用於治療IL-1β相關疾病的方法

2023-12-08 23:19:51

專利名稱：用於治療IL-1β相關疾病的方法
本申請根據35 U.S. C. §119要求於2006年12月20日提交的美國臨 時申請號60/871,046，於2007年3月27日提交的美國臨時申請號 60/908,389,和於2007年4月10日提交的美國臨時申請號60/911,033的 利益，所述專利的公開內容整體引入本文作為參考。發明領域本發明涉及用於治療和/或預防2型糖尿病、肥胖、高血糖症、高胰島 素血症、1型糖尿病、胰島素抗性以及特徵在於胰島素抗性的疾病狀態和 病症的方法。此種方法可以用於治療患有2型糖尿病、肥胖、高血糖症、 高胰島素血症、1型糖尿病、胰島素抗性以及特徵在於胰島素抗性的疾病 狀態和病症的哺乳動物受試者，或預防其在風險受試者中的發生。發明背景本公開涉及用於治療和/或預防哺乳動物中的2型糖尿病、肥胖、高血 糖症、高胰島素血症、1型糖尿病、胰島素抗性以及特徵在於胰島素抗性 的疾病狀態和病症的方法。此種方法可以用於治療患有2型糖尿病、肥胖、 高血糖症、高胰島素血症、1型糖尿病、胰島素抗性以及特徵在於胰島素 抗性的疾病狀態和病症的哺乳動物(例如人)受試者，或預防其在風險受 試者中的發生。糖尿病是在一般群體中具有約1%的流行率的人代謝病症(Foster, D. W., Harrison's Principles of Internal Medicine, 第114章,第661-678 頁，第IO版，McGraw-Hill, New York)。該疾病自身表現為一系列激 素誘導的代謝異常，其最終導致牽涉數個器官系統(包括眼、腎、神經和血管)的、使人衰弱的、嚴重長期併發症。在病理學上，該疾病的特徵在於在電子顯微鏡下可見的基底膜損傷。糖尿病可以分成2種臨床症候群，1 型和2型糖尿病。1型或胰島素依賴型糖尿病(IDDM)也稱為幼年型， 是慢性自身免疫疾病，其特徵在於胰島中產生胰島素的P細胞的大量喪失。 因為這些細胞被漸進地破壞，所以分泌的胰島素量減少，當胰島素分泌量 降低到正常所需的血液葡萄糖水平下時，最終導致高血糖症(在血中異常 高水平的葡萄糖)。儘管關於這種免疫應答的確切觸發因素未知，但IDDM 患者具有高水平的抗胰P細胞中表達的蛋白質的抗體。然而，並非具有高 水平的這些抗體的所有患者都發展IDDM。1型糖尿病特徵性地顯示極低或不可測量的血漿胰島素並伴隨升高的 胰高血糖素。不管確切病因是什麼，大多數l型患者具有針對其自身胰細 胞的循環抗體，包括針對胰島素、郎格罕氏島細胞的細胞質和穀氨酸脫羧 酶的抗體。特異地針對p細胞(胰島素生產細胞)的免疫應答導致1型糖 尿病。用於l型糖尿病患者的目前療法是胰島素注射，也可以包括對膳食 的改變，以便使起因於天然胰島素缺乏(其反過來又源自p細胞損傷)的 高血糖症降到最低。也可以就胰島素的施用來改變膳食，以抵消該激素的低血糖效應o當肌肉、脂肪和肝細胞無法正常地響應胰島素時，發生2型糖尿病(也 稱為非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)、成年發病型、成年型)。這種無 法響應(稱為胰島素抗性)的原因可能是這些細胞上胰島素受體數目的減 少，或細胞內信號途徑的功能障礙，或兩者。p細胞最初通過增加胰島素 輸入量來補償這種胰島素抗性。隨著時間的過去，這些細胞變得無法產生 足夠的胰島素以維持正常的葡萄糖水平，從而指示逸艮至2型糖尿病。2 型糖尿病由遺傳的和獲得性的危險因素組合引起，包括高脂肪膳食、缺乏 鍛鍊和衰老。糖尿病群體中超過90%的患有2型糖尿病，並且該發病率持 續上升，正在成為M界死亡、發病和健康護理消費的主要因素(Amos 等人，Diabetic Med. 14: S1-85, 1997)。2型糖尿病是特徵在於葡萄糖和脂質代謝缺陷的複雜疾病。 一般地存在許多代謝參數的擾亂，包括空腹血漿葡萄糖水平、游離脂肪酸水平和甘油三酯水平上的增加，以及HDL/LDL比率的降低。如上所述，糖尿病的 一個主要根本病因被認為是外周組織，主要是肌肉和脂肪中胰島素抗性的 增加。2型糖尿病的病因尚未獲得充分了解。據認為，既發生靶組織對胰 島素作用的抵抗也發生減少的胰島素分泌("P細胞衰竭")。負責胰島素 體內穩態的主要胰島素應答組織是肝，在其中胰島素刺激糖原合成且抑制 糖異生；肌肉，在其中胰島素刺激葡萄糖攝取和糖原刺激葡萄糖攝取且抑 制脂解。因此，作為糖尿病的結果，血液中存在升高水平的葡萄糖，這可 以導致葡萄糖介導的細胞毒性和隨後的發病(腎病、神經病、視網膜病等)。 胰烏素抗性與2型糖尿病的t艮強相關。目前，存在用於治療2型糖尿病的各種藥理學方法(Scheen等人， Diabetes Care， 22 (9) : 1568-1577， 1999)。它們經由不同作用才莫式而 發揮作用1 )磺醯脲類(例如，格列美脲(glimepiride)、格列生脲(glisentide)、 磺醯脲(sulfonylurea)、 AY31637 )實質性地刺激胰島素分泌；2 )雙胍類(例 如，二甲雙胍(metformin))通過促進葡萄糖利用、降低肝臟葡萄糖生產和 減少腸道葡萄糖輸出而發揮作用；3) a-葡糖苷酶抑制劑(例如，阿卡波糖 (acarbose)、米格列醇(miglitol))減緩碳7JC化合物消化和由此自腸道的吸收 和減少餐後高血糖；4)瘞唑烷二酮類(例如，曲格列酮(troglitazone)、吡 格列酮(pioglitazone)、羅格列酮(rosiglitazone)、格列吡漆(glipizide)、巴格 歹'J嗣(balaglitazone)、 利格歹'J酉同(rivoglitazone)、茶格歹0酉同(netoglitazone)、 曲格列酮(troglitazone)、恩格列酮(englitazone)、 AD 5075、 T 174、 YM268、 R 102380、 NC2100、 NIP 223、 NIP 221、 MK0767、環格列酮(ciglitazone)、 adaglitazone、 CLX0921、達格列酮(darglitazone)、 CP 92768、 BM 152054)增強胰島素作用，由此促進外周組織中的葡萄糖利用；5)胰高血糖素樣肽， 包括DPP4抑制劑(例如，西他列汀(sitagliptin));和6)胰島素刺激組 織葡萄糖利用和抑制肝臟葡萄糖輸出。上述藥理學方法可以單個地或以聯 合療法來利用。然而，每種方法具有其局限性和不良反應。隨著時間過去， 大部分2型糖尿病受試者會喪失其對這些活性劑的反應。胰島素治療一般開始於膳食、鍛鍊和口服藥物無法充分地控制血液葡萄糖之後。胰島素治 療的缺點是需要藥物注射、低血糖症的可能性和體重增長。IL-lj3是由許多不同細胞類型，包括單核細胞和巨噬細胞，分泌的促 炎細胞因子。當作為炎症反應的一部M放時，IL-ip造成一系列生物效 應，這主要通過誘導其他炎症介質來介導，所述其他炎症介質例如促腎上 腺皮質激素、血小板因子-4、前歹寸腺素E2 (PGE2) 、 IL-6和IL-8。 IL-1卩 通過激活IL-1受體(其存在於幾乎所有細胞類型上)，誘導局部和全身的 炎症效應。白介素-1 (IL-1)細胞因子家族已被提示牽涉許多疾病狀態。 IL-1家族成員包括IL-la、 IL-ip和IL-lRa。儘管通過其與IL-1受體 (IL-1R1和IL-1R2 )結合的能力而相關聯，但這些細胞因子的每一個都 是不同的，由不同基因表達且具有不同的一級M酸序列。此外，這些細 胞因子的生理活性可以彼此區分。已公開了指示IL-ip明顯牽涉於糖尿病 中的實驗。Maedler等人，J Clin Invest ( 2002 ) 110: 851-860提示在2型糖尿病 中慢性高血糖症可能損害胰p-細胞，引起受損的胰島素分泌，而且指出 IL-ip是在1型糖尿病的自身免疫過程中發揮作用的促炎細胞因子，並且 可以抑制P細胞功能。特別地，他們檢驗了如下假設IL-lj5可能介導高 葡萄糖水平的有害作用。用根皮苷(phlorizin)治療糖尿病動物使血漿葡萄 糖正常化，且阻止p細胞表達IL-1(5。據說這牽涉2型糖尿病中葡萄糖毒 性(glucotoxicity)的發病機理的炎症過程，並且他們將IL-ip/NF-KB途徑鑑 定為在這種病症中保存p細胞的量和功能的標耙。Donath等人，J Mol med (2003) 81: 455-470指出IL-lp在胰島p誦 細胞死亡的凋亡途徑(這導致胰島素不足和糖尿病)中的明顯意義，並且 提出了在1型和2型糖尿病中設計以阻斷P-細胞凋亡的抗炎治療方法。WO 2004/002512涉及IL-1受體拮抗劑(IL-lRa )和/或吡咯烷二石克代 氨甲酸酯(PDTC)用於治療或預防2型糖尿病的用途。然而，針對IL-Ra 多肽在2型糖尿病治療中的治療性應用所建議的頻率給藥(每24小時注射 一次)，可能導致患者M性的問題，從而降低這種治療形式的有效性和/或限制對其的需求。因此，仍需要用於治療2型糖尿病的有效方法，特別 是不需要爭天注射的那些方法。Larsen等人，New England Journal of Medicine( 2007 )356: 1517-1526 描述了重組IL-1受體拮抗劑(IL-lRa、阿那白滯素(anakinra))用於治療 2型糖尿病的用途。然而，每天1次100 mg阿那白滯素給藥持續13周可 能導致患者M性的問題，從而降低這種治療形式的有效性和/或限制對其 的需求。因此，仍需要治療2型糖尿病的有效方法，特別是不需要頻繁(例 如，每天)注射的治療方法。US 2005/0256197和US 2005/0152850涉及用於促進受試者(例如，患 有糖尿病的受試者)中的代謝控制(例如葡萄糖)的方法，其包括，特別 是通過4吏用抗炎劑，例如抗炎性酮咯酸含漱液(ketorolac oral rinse)，減少 受試者齦縫液中的IL-ip水平，從而減少循環TNF水平。