」或「核酸探針」指一種或多種核酸片斷的集合，可檢測它們與靶目標的雜交。探針被如下所述的標記，使得可檢測它與靶目標的結合。探針是用一種或多種特定部分的基因組製備的，例如一種或多種克隆分離的完整染色體或染色體片斷或聚合酶鏈反應(PCR)產物。探針可以用某種方式進行加工，例如通過封閉或去除重複的核酸或富含獨特的核酸。因此術語「探針」不僅指可檢測的核酸，還指應用於靶目標的可檢測核酸。
「雜交」指通過互補鹼基的配對而使兩個單鏈核酸結合在一起。
「基本結合於」或「特異結合」或「選擇性結合」或「特異性雜交於」，指在寡核苷酸和靶序列之間的互補雜交反應，並可包括微小的錯配，這些錯配可通過降低雜交介質的嚴緊度來實現檢測所需靶多核苷酸序列。該術語還指在嚴緊條件下，一分子結合、複合或雜交與特定核苷酸序列，當該序列存在於複合的混合物中(如總細胞NDA或RNA)時。術語「嚴緊條件」指探針雜交於靶定亞序列而不雜交於其他序列的條件。嚴緊條件是依賴於序列的，並且在不同情況下是不同的。較長的序列可在更高的溫度下特異性雜交。通常，選定的嚴緊條件是比在限定的離子強度和pH下推定序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5℃。該Tm是在達到平衡時，有約50％與靶序列互補的探針與靶序列雜交時的溫度(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下)。通常，對於短探針而言，嚴緊條件是這樣的條件，其中鹽濃度至少約0.02Na離子濃度(或其他鹽)，pH7.0-8.3，且溫度至少約60℃。嚴緊條件還可通過添加去穩定劑如甲醯胺而實現。
本領域的技術人員會理解，此處所述的具體探針的確切序列可以被一定程度地修改(修飾)，以產生與所公開的探針「基本相同」但保留基本結合於靶序列能力的探針。這些修改被本文各探針所覆蓋。術語多核苷酸的「基本相同」指，與參照序列相比，一個序列有至少90％，更佳地至少95％序列相同性。
兩個核苷酸序列被認為「相同」，如果以最大對應性排列時，兩個序列中的核苷酸序列是相同的。如本文所用，術語「互補」指互補序列與參照序列的全部或一部分是序列的。
兩個(或多個)多核苷酸之間的序列比較，通常是將兩個序列的序列在「比較窗」範圍內進行比較，以鑑別和比較局部區域的序列相同性。如本文所用，「比較窗」指至少約20個鄰接位置，通常約50-200，更通常約為100-150個鄰接位置，其中在兩個序列被最佳排列後，將一個序列與具有相同數目鄰接位點的參照序列進行比較。
「序列相同性百分比」的確定，是通過將兩個最佳排列的序列在比較窗內進行比較而得出的。其中與參照序列(不含有插入或缺失)相比，為了獲得兩個序列的最佳排列，在比較窗中的多核苷酸序列可含有插入或缺失(即缺口)。百分比的計算如下通過確定在兩個序列中相同核酸鹼基或胺基酸殘基的數目，得到匹配位置的數目。然後將匹配位置數目除以比較窗中位置數目的總數，並將結果乘以100％，從而得到序列相同性百分比。
另一種表明核苷酸序列是基本相同的方法，是判斷兩個分子是否在嚴緊條件下雜交於同一序列。嚴緊條件是依賴於序列的，並且在不同情況下是不同的。
標記物標記核酸探針的方法是本領域技術人員熟知的。優選的探針是適用於原位雜交的探針。在雜交反應之前，核酸探針可以被可檢測地標記。或者，使用結合於雜交產物的可檢測標記物。這些可檢測標記物是本領域熟知的，並且包括任何具有可檢測的物理或化學性質的物質。
如本文所用，「標記物」是任何一種可通過光譜法、光電法、生物化學法、免疫化學法、或化學法檢測的物質。可用於本發明的標記物包括放射性標記物(如32P，125I，14C，3H，35S)，螢光染料(如螢光素、羅丹明)，電子緻密試劑(如)金，酶(如ELISA中常用的酶)，比色標記(如膠體金)，磁標記(如DynabeadsTM)等。不直接檢測但可通過使用直接檢測標記物而被檢測的標記物例子，包括生物素、地高辛、以及已有標記抗血清或單抗的半抗原和蛋白質。
使用具體的標記物對於本發明而言並不重要，然而優選是的螢光標記物(如螢光素-12-dUTP等)。
如本文所用，直接標記的探針是附著有可檢測標記物的探針。因為直接標記物已附著在探針上，因此隨後不需要步驟將探針與可檢測標記物關聯起來。與之相反，間接標記的探針是攜帶隨後(通常在探針與靶核酸雜交後)能結合可檢測標記物的分子的探針。
此外，探針應能檢測儘可能低的拷貝數，從而使分析的靈敏度最高，同時又能高於背景信號。最後，必需選擇可提供高局部信號的探針，從而在將染色結果與染色體進行物理定位時可提供高空間解析度，可用本領域技術人員已知的各種方法，將標記物偶聯於探針。在優選例子中，核酸探針是用缺口翻譯或隨機引物延伸法標記的。