肥胖是高度流行的慢性疾病，其不僅與社會歧視有關，還與減少的壽 命和眾多醫學問題有關，所述醫學問題包括不良心理t艮，皮膚病學病症 例如感染、靜脈曲張、運動不耐性、糖尿病、胰島素抗性、高血壓、高膽 固醇血症和冠心病(Rissanen等人，British Medical Journal, 301: 835-837， 1990)。實驗動物和人中，肥胖與胰島素抗性和糖尿病高度相關。事實上， 肥胖和糖尿病抗性(其中後者一般伴隨高胰島素血症或高血糖症，或兩者) 是2型糖尿病的標誌。此外，2型糖尿病與冠狀動脈疾病的2或4倍風險 相關。儘管對這些嚴重健康問題研究了數十年，但肥胖和胰島素抗性的病 因仍是未知的。胰島素抗性與眾多疾病狀態和病症相關，並且存在於約30-40%的非 糖尿病個體中。這些疾病狀態和病症包括但不限於，前驅糖尿病和代謝症候群(也稱為胰島素抗性症候群)。前驅糖尿病是特徵在於葡萄糖耐量降 低(IGT)或空腹葡萄糖受損(IFG)的異常葡萄糖耐量狀態。具有前驅 糖尿病的患者是胰島素抵抗的，並且處於將來#成顯性2型糖尿病的高 風險中。代謝症候群是相關的一簇性狀，其包括但不限於，高胰島素血症、 異常葡萄糖耐量、肥胖、脂肪重分布至腹部或上身區室、高血壓、異常纖維蛋白溶解(dysfibrinolysis)和血脂異常(特徵在於高甘油三酯、低HDL-膽 固醇和小而密的LDL顆粒)。胰島素抗性已與所有這些性狀聯繫在一起， 提示代謝症候群和胰島素抗性彼此緊密相關。代謝症候群的確診是將來發 生2型糖尿病以及加速的動脈粥樣硬化(導致心臟病發作、中風和外周血 管疾病)的強大危險因素。炎性細胞因子，包括IL-1，已顯示在脂肪組織 內介導炎症，這看起來涉及脂肪細胞的胰島素抗性(Trayhurn等人，Br. J. Nutr. 92: 347-355， 2004; Wisse， J. Am. Soc. Nephrol. 15: 2792-2800， 2004; Fantuzzi, J. Allergy Clin. Immunol. 115: 911-919, 2005; Matsuzawa, FEBS Lett. 580: 2917-2921， 2006; Greenberg等人，Eur J. Clin. Invest 32 Suppl.3: 24-34, 2002; Jager等人，Endocrinology 148: 241-251, 2007)。 脂肪細胞是貯存脂肪且分泌脂動素(adipokine)(即，細胞因子的一個亞組) 的細胞，並且是脂肪組織的主要組分。巨噬細胞，作為炎症細胞和炎性細 胞因子(IL-1、 TNF -a和IL-6)的主要生產者，也存在於脂肪組織內， 特別是與肥胖相關的發炎脂肪組織(Kern等人，Diabetes 52: 1779-1785， 2003 )。先前已知TNF-a和IL-6使脂肪細胞對胰島素刺激脫敏(即，胰 島素抗性)。因為與目前治療相關的問題，需要治療2型糖尿病和其他疾病適應症 例如本文公開的那些適應症的新療法，以替換或補充現有的醫學方法。本 發明提供用於治療2型糖尿病的方法。此夕卜，本發明還提供用於治療肥胖、 高血糖症、高胰島素血症、1型糖尿病、胰島素抗性以及特徵在於胰島素 抗性的疾病狀態和病症的方法。本文/>開的方法包括例如，施用抗IL-ip 抗體或其片段。用抗體，特別是顯示高親和力的抗體，直接靶向IL-ip配 體的方法，提供了超過其他潛在治療方法，例如IL-ip受體拮抗劑(例如， IL-lRa、阿那白滯素、Kineret )的優點。對基於IL-1受體拮抗劑的療法 的挑戰是需要此種治療劑佔據大量的受體，而這是一個艱巨的任務，因為 這些受體廣泛地表達在除紅細胞外的所有細胞上(Dinarello， Curr. Opin. Pharmacol. 4: 378-385, 2004)。在大多數免疫介導疾病，例如本文公開 的疾病中，體液中可測量的或與活化細胞相關的IL-ip細胞因子量相對較較好的策略，特別 是當施用具有高親和力的IL-ip抗體時。 發明概述;^/>開涉及用於治療和/或預防哺乳動物中的2型糖尿病、肥胖、高血糖症、高胰島素血症、胰島素生成減少、l型糖尿病、胰島素抗性和/或特 徵在於胰島素抗性的疾病狀態和病症的方法。此種方法可以用於治療患有如下疾病或有罹患如下疾病的風險的哺乳動物(例如，人)受試者糖尿 病、肥胖、高血糖症、高胰島素血症、胰島素生成減少、胰島素抗性和/ 或特徵在於胰島素抗性的疾病狀態和病症。該方法也可以用於風險受試者 中預防2型糖尿病、l型糖尿病、肥胖、高血糖症、高胰島素血症、胰島 素生成減少、胰島素抗性以及特徵在於胰島素抗性的疾病狀態和病症的發 生。在一個方面，本發明涉及在人中治療選自下述的疾病或病症的方法 2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、肥胖、胰島素生成減少、l型糖尿 病和胰島素抗性，該方法包括給人施用抗IL-1(5抗體或其片段。在一個優 選實施方案中，疾病或病症選自2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、 肥胖、胰島素生成減少和胰島素抗性。優選地，疾病或病症是2型糖尿病、 肥胖、胰島素生成減少或胰島素抗性。更優選地，疾病或病症是2型糖尿 病、肥胖或胰島素抗性。最優選地，疾病或病症是2型糖尿病。在一個實 施方案中，該方法不增加心血管疾病或病症。在某些實施方案中，抗體或 片段用於治療同一患者(例如，人受試者)中的2種或更多種上述疾病或病症。在另一個方面，本發明提供通過施用抗IL-ip抗體或片段用於治療或 預防疾病或病症的方法，其中疾病或病症是前驅糖尿病、血脂異常、高脂 血症、高血壓、代謝症候群或病態行為(sickness behavior)。在另外一個方 面，該方法在人中減少或預防選自下述的與2型糖尿病相關的併發症或病 症視網膜病、腎衰竭、心血管疾病和傷口癒合，該方法包括給人施用抗 IL-ip抗體或其片段。在某些實施方案中，抗體或片段用於治療同一患者(例如，人受試者)中的2種或更多種上述疾病或病症。在另一個實施方 案中，抗體或片段用於治療可能起因於2型糖尿病以外的病症的腎衰竭(例 如，腎疾病)。在另外一個實施方案中，抗體或片段用於在顯示升高水平 的C反應蛋白(CRP)的受試者中減少CRP的水平。在另一個方面，本發明提供用於在治療或預防如本文公開的疾病或病 症中使用的IL-ip抗體或其抗體片段。在一個進一步的方面，本發明提供 IL-ip抗體或其抗體片段，用於在治療或預防選自下述的疾病或病症中使 用2型糖尿病、肥胖、胰島素生成減少和胰島素抗性。在另外一個方面， 本發明提供IL-ip抗體或其抗體片段，用於在治療或預防2型糖尿病中使 用。在另一個方面，本發明提供包含IL-ip抗體或其抗體片段和任選地至 少一種藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物，用於在治療或預防如本文公 開的疾病或病症中使用。在一個進一步的方面，本發明提供包含IL-1J5抗 體或其抗體片段和任選地至少 一種藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物， 用於在治療或預防選自下述的疾病或病症中使用2型糖尿病、肥胖、胰 島素生成減少和胰島素抗性。在另外一個方面，本發明提供包含IL-ip抗 體或其抗體片段和任選地至少 一種藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物， 用於在治療或預防2型糖尿病中使用。在本發明的方法中使用的抗IL-ip抗體或抗體片段一般以高親和力與 IL-ip結合。在優選實施方案中，抗體或抗體片段與IL-ip結合，解離常 數為約10nM或更少、約5nM或更少、約lnM或更少、約500pM或更 少、約250pM或更少、約100pM或更少、約50pM或更少、或約25 pM 或更少。在特別優選的實施方案中，抗體或抗體片段與人IL-ip結合，解 離常數為約100pM或更少、約50pM或更少、約10pM或更少、約5pM 或更少、約3 pM或更少、約1 pM或更少、約0.75 pM或更少、約0.5 pM 或更少、約0,3pM或更少、約0.2pM或更少、或約0.1pM或更少。在特 別優選的實施方案中，抗體或抗體片段與人IL-ip結合，解離常數為約IO pM或更少。頁在本發明的另一個方面，抗IL-ip抗體或抗體片段是中和抗體。在另 一個方面，抗IL-1卩抗體或抗體片段與IL-ip表位結合，從而使得結合的 抗體或片段基本上允許IL-1(5與IL-1受體I (IL-1RI)結合。在另一個方 面，抗IL-lj5抗體或抗體片段與IL-ip結合，但基本上不阻止結合的IL-1卩 與IL-1受體I (IL-1RI)結合。在另一個方面，抗體或抗體片段與IL-la、 IL-lR或IL-lRa的結合不可檢測。在本發明的另外一個方面，抗體或抗體 片段與序列ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE ( SEQ ID NO: 1)中包 含的表位結合。在本發明的另外一個方面，抗體或抗體片段與IL-lj5中包 含Glu64的表位結合。在本發明的另外一個方面，抗體或抗體片段與IL-ip N末端的胺基酸l-34結合。優選地，抗體或抗體片段是人工程化的、人源 化的或人的。在另一個方面，本發明提供治療表現出任何上述疾病或病症(例如， l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、肥胖、胰島素生成減 少、胰島素抗性)的症狀、或有發展出任何上述疾病或病症的風險的人的 方法，該方法包括在一個或多個劑量中向人施用抗IL-ip抗體或其片段。在本發明的另一個方面，提供用於在人中治療選自下述的疾病或病症 的方法l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、肥胖、胰島 素生成減少和胰島素抗性，該方法包括給人施用抗IL-ip抗體或其片段， 其中在施用IL-ip抗體或抗體片段的初始劑量後施用一個或多個後續劑 量。在一個實施方案中，施用抗體或抗體片段的初始劑量後施用2個或更 多個後續劑量。在另一個實施方案中，施用抗體或抗體片段的初始劑量後 施用 一個或多個後續劑量，其中所述一個或多個後續劑量在量上約等於或 小於初始劑量。在另一個實施方案中，施用抗體或抗體片段的初始劑量後 施用 一個或多個後續劑量，其中至少一個後續劑量在量上超過初始劑量。在一個實施方案中，施用2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個 或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、 或11個或更多個後續劑量的抗體。在另一個實施方案中，初始劑量和一個 或多個後續劑量之每一個的施用彼此分開，間隔至少約2周、至少約3周、至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5 個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至 少約10個月、至少約ll個月、或至少約12個月。在另一個實施方案中，抗體或片段以一個或多個劑量施用，所述劑量 為5mg/kg或更少的抗體或片段、3mg/kg或更少的抗體或片段、2 mg/kg 或更少的抗體或片段、1 mg/kg或更少的抗體或片段、0.75 mg/kg或更少 的抗體或片段、0.5 mg/kg或更少的抗體或片段、0.3 mg/kg或更少的抗體 或片段、0.1 mg/kg或更少的抗體或片段、或0.03 mg/kg或更少的抗體或 片段。優選地，在每一個上述實施方案中，抗體或片段以一個或多個劑量 施用，所述劑量為至少0.01 mg/kg抗體或片段、至少0.03 mg/kg抗體或片 段、至少0.05mg/kg抗體或片段、或至少0.09mg/kg抗體或片段。上述劑 量指mg (抗體或片段)/kg (待治療個體的重量)。在另 一個實施方案中，抗體或片段的初始劑量和一個或多個後續劑量 各自為約0.01 mg/kg -約10 mg/kg抗體、約0.05 -約5 mg/kg抗體、約0.05 mg/kg -約3 mg/kg抗體、約0.1 mg/kg誦約3 mg/kg抗體、約0.1 mg/kg -約 1 mg/kg抗體、約0.1 mg/kg -約0.5 mg/kg抗體、約0.3 mg/kg -約5 mg/kg 抗體、約0.3 mg/kg-約3 mg/kg抗體、約0.3 mg/kg-約1 mg/kg抗體、約 0.5 mg/kg -約5 mg/kg抗體、約0.5 mg/kg -約3 mg/kg抗體、約0.5 mg/kg -約1 mg/kg抗體、約1 mg/kg -約5 mg/kg抗體、或約1 mg/kg -約3 mg/kg 抗體。在某些實施方案中，施用2個或更多、3個或更多、4個或更多、5 個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、IO個或更 多、或ll個或更多個後續劑量的抗體。上述劑量指mg(抗體或片段)/kg (待治療個體的重量)。在下文中如果提及劑量，那麼這同樣應用。在另一個方面，本發明提供在人中治療選自下述的疾病或病症的方 法l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、肥胖、胰島素生 成減少和胰島素抗性，該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-1卩抗體或 其片段，方式是約5mg/kg或更少的抗體或片段的初始劑量，和多個在量 上約等於或小於該初始劑量的抗體或片段的後續劑量，其中後續劑量通過至少2周的時間間隔分開。在另一個方面，本發明提供治療人的選自下述的疾病或病症的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性，該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段，方式是約3 mg/kg或更少的抗體或片段的初始劑量，和多個在量上約 等於或小於該初始劑量的抗體或片段的後續劑量，其中後續劑量通過至少 2周的時間間隔分開。在另 一個方面，本發明提供治療人的選自下述的疾病或病症的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性，該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-1(J抗體或其片 段，方式是約1 mg/kg或更少的抗體或片段的初始劑量，和多個在量上約 等於或小於該初始劑量的抗體或片段的後續劑量，其中後續劑量通過至少 2周的時間間隔分開。在另一個方面，本發明提供治療人的選自下述的疾病或病症的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性，該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段，方式是約0.5 mg/kg或更少的抗體或片段的初始劑量，和多個在量上 約等於或小於該初始劑量的抗體或片段的後續劑量，其中後續劑量通過至 少2周的時間間隔分開。在另一個方面，本發明提供治療人的選自下述的疾病或病症的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性，該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段，方式是約0,3 mg/kg或更少的抗體或片段的初始劑量，和多個在量上 約等於或小於該初始劑量的抗體或片段的後續劑量，其中後續劑量通過至 少2周的時間間隔分開。在另 一個方面，本發明提供治療人的選自下述的疾病或病症的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性，該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片段，方式是約O.l mg/kg或更少的抗體或片段的初始劑量，和多個在量上 約等於或小於該初始劑量的抗體或片段的後續劑量，其中後續劑量通過至 少2周的時間間隔分開。優選地，在抗體或片段以初始劑量和多個後續劑量的方式進行施用的 上述實施方案中，抗體或片段的劑量是至少0.01 mg/kg抗體或片段、至少 0.03 mg/kg抗體或片段、至少0.05 mg/kg抗體或片段、或至少0.09 mg/kg 抗體或片段。在本發明的另外一個方面中，抗體或片段以固定劑量施用，與劑量/ 受試者重量比無關。在一個實施方案中，抗體或片段以一個或多個固定劑 量施用，所述固定劑量為1000mg或更少的抗體或片段、750mg或更少的 抗體或片段、500 mg或更少的抗體或片段、250mg或更少的抗體或片段、 100mg或更少的抗體或片段、或約25mg或更少的抗體或片段。在另一個 實施方案中，抗體或片段以一個或多個固定劑量進行施用，所述固定劑量 為至少約1 mg抗體或片段、至少約5mg抗體或片段、或至少約10mg抗 體或片段。在某些實施方案中，固定劑量是約1 mg-約10 mg、約1 mg-約25 mg、 約10 mg-約25 mg、約10 mg-約50 mg、約10 mg-約100 mg、約25 mg-約50 mg、約25 mg-約100 mg、約50 mg-約100 mg、約50 mg-約150 mg、 約100 mg-約150 mg、約100 mg-約200 mg、約150 mg-約200 mg、約150 mg-約250 mg、約200 mg-約250 mg、約200 mg-約300 mg、約250 mg-約300 mg、約250 mg-約500 mg、約300 mg-約400 mg、約400 mg-約500 mg、約400 mg-約600 mg、約500 mg-約750 mg、約600 mg-約750 mg、 約700 mg-約800 mg、約750 mg-約1000 mg。在一個優選實施方案中，固 定劑量選自約1 mg-約10 mg、約1 mg-約25 mg、約10 mg-約25 mg、約 10 mg畫約100 mg、約25 mg-約50 mg、約50 mg-約100 mg、約100 mg-約150mg、約150 mg-約200 mg、約200 mg-約250 mg。在另一個方面，本發明提供治療人的選自下述的疾病或病症的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、肥胖、胰島素生成減少和胰島素抗性，該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段，其中施用抗體或抗體片段的初始劑量後施用一個或多個後續劑量，且 其中在用所述初始劑量和一個或多個後續劑量的治療過禾呈中，對於兩次施 用之間大於約1周和小於約6個月的時間段，所述抗體或抗體片段在人中 的血漿濃度^L允許減少至低於約0.1 ug/mL的水平。在一個實施方案中， 對於兩次施用之間大於約l周和小於5個月、約4個月、約3個月、約2 個月、約1個月、約3周、或約2周的時間段，所述抗體或抗體片段的血 漿濃度被允i午減少至4氐於約0.07 ug/mL、約0.05 ug/mL、約0.03 ug/mL或 約0.01 ug/mL的水平。在一個實施方案中，這些血漿值指從利用本發明的 抗體或片段治療的個體中獲得的值。在一個實施方案中，所述個體可以是 患有下文提及的疾病之一例如2型糖尿病的患者。