本領域技術人員會理解，本發明的探針沒有必要對肝癌相關基因絕對特異。相反，探針是用於產生「染色反差」的。「反差」是由在基因組靶區域中探針濃度與基因組其他區域中探針濃度之比確定的。
如上所述，檢測到肝癌相關基因的擴增是多種癌症存在與否以及預後的標誌，尤其是肝癌。
在優選實施例中，通過將本發明的探針與靶核酸(如染色體樣品)的雜交來檢測肝癌相關基因的擴增。合適的雜交方式是本領域技術人員已知的，包括(但並不限於)各種Northern印跡法、原位雜交和定量擴增方法(如定量PCR和半定量PCR)。
在一優選例中，肝癌相關基因擴增是通過原位雜交鑑別的。通常，原位雜交包括下列主要步驟(1)固定待分析的組織或生物結構；(2)對生物結構進行預雜交以增加靶DNA的可接近性(acessibility)，並減少非特異性結合；(3)將核酸混合物與生物結構或組織中的核酸進行雜交；(4)進行雜交後的洗滌以去除在雜交反應中未雜交的核酸；和(5)檢測雜交的核酸片段。根據具體應用，用於每一步驟的試劑及使用條件可以變化。
用於檢測的樣品的例子包括來自腫瘤的少量活檢樣品，尤其是肝細胞和肝組織。
在Northern印跡法中，逆轉錄的cDNA與對靶區域特異的探針雜交。將來自針對靶區域的探針的雜交信號強度，與對照信號強度進行比較，從而提供靶核酸的相對拷貝數的估測值。
檢測方法用於檢測某一基因在待測細胞中表達量的方法是本領域中已知的。代表性的例子包括Northern雜交、定量和半定量PCT(包括RT-PCR)、DNA晶片檢測法、蛋白質晶片檢測法、抗原-抗體檢測法(如ELISA法)。此外，也可使用原位雜交法。上述這些方法都可用於本發明。相關的儀器和試劑可以購自Sigma等公司。
肝癌相關基因的核酸、蛋白和抗體基於本發明所揭示的肝癌相關基因與肝癌的相關性以及肝癌相關基因的序列信息，利用本領域的常規技術來產生肝癌相關蛋白或片段，並用相應的肝癌相關蛋白或片段來產生抗肝癌相關基因的抗體。
本發明的人肝癌相關基因(Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48和Aldolase b)都是在本發明之前的已知蛋白，其基本信息如下所示
Beclin1是一個Bcl-2結合蛋白，在乳腺癌與卵巢癌中表達缺失，可能是乳腺癌的一個抑癌基因。另外，Beclin1在神經細胞中過量表達，可以抑制Sindbis病毒的複製，降低中樞神經系統的凋亡。
Lis1基因據報導與人無腦回綜合症I的發生有關。Lis1蛋白在進化過程中高度保守，含有7個WD重複序列，可以介導蛋白與蛋白的相互作用。Lis1是血小板活化因子乙醯基水解酶的一個亞基。另外，Lis1也與微管蛋白(tubulin)結合直接影響微管的運動。過量表達Lis1可以通過影響紡錘體與染色體的結合進而影響細胞分裂。
Pir51是人Rad51重組酶的結合蛋白。真核細胞的Rad51蛋白在同源重組中起到很重要的作用，對細胞的增殖也是必須的。Pir51與Rad51結合來調節Rad51的功能。
RbAp48是一個Rb結合蛋白。RbAp48還是染色質組裝因子的一個亞基，又是組蛋白去乙醯基酶複合物的一個成員。RbAp48還與CREB結合。RbAp48的功能非常複雜，目前為止，了解的還不是很清楚。
Aldolase b是葡萄糖和果糖代謝的關鍵酶，是肝臟特異表達的基因。
本發明的人肝癌相關基因的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據已公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中的各種DNA分子(如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明蛋白的片段除了可用重組法產生之外，還可用固相技術通過直接合成肽而加以生產(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽。可以分別化學合成本發明蛋白的各片段，然後用化學方法加以連接以產生全長的分子。
另一方面，本發明還包括對人肝癌相關基因DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於人肝癌相關基因基因產物或片段。較佳地，指那些能與人肝癌相關基因基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制人肝癌相關蛋白的分子，也包括那些並不影響人肝癌相關蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人肝癌相關基因基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的人肝癌相關基因基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人肝癌相關基因或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備。本發明的抗體包括能阻斷人肝癌相關基因功能的抗體以及不影響人肝癌相關基因功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人肝癌相關基因基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與人肝癌相關基因基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
基於特異性的抗肝癌相關蛋白抗體，本發明還提供了一種檢測腫瘤或腫瘤易感性的方法，它包括步驟在適合形成抗體複合物的條件下，將含有特異性抗肝癌相關蛋白(Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48)的抗體與待測個體的DNA樣品進行接觸；檢測形成的抗體複合物數量是否高於正常對照，其中形成的抗體複合物數量高於正常對照就表示該個體患有腫瘤或腫瘤易感性高於正常人群。
此外，該方法還可與在肝癌中表達下調的其他肝癌相關基因(如Aldolase b)的檢測相結合，例如在適合形成抗體複合物的條件下，將含有特異性抗肝癌相關蛋白(如Aldolase b)的抗體與待測個體的DNA樣品進行接觸；和檢測形成的抗體複合物數量是否低於正常對照，其中形成的抗體複合物數量低於正常對照就表示該個體患有腫瘤或腫瘤易感性高於正常人群。
試劑盒本發明還提供了診斷肝癌相關基因異常的診斷試劑盒。在優選例中，一種試劑盒包括一種或多種針對肝癌相關基因的探針。該試劑盒還可含有封閉探針以及描述如何使用試劑盒來檢測肝癌相關基因的說明材料。試劑盒還可含有下組中的一種或多種用於協助檢測探針的各種標記物或標記試劑；用於雜交的試劑(包括緩衝液等)；以及陽性和陰性雜交對照等。
另一種優選的檢測腫瘤易感性的試劑盒包括特異性擴增肝癌相關基因轉錄本的引物和說明書，所述的肝癌相關基因選自下組Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48、Aldolase b或其組合。
另一種優選的檢測腫瘤易感性的試劑盒包括特異性結合於肝癌相關基因的表達產物的抗體和說明書，所述的肝癌相關基因選自下組Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48、Aldolase b或其組合。
另一種優選的檢測腫瘤易感性的試劑盒包括檢測肝癌相關基因的晶片和說明書，所述晶片選自下組(a)DNA晶片，所述晶片具有基片和點樣於基片上點樣區的點樣DNA，所述的點樣DNA包括特異性結合於肝癌相關基因轉錄本的探針，所述的肝癌相關基因選自下組Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48、Aldolase b或其組合；(b)蛋白質晶片，所述晶片具有基片和點樣於基片上點樣區的點樣蛋白，所述的點樣蛋白包括特異性結合於肝癌相關基因的表達產物的抗體，所述的肝癌相關基因選自下組Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48、Aldolase b或其組合。
本發明的主要優點在於本發明首次發現了新的肝癌相關基因，不僅填補了檢測的盲區，而且這些這些肝癌相關基因可作為肝癌診斷，基因治療，藥物治療的靶點。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1建立肝癌和癌旁正常肝組織的基因差異表達譜。
取在液氮中保存的肝癌和癌旁正常肝組織，按常規方法分離和提取總RNA。RNA的抽提用Trizol試劑(Life Teclonlogies，Inc，N.Y.，USA)。每50-100mg組織樣品，加入1ml Trizol，勻漿，室溫放置5分鐘；然後，加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩，充分混勻，室溫靜置2-3分鐘；12,000g，4℃離心15分鐘；吸取上清於另一Eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10分鐘。12,000g，4℃離心收集總RNA，沉澱用75％乙醇洗滌一次，抽乾，溶於無菌水中。總RNA經變性甲醛瓊脂糖電泳檢查無降價後，用於mRNA的製備。一次反應用200ug總RNA分離製備mRNA，mRNA的分離採用Oligotex mRNA minkit(Qiagen，Hilden，Germany)試劑盒。