本發明考慮依照本文方法使用的抗IL-ip抗體或片段可以以任何上述 劑量、後續施用次數、和兩次施用間的給藥間隔進行施用，並且任何所公 開的劑量、後續施用次數和兩次施用間的給藥間隔可以在備選方案中彼此 組合，以調節治療益處。在某些實施方案中， 一個或多個後續劑量在量上 約等於或小於施用的第一個劑量。在另一個實施方案中， 一個或多個後續 劑量在量上約大於施用的第一個劑量。優選地，抗IL-1(3抗體或片段通過 皮下、肌內或靜脈內注射進行施用。本發明考慮，對於抗體或片段的每個 劑量，可以在一個或多個位點處進^f亍施用。在另一個方面，本發明提供使用抗IL-1|5抗體或抗體片段治療或預防人的疾病或病症的方法，其中疾病或病症是2型糖尿病，其中抗體或片段的劑量足以實現血紅蛋白Alc的至少0.5、至少1.0、至少1.5、至少2.0、至少2.5、或至少3.0個百分點的改善。在一個實施方案中，這些參數值指從利用本發明的抗體或片段治療的個體中獲得的值。在一個實施方案中， 此個體可以是患有下文提及的疾病之一例如2型糖尿病的患者。在一個優選實施方案中，該血紅蛋白Alc的改善足以符合用於批准治 療2型糖尿病的治療劑的管理指南。用於測定血紅蛋白Alc的試驗方法是 本領域眾所周知的。本發明考慮，足以實現血紅蛋白Alc改善的抗體或片段的給藥可以包括任何上述劑量、後續施用次數、和兩次施用間的給藥間 隔，以及本文描述的抗體或片段的劑量、後續施用次數和施用間的給藥間隔的任何組合。此外，血紅蛋白Alc的改善可以在最初施用抗體或片段的 一個或多個劑量後的至少約l個月、約2個月、約3個月、約4個月、或 約5個月、和優選地約6個月或更長、約7個月或更長、約8個月或更長、 約9個月或更長、約10個月或更長、約11個月或更長、或約12個月或更 長的時間點上出現。在用於治療或預防2型糖尿病的上述方法的另一個方面，該方法足以 實現至少一個下述改變空腹血糖水平的下降、胰島素抗性的下降、高胰 島素血症的減少、葡萄糖耐量的改善、C反應肽(CRP)的減少、胰島素 生成增加和高血糖症的減少、對糖尿病藥物需求的減少、BMI的降低、葡 萄糖/胰島素C肽AUC的改變、尿葡萄糖水平的降低、急性期反應物的減 少、血清脂質的減少以及就心血管風險而言的脂質譜的改善。用於測定任 何上述改變的試驗方法是本領域眾所周知的。此外，本發明還考慮，上述 改變之一可以在最初施用抗體或片段的一個或多個劑量後的至少約1個 月、約2個月、約3個月、約4個月、或約5個月、和優選地至少約6個 月或更長、約7個月或更長、約8個月或更長、約9個月或更長、約10 個月或更長、約ll個月或更長、或約12個月或更長的時間點上出現。在本發明的另一個方面，本文提供的方法減少或預防選自下述的與2 型糖尿病相關的併發症或病症視網膜病、腎衰竭、心血管疾病和傷口愈 合，該方法包括給人施用抗IL-ip抗體或其片段。在一個實施方案中，並 發症或病症是心血管疾病，其中所述心血管疾病是動脈粥樣硬化或外周血 管疾病。在另一個實施方案中，併發症或病症是傷口癒合，其中所述傷口 癒合病症是糖尿病性潰瘍。在另一個方面，該方法預防或延遲終末期腎疾 病或糖尿病神經病變。在一個實施方案中，抗IL-ip抗體或片段與用於該 疾病、病症或併發症的至少一種其他醫學上公認的治療進行組合施用。在 另一個實施方案中，減少或中斷所述用於該疾病、病症或併發症的至少一 種其他醫學上公認的治療 而以恆定給藥方案維持用抗IL-ip抗體或片段的治療。在另一個實施方案中，減少或中斷所述用於該疾病、病症或併發症的至少一種其他醫學上公認的治療，並且減少用抗IL-ip抗體或片段的 治療。在另一個實施方案中，減少或中斷所述用於該疾病、病症或併發症 的至少一種其他醫學上公認的治療，並且增加用抗IL-l卩抗體或片段的治 療。在另外一個實施方案中，維持所述用於該疾病、病症或併發症的至少 一種其他醫學上公認的治療，並且減少或中斷用抗IL-ip抗體或片段的治 療。在另外一個實施方案中，減少或中斷所述用於該疾病、病症或併發症 的至少 一種其他醫學上公認的治療以及用抗IL-1 p抗體或片段的治療。在本發明的另一個方面，提供在受試者中減少C反應蛋白的量的方法， 該方法包括給受試者施用抗IL-ip抗體或其片段。在一個實施方案中，抗 體或抗體片段以一個或多個劑量進行施用，所述劑量為1 mg/kg或更少的 抗體或片段、0.75mg/kg或更少的抗體或片段、0.5mg/kg或更少的抗體或 片段、0.3 mg/kg或更少的抗體或片段、0.1 mg/kg或更少的抗體或片段、 或0.03mg/kg或更少的抗體或片段。優選地，抗體或片段以一個或多個劑 量進行施用，所述劑量為至少0.01 mg/kg抗體或片段、至少0.03 mg/kg抗 體或片段、至少0.05 mg/kg抗體或片段、或至少0.09 mg/kg抗體或片段。 在另一個實施方案中，不依賴於劑量/受試者重量比，抗體或片段以一個或 多個固定劑量施用，所述固定劑量為500 mg或更少的抗體或片段、250 mg 或更少的抗體或片段、100mg或更少的抗體或片段、或約25mg或更少的 抗體或片段。優選地，抗體或片段以一個或多個固定劑量進行施用，所述 固定劑量為至少約lmg抗體或片段、至少約5mg抗體或片段、或至少約 10mg抗體或片段。在另一個實施方案中，抗體或抗體片段與IL-ip結合， 解離常數為約500pM或更少、250pM或更少、約100pM或更少、約50 pM或更少、或約25pM或更少、約10pM或更少、約5pM或更少、約 3pM或更少、約lpM或更少、約0.75pM或更少、約0.5pM或更少、 約0,3pM或更少、約0.2pM或更少、或約O.lpM或更少。在另一個實施 方案中，施用初始劑量後為施用一個或多個後續劑量(它們彼此通過至少 約2周、至少約3周、至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個 月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月、或至少約12個月的 間隔而分開)。在另一個實施方案中，提供在受試者中減少C反應蛋白的 量的所述方法，其中受試者患有腎疾病(例如，慢性腎疾病、腎衰竭)。 在另一個實施方案中，受試者患有2型糖尿病、l型糖尿病、肥胖、高血 糖症、高胰島素血症、胰島素生成減少、胰島素抗性以及特徵在於胰島素 抗性的疾病狀態和病症。在另一個實施方案中，受試者患有疾病或病症一 —前驅糖尿病、血脂異常、高脂血症、高血壓、代謝症候群或病態行為。 上述劑量指mg (抗體或片段)/kg (待治療個體的重量)。具有上述解離 常數的抗體或片段的施用可以依照任何上述劑量和給藥間隔(當施用2個 或更多個劑量時)來進行。在另一個方面，本文提供的方法與至少一種另外的治療方法聯合，所 述另外的治療方法包括施用至少 一種包含除IL-1 p抗體或片段外的活性劑 的藥物組合物。在另外一個方面，本發明方法阻止或延遲對至少一種另外 的治療方法的需求，所述另外的治療方法包括施用至少一種包含除IL-ip 抗體或片段外的活性劑的藥物組合物。在另外一個方面，本發明方法減少 至少一種另外的治療方法的量、頻率或持續時間，所述另外的治療方法包 括施用至少一種包含除IL-lp抗體或片段外的活性劑的藥物組合物。在一 個實施方案中，所述至少一種包含除IL-lj5抗體或片段外的活性劑的藥物 組合物選自磺醯脲類、氯茴苯酸類、雙胍類、a-葡糖普酶抑制劑類、瘞 唑烷二酮類、胰高血糖素樣肽和胰島素。在另一個實施方案中，活性劑是 磺醯脲類。在另一個實施方案中，活性劑是氯茴苯酸(meglitiiiide)類。在另 一個實施方案中，活性劑是雙胍類。在另一個實施方案中，活性劑是a-葡 糖苷酶抑制劑。在另一個實施方案中，活性劑是瘞唑烷二酮類。在另一個 實施方案中，活性劑是胰高血糖素樣肽。在另一個實施方案中，活性劑是 胰島素。在另一個實施方案中，所述至少一種包含活性劑的藥物組合物包 含2種活性劑。在一個實施方案中，該2種活性劑是磺醯脲類和雙胍類。 在另一個實施方案中，該2種活性劑是噻唑烷二酮類和雙胍類。在另外一個實施方案中，維持用該至少一種活性劑的治療。在另一個實施方案中， 減少或中斷用該至少 一 種活性劑的治療，而以恆定給藥方案維持用抗IL-lp抗體或片段的治療。在另一個實施方案中，減少或中斷用該至少一 種活性劑的治療，並且減少用抗IL-ip抗體或片段的治療。在另一個實施 方案中，減少或中斷用該至少一種活性劑的治療，而增加用抗IL-ip抗體 或片段的治療。在另外一個實施方案中，維持用該至少一種活性劑的治療， 並且減少或中斷用抗IL-ip抗體或片段的治療。在另外一個實施方案中， 減少或中新用該至少 一種活性劑的治療和用抗IL-1 (3抗體或片段的治療。在另一個方面，本發明提供治療人的選自下述的疾病或病症的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性，該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段，其中施用抗體或抗體片段的初始劑量後施用一個或多個後續劑量，其 中在用所述初始劑量和一個或多個後續劑量的治療過程中，所述抗體或抗 體片段在人中的血漿濃度維持在下述水平至少約0.03 ug/mL、至少約0.05 ug/mL、至少約0.08 ug/mL、至少約0.1 ug/mL、至少約0.15 ug/mL、至 少約0.2 ug/mL、至少約0.25 ug/mL、至少約0.3 ug/mL、至少約0.4 ug/mL、 至少約0.5 ug/mL、至少約0.6 ug/mL、至少約0.8 ug/mL、至少約1 ug/mL、 至少約1.5ug/mL、至少約2ug/mL、至少約3ug/mL、至少約4ug/mL、 或至少約5ug/mL。在一個實施方案中，這些血漿值指針對用依照本發明 的抗體或片段治療的個體獲得的值。在一個實施方案中，所述個體可以是 患有下文提及的疾病之一例如2型糖尿病的患者。