cDNA微陣列採用LifeGrid 1.0微陣列膜購自Incyte Genomic公司，該膜含有約8千4百個cDNA的PCR產物和27個對照，按雙點模式，印在一個12×22cm的尼龍膜上。來自肝癌和癌旁正常肝組織的mRNA分別在a-33P dCTP存在的條件下，用逆轉錄生成33P-標記的cDNA探針。標記摻入百分比不小於40％。每個cDNA探針與微陣列雜交的條件見LifeGrid 1.0微陣列的說明書。雜交過夜後的膜，室溫晾乾，由磷屏儀(Phosphor image)曝光並掃描，掃描結果即雜交信號的計算機分析解讀由Incyte公司完成。
根據Incyte公司提供的計算機分析結果，獲得了肝癌和癌旁正常肝組織8400個基因的表達圖譜(圖1)。把正常肝組織和肝癌組織的基因表達譜進行對比，去除在正常肝組織和肝癌組織中都表達缺失的基因，去除相同cDNA兩個點差異大於2.5倍和一個點不到背景2倍的基因。最後，在正常肝組織和肝癌組織中，檢測到有6542個基因表達。通過比較分析發現在肝癌中有256個基因表達上調，267個表達下調，這些表達上調或下調基因都是指大於4倍的表達差異。從這些表達差異的基因中，選擇與細胞分裂、基因表達調控、信號傳導、代謝等有關的基因進行驗證。Beclin1，Lis1，Pir51，RbAp48，Aldolase b是在肝癌中高表達或低表達5個基因。
實施例2Beclin1，RbAp48，Aldolase b和Pir51四種基因在肝癌和癌旁正常組織中的表達檢測按實施例1的方法製備總RNA，用SuperscripII反轉錄酶(Life TechonlogiesInc，N.Y.，USA)製備cDNA，反轉錄條件按試劑盒說明，在20ul反應混合物中加入3ug總RNA。然後進行PCR擴增。根據表1提供的引物，按表1所列的條件進行PCR擴增，獲得相應基因的片段。β-actin編碼肌動蛋白的基因作為實驗對照。
(a)Northern印跡分析同位素α-32P-dCTP標記基因的片段作為探針，進行Northern印跡分析每個泳道約15ug來自肝癌組織或癌旁正常組織的總RNA經含甲醛的1％瓊脂糖凝膠電泳分離，然後轉移到Hybond-N+尼龍膜上(Amersham Pharmacia Biotech)。80℃，烤膜1小時，使RNA固定在膜上。在ExpressHyb雜交液(ClonTechInc，California，USA)中，68℃雜交3小時。用含0.1％SDS的2×SSC，室溫下洗膜一次，然後用含0.1％SDS的0.1×SSC，68度洗膜兩次，每次20分鐘，最後壓片1到6天，-80℃，放射自顯影。Northern blot的具體操作見Sambrook等人所著』分子克隆』實驗室手冊。
檢測結果見圖2，Beclin1、RbAp48和Aldolase b的檢測是採用Northern blot的方法，pir51的表達水平太低，採用更靈敏的PT-PCR的方法。Beclin1和RbAp48在腫瘤樣品中表達水平顯著上升，而正常肝組織中檢測不到；Aldolase b在70％所選腫瘤樣品中，其表達水平顯著降低。
(b)RT-PCR檢測方法首先將分離製備的總RNA反轉錄合成cDNA，然後用我們表1提供的基因特異的引物，進行半定量PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，比較電泳條帶的強弱，確定基因表達產物的高低。
結果顯示，pir51基因在60％所選腫瘤樣品中表達上調。
實施例3Beclin1，RbAp48，Aldolase b，和Pir51四種基因在肝癌細胞中的表達檢測用與實施例2相同的RT-PCR方法檢測了6種肝細胞系(L02，Bel-7404，SMMC-7721，Bel-7402，HuH7，HepG2)中Beclin1，RbAp48，pir51及Aldolase b的表達。
結果發現Beclin1在L02，Bel-7402，HepG2，SMMC-7721四種細胞中表達，在Bel-7404，Huh7二種細胞中不表達；RbAp48在L02，Bel-7404，Huh7，HepG2，Bel-7402五種細胞中表達，在SMMC-7721細胞中不表達；Pir51在L02，Bel-7402，Bel-7404，SMMC-7721，HepG2五種細胞中都表達，在HuH7細胞中不表達；而Aldolase b只在HepG2細胞中有微弱表達，其它肝癌細胞中不表達。這個結果與組織樣品中的檢測結果是吻合的，即Beclin1，RbAp48和Pir51在大部分肝癌細胞中表達，而Aldolase b在大部分肝癌細胞中不表達或低表達(圖3)。