在另 一個方面，本發明提供治療人的選自下述的疾病或病症的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性，該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段，其中給Aife用抗IL-ip抗體或其片段導致選自下述的一種或多種基因 產物的生產減少痩素(leptin)、抵抗素(resistin)、內脂素(visfatin)、 RANTES、 IL-6、 MCP畫1、 PAI-1、醯化刺激蛋白質、SAA3、 Pentraxin-3、 巨噬細胞移動抑制因子、IL-1RA、 IL-12、 IL-8和TNF-a。在一個實施方案中，給人施用抗IL-ip抗體或其片段導致選自下述的一種或多種基因產 物的生產減少瘦素、抵抗素和內脂素。在另一個實施方案中，給人施用 抗IL-1 p抗體或其片段導致選自下述的一種或多種基因產物的生產減少 MCP-1、 RANTES、 IL-6、 TNF-a和Pentraxin-3。在另外一個實施方案中， 所述一種或多種基因產物的生產減少來自脂肪組織。在另外一個實施方案中，在AJDL液中檢測所述減少。在另 一個方面，本發明提供治療人的選自下述的疾病或病症的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性，該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段，其中給A^用抗IL-ip抗體或其片段導致脂連蛋白生產的增加。在一 個實施方案中，所述脂連蛋白生產的增加來自脂肪組織。在另外一個實施 方案中，在Ajk液中檢測所述增加。在另 一個方面，本發明提供治療人的選自下述的疾病或病症的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性，該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段，其中在測量IL-ip誘導的IL-8生產的人全血IL-l(5抑制試驗中，抗體 或其片段具有比IL-ip受體拮抗劑低的ICso。在一個實施方案中，在測量 IL-lj3誘導的IL-8生產的人全血IL-ip抑制試驗中，抗體或片段具有低於 IL-lp受體拮抗劑的ICso的約卯。/q、 80%、 70%、 60%、 50%的1<:5。在 一個進一步的實施方案中，在測量IL-lp誘導的IL-8生產的人全血IL-1(5 抑制試驗中，抗體或片段具有低於IL-ip受體拮抗劑的ICso的約40。/。、 30 % 、 20 % 、 10 %的IC5q。在一個優選實施方案中，在測量IL-ip誘導的IL-8 生產的人全血IL-ip抑制試驗中，抗體或片段具有低於IL-ip受體拮抗劑 的ICso的約8。/。、 5%、 4%、 3%、 2%、 1%的1<:5。。在一個實施方案中， IL-ip受體拮抗劑是阿那白滯素(即Kineret )。在另一個方面，本發明提供治療人的選自下述的疾病或病症的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性，該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片等人，Nature Med, 9: 47-52 (2003 )(引入作 為參考)描述的試驗，與對照抗體比較，抗體或其片段在小鼠中體內抑制 IL-ip刺激的IL-6釋放。在一個實施方案中，與對照抗體比較，抗體或片 段在小鼠中針對IL-ip刺激的IL-6釋放提供至少約10% 、 20% 、 30% 、 40%、 50%的體內抑制。在一個進一步的實施方案中，與對照抗體比較， 抗體或片段在小鼠中針對IL-ip刺激的IL-6釋放提供至少約60 % 、 70 % 、 80%、 90%、 95%的體內抑制。在一個實施方案中，對照抗體是同種型對 照抗體。在另一個方面，本發明提供治療人的選自下述的疾病或病症的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性，該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段，其中，與未使用抗體的對照比較，抗體或其片段抑制人全血中表皮葡 萄球菌(S似/7/^/ococcws e盧Vfer附/flfc)誘導的細胞因子生產。在一個實施方 案中，與對照比較，抗體或片段針對人全血中表皮葡萄球菌誘導的細胞因 子生產提供高至少約10%、 20%、 30%、 40%、或50%的抑制。在一個進 一步的實施方案中，與對照比較，抗體或片段針對人全血中表皮葡萄球菌 誘導的細胞因子生產提供高至少約60%、 70%、 80%、卯％、 95%的抑制。 在一個實施方案中，抑制的細胞因子是IL-1(J、 IL-la、 IL-6、 IL-8、 IL-lRa、 TNFa或畫y。在另一個方面，本發明公開了抗IL-1(5抗體或其片段在製備組合物中 的用途，所述組合物用於治療1型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰 島素血症、肥胖、胰島素生成減少和胰島素抗性，其中，在測量IL-ip誘 導的IL-8生產的人全血IL-lj3抑制試驗中，所述抗體或其片段具有比IL-1卩 受體拮抗劑低的ic5。在一個實施方案中，IL-ip受體拮抗劑是阿那白滯 素(即Kineret )。在本發明的另一個方面，考慮了 IL-ip抗體或結合片段在製備藥物中 的用途，所述藥物用於治療或預防如本文7〉開的疾病或病症。在任何此類 用途中，藥物可以與4吏用第二活性劑的治療進行協調。在本發明的另一個實施方案中，考慮本發明抗體的協同組合用於製備藥物的用途，所述藥物 用於治療顯示出有發生如本文公開的疾病或病症的風險或症狀的患者，其 中藥物與使用第二活性劑的治療相協調。在另外一個相關實施方案中，提 供了這樣的組合物，其中第二活性劑是另一抗體、生長因子、細胞因子或
胰島素。考慮任何上述用途的實施方案，其中藥物中的IL-ip結合抗體或 片段的量為在有效減少達到療效所需的第二活性劑劑量的劑量上。
在本發明的另外一個方面，提供產品，其包含容器、在容器內包含抗 IL-lp抗體或其片段的組合物、和產品說明書，所述說明書包含有關根據 本發明的上述方法給需要治療的人施用抗體或片段的說明。在一個實施方 案中，容器進一步包含藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。在一個相 關實施方案中，容器內的組合物進一步包含第二活性劑。在另外一個相關 實施方案中，提供了這樣的組合物，其中第二活性劑是另一種抗體、生長 因子、細胞因子或胰島素。
本發明還考慮試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒包含包裝在容器例 如小瓶或瓶中的治療或預防有效量的抗IL-ip抗體或片段，並且進一步包 含與容器附著或與容器包裝在一起的標籤，所述標籤描述容器的內容物並 且提供關於容器內容物根據本發明的上述方法用於治療或預防疾病或病 症的指示和/或說明。在一個實施方案中，容器進一步包含藥學上可接受的 載體、賦形劑或稀釋劑。在一個相關實施方案中，容器進一步包含第二活 性劑。在另外一個相關實施方案中，第二活性劑包含另一種抗體、生長因 子、細胞因子或胰島素。
在一個實施方案中，產品、試劑盒或藥物用於治療或預防人的疾病或 病症，所述疾病或病症選自1型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島 素血症、肥胖、胰島素生成減少和胰島素抗性。在一個優選實施方案中， 疾病或病症選自2型糖尿病、肥胖和胰島素抗性。在另一個實施方案中， 產品的產品說明書和試劑盒的標籤上的說明包含根據任何上述劑量、後續 施用次數、和施用間給藥間隔、以及本文描述的劑量、後續施用次數和施 用間給藥間隔的任何組合來使用抗體或片段的說明。在另外一個實施方案中，試劑盒或產品的容器是預裝注射器。
應當理解當本說明書提及利用具有某種性質(例如Kd值或IC幼值) 的抗體或其片段的治療方法時，這也意味著涉及此種抗體或其片段在製備 用於這些方法的藥物中的用途。此外，本發明還涵蓋具有這些性質的抗體 或其片段，以及包含這些抗體或其片段的藥物組合物，用於在下文討論的 治療方法中。
附圖簡述


圖1顯示命名為AB7的抗體和Kineret⑧在體外IL-ip抑制實驗中的結 果，所述結果涉及IL-1誘導的IL-8生產。
圖2顯示命名為AB5和AB7的抗體在體內IL-ip抑制實驗中的結果， 所述結果涉及IL-1刺激的IL-6釋放。
圖2B顯示命名為AB7的抗體在體內IL-ip抑制實驗中的結果(該結 果涉及IL-1刺激的IL-6釋放)，並且比較了對人IL-ip的抑制(圖A ) 和對小鼠IL-1|5的抑制(圖B )。
圖3顯示在大鼠中施用0.1、 1或10 mg/kg抗IL-lp抗體後的血清濃度。
圖4顯示在食蟹猴(Cynomolgus monkey)中施用0.3或3 mg/kg抗 IL-ip抗體後的血清濃度。
圖5模建在0.1、0.3、 1或3 mg/kg的5個每月劑量後食蟹猴中抗IL-ip 抗體的血漿濃度分布曲線。
圖6的表格顯示由抗IL-ip抗體處理導致的、人全血中表皮葡萄球菌 誘導的細胞因子生產的減少。
圖7的曲線圖顯示施用0.01 mg/kg抗體劑量後AB7在人中的藥代動 力學。
圖8的曲線圖顯示在人中施用0.01 mg/kg劑量的AB7後對減少CRP 水平的作用。
圖9的曲線圖顯示在人中施用0.03 mg/kg劑量的AB7後對減少CRP水平的作用。
圖10的曲線圖顯示來自0.01和0.03 mg/kg劑量組的安慰劑對照中 CRP的水平。
圖11模建在人中以28天的間隔施用各種劑量的抗體(與AB7具有相 似性質)後對CRP水平的影響。
圖12顯示在2型糖尿病的膳食誘導的肥胖小鼠模型中AB7的作用。
發明詳述
IL-ip是由多種不同細胞類型(包括單核細胞和巨噬細胞)分泌的促 炎細胞因子。當作為炎症反應的一部^#放時，IL-ip導致一系列生物效 應，這主要通過i秀導其他炎症介質來介導，所述其他炎症介質例如促腎上 腺皮質激素、血小板因子-4、前列腺素E2 (PGE2) 、 IL-6和IL-8。 IL-ip 通過激活IL-1受體(其存在於幾乎所有細胞類型上)，誘導局部的和全身 的炎症效應。
細胞因子的白介素-1 (IL-1)家族已4皮提示牽涉幾種疾病狀態，例如 類風溼性關節炎(RA)、骨關節炎、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎(UC)、 膿毒性休克、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、移植物抗宿主病、動 脈粥樣硬化、成人T細胞白血病、多發性骨髓瘤、多發性硬化症、中風和 阿爾茨海默氏病。IL-1家族成員包括IL-la、 IL-1(5和IL-lRa。儘管由其 與IL-1受體(IL-1R1和IL-1R2 )結合的能力而相關聯，但這些細胞因子 的每一種都是不同的，由不同基因表達且具有不同的一級^Ju^列。此 外，這些細胞因子的生理活性可以彼此區分。
破壞IL-1受體信號的化合物已作為治療IL-1介導的疾病例如某些上 述疾病的治療劑進行研究。這些化合物包括重組IL-lRa (Amgen Inc.， Thousand Oaks， CA)、 IL國1受體"陷阱，，肽(Regeneron Inc., Tarrytown， NY)、以及動物衍生的IL-ip抗體和重組IL-ip抗體及其片段。
如上所述，IL-1受體拮抗劑(IL-lRa)多肽已被提出用於治療2型糖 尿病(WO 2004/002512 )，但仍需要治療2型糖尿病的有效方法，特別是不需要每日重複注射的那些。基於IL-1受體拮抗劑的治療所面對的另一個 挑戰是需要此種治療劑佔據大量受體，這是一個艱巨的任務，因為這些受 體廣泛地表達在除紅細胞外的所有細胞上(Dinarello， Curr. Opin. Pharmacol. 4: 378-385， 2004)。在大多數免疫介導的疾病例如本文^>開 的疾病中，在體液中可測量的或與活化細胞相關的IL-ip細胞因子的量相 對較低。因此，直接靶向IL-l卩配體的治療和/或預防方法是較好的策略， 特別是當施用具有高親和力的IL-1(3抗體時。
本發明提供4吏用IL-ip特異性抗體或其片段治療和/或預防哺乳動物中 的2型糖尿病、l型糖尿病、肥胖、高血糖症、高胰島素血症、胰島素生 成減少、胰島素抗性和/或特徵在於胰島素抗性的疾病狀態和病症的方法和 相關產品。
如下文實施例l中所示，已驚奇地發現此種抗體(例如，具有高親和 力)可以是比IL-Ra (例如，Kineret )強有力得多的IL-1途徑抑制劑， 並且如下文實施例9中所示，提供了以比其他藥物(例如重組IL-lRa)所 必需的劑量和/或施用頻率更低的劑量和/或更低的施用頻率來達到療效的 機會。
如本文所描述的利用IL-l(J抗體或片段的此種方法可以包括治療患有 2型糖尿病、l型糖尿病、肥胖、高血糖症、高胰島素血症、胰島素生成減 少(decreased insulin production)、低胰島素血症、胰島素抗性和/或特徵在 於胰島素抗性的疾病狀態和病症的受試者。該方法還可以包括預防2型糖 尿病、1型糖尿病、肥胖、高血糖症、高胰島素血症、胰島素生成減少、 胰島素抗性和/或特徵在於胰島素抗性的疾病狀態和病症的發生，或預防其 在風險受試者中的發生。如本文所使用的，高胰島素血症指由於胰島素抗 性所致的相對的高血液胰島素。
抗體、人源〗t抗體和人工程化抗體
本發明的IL-1 (例如，IL-ip)結合抗體可以以下述形式提供多克 隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、重組抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、 全人抗體、單鏈抗體和/或雙特異性抗體，以及通過已知技術提供的片段，包括其變體和衍生物，所述技術包括但不限於,切割、肽合成或重組技 術。
抗體一般包含2條重鏈多肽和2條輕鏈多肽，但也考慮具有1條重鏈 和1條輕鏈的單結構域抗體、和缺乏輕鏈的重鏈抗體。基於重鏈恆定結構 域的M酸序列，存在5種類型的重鏈，稱為a、 S、 s、 y和P。這些不同 類型的重鏈分別產生5類抗體，IgA (包括IgA!和IgAz) 、 IgD、 IgE、 IgG 和IgM，包括4個IgG亞類，即lg&、 IgG2、 IgG3和IgG"基於恆定結 構域的M酸序列，還存在2種類型的輕鏈，稱為kappa ( k )或lambda
(k)。全長抗體包括恆定結構域和可變結構域。恆定結構域無需存在於抗 體的抗原結合片段中。本文公開的抗體的抗原結合片段可以包括Fab、 Fab，、 F (ab') 2和F (v)抗體片段。如下文更詳細地討論的，IL-ip結合 片段包括可以結合IL-ip的抗體片段和抗原結合多肽。
抗體的重鏈和輕鏈序列，或其抗原結合片段，均包括具有3個互補決 定區(CDRs)以及非CDR構架區(FRs)的可變區。除非另有說明，如 本文所使用的，術語"重鏈"和"輕鏈"分別意指重鏈可變區和輕鏈可變區。 重鏈CDRs在本文中稱為CDR-H1、 CDR-H2和CDR-H3。輕鏈CDRs在 本文中稱為CDR-L1、 CDR-L2和CDR-L3。抗體序列中的可變區和CDRs 可以通過下述進行鑑定(i)根據本領域中已開發的一般法則，或(ii) 將序列相對已知可變區的資料庫進行比對。用於鑑定這些區域的方法在 Kontermann和Dubel，編輯，Antibody Engineering, Springer, New York, NY ， 2001,和Dinarello等人，Current Protocols in Immunology ， John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ， 2000中得到描述。抗體序列資料庫在下述 中得到描述，並且可以通過下述獲得www.bioinf.org.uk/abs的"The Kabatman"資料庫(由A.C. Martin在the Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London, London, England維護)， 和www.vbase2.org的VBASE2，嗦口在Retter等人，Nucl. Acids Res., 33
(Database issue) : D671-D674 (2005)中描述的。"Kabatman"資料庫 網站也包括用於筌定CDRs的一般經驗法則。除非另有說明，如本文所使用的，術語"CDR，，如Kabat等人，Sequences of Immunological Interest, 第5版，U.S. Department of Health and Human Services, 1991中進行定 義。
多克隆抗體優選通過相關抗原和佐劑的多次皮下(sc)或腹膜內(ip) 注射而在動物中產生。改善的抗體應答可以通過使用雙官能劑或衍生劑使 相關抗原與蛋白質綴合來獲得，所述蛋白質在待免疫的物種中是免疫原性 的，例如鑰孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶 抑制劑，所述雙官能劑或矛汴生劑為例如馬來醯亞氨基苯甲,基琥珀醯亞 胺酯(通過半胱氨酸殘基綴合)、N-羥基琥珀醯亞胺(通過賴氨酸殘基)、 戊二醛、琥珀酸酐或本領域已知的其他試劑。
動物針對抗原、免疫原性綴合物或衍生物進行免疫接種，方式是使例 如100照或5照蛋白質或綴合物(分別對於兔或小鼠)與3體積的弗氏 完全佐劑組合，且在多個位點處皮內注射該溶液。1個月後，動物通過在 多個位點處皮下注射，用在弗氏完全佐劑中的1/5至{分數(1/10) }原始量 的肽或綴合物加強。在加強注射後7-14天時，動物進行採血並且就抗體滴 度測定血清。動物加強免疫直至滴度達到平臺。優選地，動物用相同抗原 但與不同蛋白質和/或通過不同交聯劑綴合的綴合物進行加強。綴合物還可 以在重組細胞培養物中作為蛋白質融合物進行製備。此外，聚集試劑例如 明礬適宜用於增強免疫應答。
單克隆抗體指得自基本上均質的一群抗體的抗體。單克隆抗體一般是 高度特異性的，並且可以針對單個抗原位點，與一般包括針對不同決定簇 (表位)的不同抗體的常規(多克隆)抗體製品不同。除了其特異性外， 單克隆抗體還是有利的，因為它們由均質培養物合成，不被具有不同特異 性和特徵的其他免疫球蛋白汙染。
待依照本發明^^用的單克隆抗體可以通過首先由Kohler等人， (Nature, 256: 495-7， 1975)描述的雜交瘤方法進行製備，或可以通過 重組DNA方法(參見例如，美國專利號4,816,567)進行製備。單克隆抗 體還可以4吏用例如Clackson等人，(Nature 352: 624-628， 1991 )和Marks等人，(J. Mol Biol. 222: 581-597， 1991)中描述的技術，從噬菌體抗體 文庫中分離。
在雜交瘤方法中，小鼠或其它合適的宿主動物例如倉鼠或短尾猴如本 文所述進行免疫，以引發產生或能夠產生將與用於免疫的蛋白質特異性結 合的抗體的淋巴細胞。可替代地，淋巴細胞可以在體外進行免疫。隨後使 用合適的融合劑例如聚乙二醇使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜交 瘤細胞(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,第59-KB 頁 (Academic Press, 1986))。