實施例4Lis1基因在肝癌和癌旁組織中的表達檢測我們採用Northern點印跡法檢測Lis1基因在肝癌和癌旁組織中的表達。按實施例1的方法製備總RNA，將各種來源的總RNA分別以每點5μg，10μg，20μg的量點在Hybond-N+尼龍膜上(Amersham Pharmacia Biotech)。80℃，烤膜1小時，使RNA固定在膜上。在ExpressHyb雜交液(ClonTech Inc，California，USA)中，68℃雜交3小時。用含0.1％SDS的2×SSC，室溫下洗膜一次，然後用含0.1％SDS的0.1×SSC，68度洗膜兩次，每次20分鐘，最後壓片1到3天，-80℃，放射自顯影。Northern Dot Blot的具體操作見Sambrook等人所著的《分子克隆實驗室手冊》。
實驗結果顯示Lis1基因在肝癌組織中表達上調，正常肝組織和癌旁組織中不表達或低表達(圖4)。
實施例5肝癌易感性檢測試劑盒製備一試劑盒，它含有名稱 Beclin1引物 濃度正向引物 SEQ ID NO1 乾粉20D反向引物 SEQ ID NO2 乾粉20DPCR反應液含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應緩衝液實施例6肝癌易感性檢測試劑盒製備一試劑盒，它含有名稱 Lis1引物 濃度正向引物 SEQ ID NO3 乾粉20D反向引物 SEQ ID NO4 乾粉20DPCR反應液含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應緩衝液實施例7肝癌易感性檢測試劑盒製備一試劑盒，它含有名稱 Pir51引物濃度正向引物 SEQ ID NO5 乾粉20D反向引物 SEQ ID NO6 乾粉20DPCR反應液含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應緩衝液實施例8肝癌易感性檢測試劑盒製備一試劑盒，它含有名稱 RbAp48引物 濃度正向引物 SEQ ID NO7 乾粉20D反向引物 SEQ ID NO8 乾粉20D
PCR反應液 含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應緩衝液實施例9多檢測因子的肝癌易感性檢測試劑盒製備一試劑盒，它含有名稱 Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48的引物 濃度正向引物 SEQ ID NO1，3，5，7 各乾粉20D反向引物 SEQ ID NO2，4，6，8 各乾粉20DPCR反應液含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應緩衝液實施例10肝癌易感性檢測試劑盒製備一試劑盒，它含有名稱 Aldolase b(醛縮酶b)的引物 濃度正向引物 SEQ ID NO9乾粉20D反向引物 SEQ ID NO10 乾粉20DPCR反應液含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應緩衝液取待檢測男性病人的少量肝細胞，使用常規方法(或使用特定的試劑盒)從肝細胞中提取mRNA，反轉錄成cDNA。將實施例5-9肝癌檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到1μmol/μl，以所獲得的cDNA為模板與所提供的引物進行PCR反應。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，比較電泳條帶的強弱，確定基因表達產物的高低。
檢測結果，Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48表達量上調以及醛縮酶b表達量下調表示肝癌易感性高於正常人群。
實施例11多檢測因子的肝癌易感性檢測試劑盒製備一試劑盒，它含有名稱 Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48 濃度和Aldolase b的引物正向引物SEQ ID NO1，3，5，7，9 各乾粉20D反向引物SEQ ID NO2，4，6，8，10 各乾粉20DPCR反應液 含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應緩衝液在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110中國科學院上海生命科學研究院120肝癌組織特異表達基因及其應用13003356116012170PatentIn version 3.1210121122212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4001cttaccacag cccaggcgaa ac22210221120212DNA213人工序列220