將由此製備的雜交瘤細胞接種且生長在合適的培養基中，所述培養基 優選包含抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的一種或多種物質。例 如，如果親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥噤呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT 或HPRT)，那麼用於雜交瘤的培養基一般將包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和 胸苷(HAT培養基)，所述物質阻止HGPRT缺陷細胞的生長。
優選的骨髓瘤細胞是這樣的細胞，其能有效地發生融合、支持所選擇 的抗體生產細胞穩定地高水平生產抗體，並且對培養基敏感。人骨髓瘤和 小鼠-人雜交骨髓瘤(heteromyeloma )細胞系也已得到描述，用於產生人 單克隆抗體(Kozbor， J. Immunol, 133: 3001 ( 1984) ; Brodeur等人， Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 第51-63 頁(Marcel Dekker， Inc., New York, 1987))。示例性鼠類骨髓瘤系包 括可從Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego， Calif. USA獲 得的、衍生自M0P-21和M.011小鼠腫瘤的那些，以及可從美國典型培 養物保藏中心，Rockville， Md. USA獲得的SP-2或X63-Ag8-653細胞。
就抗抗原的單克隆抗體的生產，分析其中雜交瘤細胞正在生長的培養 基。優選地，由雜交瘤細胞生產的單克隆抗體的結合特異性通過免疫沉澱 或通過體外結合測定試驗進行測定，例如放射性免疫測定(RIA)或酶聯 免疫吸附測定(ELISA )。單克隆抗體的結合親和力可以例如通過Scatchard 分析(Munson等人，Anal. Biochem.， 107: 220 (1980))進行測定。
鑑定了產生具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞後，這些克隆可以通過有P艮稀釋操作進行亞克隆，並且通過標準方法進行
生長(Goding， Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,第59-103 頁(Academic Press, 1986 ))。用於這個用途的合適培養基包括例如DMEM 或RPMI-1640培養基。此外，雜交瘤細胞可以在體內作為動物中的腹水腫 瘤進行生長。由亞克隆分泌的單克隆抗體可以通過常規免疫球蛋白純化操 作適當地從培養基、腹水液或血清中分離，所述操作例如蛋白A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
進一步考慮本發明的抗體可以以本領域眾所周知和本文描述的抗體 的較小抗原結合片段進行使用。
本發明涵蓋包括2條全長重鏈和2條全長輕鏈的IL-1 (例如，IL-ip) 結合抗體。可替代地，IL-p結合抗體可以是保留對於IL-lJ5的結合活性的 構建體，例如單鏈抗體或"微型"抗體。此種構建體可以通過本領域已知的 方法進行製備，例如PCR介導的單鏈抗體克隆和裝配用於在大腸桿菌中 表達(如 Antibody Engineering ， The practical approach series ， J. McCafferty, H. R. Hoogenboom， and D. J. Chiswell，編輯，Oxford University Press, 1996中描述的)。在這個類型的構建體中，抗體分子的 重和輕鏈可變部分由cDNA進行PCR擴增。所得到的擴增子隨後可以例 如在第二個PCR步驟中通過接頭DNA進行裝配，所述接頭DNA編碼由 胺基酸Gly和Ser組成的柔性蛋白質接頭。這個接頭允許可變重和輕鏈部 分以這樣的方式摺疊，該方式使得抗體結合袋重新產生，並且以通常與親 本全長二聚免疫球蛋白分子相當的親和力結合抗原。
本發明的IL-1 (例如，IL-ip)結合抗體和片段包括本文公開的示例 性抗體、片段和序列的變體。變體包括包含一個或多個氨基^列置換、 缺失和/或添加的肽和多肽，其具有與本文公開的一種或多種示例性抗體、 片段和序列相同或基本上相同的表位結合親和力和特異性。因此，變體包 括包含對本文z〉開的示例性抗體、片段和序列的一個或多個M酸序列置 換、缺失和/或添加的肽和多肽，其中此種置換、缺失和/或添加不引起表 位結合的親和力和特異性的實質改變。例如，抗體或片段的變體可由對於抗體或片段的一個或多個改變而引起，其中該改變的抗體或片段具有與起 始序列相同或基本上相同的表位結合親和力和特異性。變體可以是天然存 在的，例如等位基因變體或剪接變體，或可以是人工構建的。變體可以由
編碼所述變體的相應核酸分子進行製備。本發明抗體和IL-1(3結合片段的 變體可以在輕和/或重鏈M酸序列中具有變化，所述變化可以是天然發生 的或可以通過使用重組DNA技術在體外改造天然序列而引入。天然存在 的變體包括"體細胞"變體，其在抗外源抗原的抗體應答的產生過程中在體 內在相應胚系(germ line )核苷^列中產生。
IL-1 (例如，IL-ip)結合抗體和結合片段的變體也可以通過誘變技術 進行製備。例如，胺基酸改變可以在整個抗體編碼區隨機地引入，並且所 得到的變體可以就對於IL-ip的結合親和力或其它性質進行篩選。可替代 地，胺基酸改變可以在IL-ip抗體的所選擇區域中引入，例如在輕和/或重 鏈CDRs中，和/或在構架區中引入，並且所得到的抗體可以就與IL-ip的 結合或某些其他活性進行篩選。胺基酸改變包括在CDR中的一個或多個 胺基酸置換，從單胺基酸差異到在給定CDR例如CDR3內引入多個M 酸變更。在另一種方法中，CDR內的每個殘基對IL-1(5結合的貢獻可以通 過用丙氨酸置換在該CDR內的至少一個殘基進行評估。Lewis等人 (1995) ， Mol. Immunol. 32: 1065-72。對於與IL-ip的結合併非最佳的 殘基隨後可以加以改變，以便確定更優化的序列。本發明也涵蓋通過插入 胺基酸以增加CDR例如CDR3的大小而產生的變體。例如，大多數輕鏈 CDR3序列長9個胺基酸。抗體中短於9個殘基的輕鏈序列可以通過插入 合適的胺基酸以增加該CDR的長度，來優化與IL-ip的結合。
變體還可以通過輕或重鏈的"鏈改組，，進行製備。Marks等人(1992 )， Biotechnology 10: 779-83。單條輕(或重)鏈可以與具有重(或輕)鏈庫 (repertoire)的文庫組合，並且所得到的群體就所需活性例如與IL-1卩的結 合進行篩選。與使用既包含重鏈庫又包含輕鏈庫的文庫時的可能情況相 比，這允許篩選與單條輕鏈(或重鏈)組合的更多不同重鏈(或輕鏈)樣本。
本發明的IL-1 (例如，IL-ip)結合抗體和片段涵蓋本文公開的示例性抗體、片段和序列的衍生物。衍生物包括已進行化學修飾的多肽或肽、 或其變體、片段或衍生物。例子包括一個或多個聚合物，例如水溶性聚合
物、N聯或O聯碳水化合物、糖、磷酸和/或其他此種分子的共價附著。 在附著的分子的類型或位置方面，衍生物以不同於天然存在的或起始的肽 或多肽的方式被《務飾。衍生物還包括天然存在於肽或多肽上的一個或多個 化學基團的缺失。
本發明的IL-ip結合抗體和片段可以是雙特異性的。雙特異性抗體或 片段可以具有幾種構型。例如，雙特異性抗體可以類似單個抗體(或抗體 片段)，但具有2個不同抗原結合位點(可變區)。雙特異性抗體可以通 過化學技術(Kranz等人(1981) ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 78: 5807)、 通過"多瘤，，(polydoma )4支術(美國專利號4，474，893)或通過重組DNA 技術來產生。本發明的雙特異性抗體可以具有對於至少2種不同表位的結 合特異性，其中至少一種是IL-ip的表位。IL-ip結合抗體和片段也可以 是雜抗體(heteroantibody )。雜抗體是連接在一起的2種或更多種抗體或 抗體結合片段(Fab),每種抗體或片段具有不同特異性。
繞過單克隆抗體產生的、用於製備抗體分子的抗原結合區域的重組 DNA形式的技術可以考慮用於本發明IL-1 (例如，IL-lp)結合抗體和片 段。將DNA克隆到細菌表達系統內。適合於實踐本發明的此種技術的一 個例子，使用具有前導序列的噬菌體k載體系統，所述前導序列引^達 的Fab蛋白質移動到周質間隙(在細菌細胞膜和細胞壁之間)或分泌。可 以快速產生大量功能性Fab片段，並就其與IL-ip的結合進行篩選。此種 IL-ip結合劑(對於IL-ip多肽具有特異性的Fab片段)尤其包括在本發 明的IL-ip結合抗體和片段內。
本發明IL-1 (例如，IL-ip)結合抗體和片段可以是人源化或人工程 化抗體。如本文所使用的，人源化抗體或其抗原結合片段是重組多肽，其 包含來自非人抗體的抗原結合位點的部分和人抗體的構架和/或恆定區的 部分。人工程化抗體或抗體片段是已通過在特定位置處修改(例如，缺失、 插入或置換)氛基酸而被改造的非人(例如，小鼠)抗體，其中所述JtJ^酸的修改導致減少或消除該修飾抗體在人中的任何可檢測免疫原性。