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221misc_feature223引物40012cttagaagca ttgcggtgga cgatg 2權利要求
1.一種體外檢測待測細胞中肝癌相關基因表達水平是否上調的方法，其特徵在於，它包括步驟(a)檢測待測細胞中肝癌相關基因的表達水平，其中所述的肝癌相關基因選自Beclin 1、Lis 1、Pir51、RbAp48、或其組合；(b)將待測細胞中肝癌相關基因的表達水平與對照相比較，從而確定肝癌相關基因表達水平是否上調。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(b)中判斷上調的標準是肝癌相關基因的表達水平比正常人群中肝癌相關基因的表達水平高1.5-100倍。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(b)中判斷上調的標準是肝癌相關基因的表達水平比正常人群中肝癌相關基因的表達水平高3-50倍。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在步驟(a)中檢測Beclin 1、Lis 1、Pir51、RbAp48中2-4種肝癌相關蛋白。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(a)中的待測細胞是肝細胞。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(a)中的檢測是通過核酸晶片檢測法、半定量PCR法、定量PCR法、蛋白質晶片檢測法、或抗原-抗體檢測法進行。
7.一種檢測腫瘤易感性的試劑盒，其特徵在於，它包括特異性擴增肝癌相關基因轉錄本的引物和說明書，所述的肝癌相關基因選自下組Beclin 1、Lis 1、Pir51、RbAp48、或其組合。
8.如權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於，所述的引物選自下組(i)Beclin 1特異性引物，所述引物具有SEQ ID NO1和2所示的序列；(ii)Lis 1特異性引物，所述引物具有SEQ ID NO3和4所示的序列；(iii)Pir51特異性引物，所述引物具有SEQ ID NO5和6所示的序列；(iv)RbAp48特異性引物，所述引物具有SEQ ID NO7和8所示的序列。
9.一種檢測腫瘤易感性的試劑盒，其特徵在於，它包括特異性結合於肝癌相關基因的表達產物的抗體和說明書，所述的肝癌相關基因選自下組Beclin 1、Lis 1、Pir51、RbAp48、或其組合。
10.一種檢測腫瘤易感性的試劑盒，其特徵在於，它包括檢測肝癌相關基因的晶片和說明書，所述晶片選自下組(a)DNA晶片，所述晶片具有基片和點樣子基片上點樣區的點樣DNA，所述的點樣DNA包括特異性結合於肝癌相關基因轉錄本的探針，所述的肝癌相關基因選自下組Beclin 1、Lis 1、Pir51、RbAp48、或其組合；(b)蛋白質晶片，所述晶片具有基片和點樣於基片上點樣區的點樣蛋白，所述的點樣蛋白包括特異性結合於肝癌相關基因的表達產物的抗體，所述的肝癌相關基因選自下組Beclin 1、Lis 1、Pir51、RbAp48、或其組合。
全文摘要
本發明提供了一種對個體的腫瘤(如肝癌)易感性進行診斷的方法它包括步驟檢測該個體的肝癌相關基因的表達水平，並與正常人群中肝癌相關基因的表達水平相比較，存在差異就表明該個體患腫瘤的可能性高於正常人群，其中所述的肝癌相關基因選自Beclin 1、Lis 1、Pir51、RbAp48或其組合，所述的差異是表達上調。本發明還提供了相應的檢測試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1635144SQ200310124560
公開日2005年7月6日 申請日期2003年12月31日 優先權日2003年12月31日
發明者趙慕鈞, 宋海, 夏雙絡, 王冀飛, 李載平 申請人:中國科學院上海生命科學研究院