人源化抗體包括嵌合抗體和CDR移植抗體。嵌合抗體是包括與人恆 定區連接的非人抗體可變區的抗體。因此，在嵌合抗體中，可變區大部分 是非人的，並且恆定區是人的。嵌合抗體和用於製備其的方法在Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Scl USA, 81: 6841-6855 (1984) , Boulianne等 人，Nature, 312: 643-646 (1984)，和PCT申請公開WO 86/01533中 得到描述。儘管，它們可以比小鼠單克隆抗體更少免疫原性，但嵌合抗體 的施用已與針對抗體的非人部分的人抗小鼠抗體應答(HAMA)關^來。 嵌合抗體也可以通過將來自具有合適抗原結合特異性的小鼠抗體分子的 基因與來自具有合適生物活性的人抗體分子的基因剪接在一起來產生，所
述生物活性例如激活人補體和介導ADCC的能力。Morrison等人(1984 )， Proc.Natl. Acad. Scl, 81: 6851; Neuberger等人(1984 ) ， Nature, 312: 604。 一個例子是將Fc區替換為不同同種型的Fc區。
CDR移植抗體是包括與來自人"受體，，抗體的構架區連接的來自非人 "供體"抗體的CDRs的抗體。 一般地，CDR移植抗體包括比嵌合抗體更多 的人抗體序列，因為它們包括來自人抗體的恆定區序列和可變區(構架) 序列。因此，例如，本發明的CDR移植人源化抗體可以包含重鏈，所述 重鏈包含來自人抗體的構架區(例如，人抗體的FR-1、 FR-2或FR-3)的 連續胺基酸序列(例如，約5個或更多、10個或更多、或甚至15個或更 多個連續胺基酸殘基)，或任選地，人抗體的整個構架區的大多數或全部。 CDR移植抗體和用於製備其的方法在Jones等人，Nature, 321: 522-525 (1986 ) ， Riechmann等人，Nature, 332: 323-327 (1988 )，和Verhoeyen 等人，Science, 239: 1534-1536 (1988))中得到描述。可以用於產生人 源化抗體的方法也在美國專利號4,816,567、 5,721,367、 5,837,243和 6,180,377中得到描述。CDR移植抗體被認為比嵌合抗體較不可能誘導針 對非人抗體部分的免疫反應。然而，已報告來自供體抗體的構架序列是供 體抗體的結合親和力和/或特異性所需的，推測這是因為這些構架序列影響 供體抗體的抗原結合部分的摺疊。因此，當供體非人CDR序列被移植到無關人構建序列上時，在某些情況下，相對於最初非人供體抗體，所得到
的CDR移植抗體可能顯示結合親合力的喪失。參見例如，Riechmann等 人，Nature, 332: 323-327 (1988),和Verhoeyen等人，Science, 239: 1534-1536 (1988 )。
人工程化抗體包括例如"鑲嵌"抗體和4吏用 HUMAN ENGINEERINGtm技木(美國專利5,869,619 )製備的抗體。HUMAN ENGINEERINGTM技術是商購可得的，並且涉及改變非人抗體或抗體片 段，例如小鼠或嵌合抗體或抗體片段，方式是對抗體的胺基酸序列進行特 異改變，以便產生在人中具有減少的免疫原性、然而仍保留原始非人抗體 的所需結合性質的修飾抗體。 一般地，該技術涉及將非人(例如，小鼠) 抗體的胺基酸殘基分類為"低風險"、"中等風險"或"高風險"殘基。分類使 用總體風險/回報計算來進行，該計算評估相對於置換將影響所得抗體的折 疊和/或抗原結合性質的風險，進行該具體置換的預期益處(例如，在人中 的免疫原性)。因此，低風險位置是預期在該處的置換是有利的位置，因 為預期這將減少免疫原性而不顯著影響抗原結合性質。中等風險位置是預 期在該處的置換可減少免疫原性但有較大可能影響蛋白質摺疊和/或抗原 結合的位置。高風險位置包含最可能參與正確摺疊或抗原結合的殘基。一 般地，非人抗體中的低風險位置用人殘基進行置換，高風險位置很少置換， 和有時，但不是不受限制地，在中等風險位置處進行人源化置換。在非人 抗體可變區序列中具有脯氨酸的位置通常分類為至少中等風險位置。
在非人(例如，小鼠)抗體序列的給定低或中等風險位置處置換的特 定人胺基酸殘基可以通過下述進行選擇使來自非人抗體的可變區的氨基 酸序列與特定或共有人抗體序列的相應區域比對。根據該比對，在非人抗 體序列的低或中等風險位置處的胺基酸殘基可以置換為人抗體序列中的 相應殘基。用於製備人工程化蛋白質的技術在Studnicka等人，Protein Engineering, 7: 805-814( 1994 )，美國專利5，766，886、 5，770，196、 5,821,123 和5,869,619、和PCT申請公開WO 93/11794中更詳細地進行描述。
"鑲嵌"抗體是非人或人源化(例如，嵌合或CDR移植抗體)抗體，其已經經過改造以替換某些暴露於溶劑的胺基酸殘基，以便進一步減少其 免疫原性或增強其功能。因為推測嵌合抗體的表面殘基較不可能影響正確 的抗體摺疊但較可能引發免疫反應，所以嵌合抗體的鑲嵌可以包括例如， 鑑定嵌合抗體的非人構架區中暴露於溶劑的殘基，和用來自人構架區的相 應表面殘基替換它們中的至少 一個。鑲嵌可以通過任何合適的工程技術來
完成，包括上述HUMAN ENGINEERINGTM技術的使用。
在一個不同方法中，可以通過使CDR移植抗體"去人源化，，來恢復結 合親合力。去人源化可以包括使來自供體抗體的構架區的殘基回到CDR 移植抗體，從而恢復正確摺疊。類似的"去人源化"可以通過下述來達到 (i)在"受體"抗體中包括"供體"構架區的部分，或(ii)將"供體"抗體構 架區的部分(連同移植的供體CDRs)移植到受體抗體內。
關於抗體、人源化抗體、人工程化抗體和用於其製備的方法的進一步 討論,參見Kontermann and Dubel，編輯，Antibody Engineering, Springer, New York, NY， 2001。
示例性人源化或人工程化抗體包括IgG、 IgM、 IgE、 IgA和IgD抗體。 本發明抗體可以^1任何類型(IgG、 IgA、 IgM、 IgE、 IgD等)或同種型， 並且可以包括k或k輕鏈。例如，人抗體可以包含IgG重鏈或確定的片段， 例如至少一種同種型，IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4。作為進一步例子，本 發明抗體或片段可以包含IgGl重鏈和IgGl輕鏈。
本發明抗體和片段可以是人抗體(例如結合IL-ip多肽且由如下核酸 序列編碼的抗體，所述核 列是人胚系免疫球蛋白核 列的天然體細 胞變體)，及其片段、合成變體、衍生物和融合物。此種抗體可以通過本 領域已知的任何方法來產生，例如通過使用轉基因哺乳動物(例如，轉基 因小鼠)，其中在該哺乳動物染色體中天然的免疫球蛋白庫已被人V基因 替換。此種哺乳動物表現出以正常方式實現人胚系抗體基因的VDJ重組和 體細胞高變，從而產生具有全人序列的高親和力抗體。
針對靶蛋白質的人抗體也可以使用轉基因動物來產生，所述轉基因動 物不具有內源免疫球蛋白生產，且經改造而包含人免疫球蛋白基因座。例如，W0 98/24893/^開了具有人Ig基因座的轉基因動物，其中由於內源重 和輕鏈基因座的失活，該動物不產生功能性內源免疫球蛋白。WO 91/00卯6 還公開了能夠產生針對免疫原的免疫應答的轉基因非靈長類哺乳動物宿 主，其中抗體具有靈長類恆定區和/或可變區，且其中內源免疫球蛋白編碼 基因座被置換或失活。WO 96/30498和美國專利號6,091,001公開了使用 Cre/Lox系統修飾哺乳動物中的免疫球蛋白基因座，以便例如替換恆定或 可變區的全部或部分，從而形成修飾的抗體分子。WO 94/02602公開了具 有滅活的內源Ig基因座和功能性人Ig基因座的非人哺乳動物宿主。美國 專利號5，939，598公開了製備轉基因小鼠的方法，其中該小鼠缺乏內源重 鏈，且表達包含一個或多個異種恆定區的外源免疫球蛋白基因座。還參見， 美國專利號6，114，598、 6,657,103和6，833，268。
使用上文描述的轉基因動物，可以產生針對所選擇的抗原分子的免疫 應答，可以從動物中取出抗體生產細胞，且用於產生分泌人單克隆抗體的 雜交瘤。免疫接種方案、佐劑等是本領域已知的，並且可以在例如轉基因 小鼠的免疫接種中使用，如WO 96/33735中所述的。這個出版物公開了針 對各種抗原分子的單克隆抗體，所述抗原分子包括IL-6、 IL-8、 TNFa、 人CD4、 L選擇蛋白、gp39和破傷風毒素。單克隆抗體可以就抑制或中和 相應蛋白質的生物活性或生理效應的能力進行測試。WO 96/33735公開了 針對IL-8的單克隆抗體，其衍生自用IL-8免疫的轉基因小鼠的免疫細胞、 阻斷IL-8誘導的嗜中性粒細胞功能。對用於免疫轉基因動物的抗原具有特 異性的人單克隆抗體也7>開於WO 96/34096和美國專利申請號 20030194404;以及美國專利申請號20030031667中。
用於製備單克隆抗體的另外轉基因動物包括在美國專利號5,770,429 和Fishwild等人(Nat. Biotechnol. 14: 845-851， 1996 )中描述的Medarex HuMAb-MOUSE ,其包含來自未重排人抗體基因的編碼人抗體的重和輕 鏈的基因序列。對HuMAb-MOUSE⑧的免疫使得能夠產生針對靶蛋白質 的全人單克隆抗體。
此外，Ishida等人(Cloning Stem Cells. 4: 91-102， 2002)描述了TransChromo Mouse (TCMOUSETM)，其包含兆鹼基大小的人DNA區 段，並且摻入完整的人免疫球蛋白(hlg)基因座。TCMOUSEtm具有hlg 的全多樣庫，包括IgGs的所有亞類(IgGl-G4)。用各種人抗原免疫接種 TC MOUSETM產生包含人抗體的抗體應答。
還參見Jakobovits等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551( 1993 ); Jakobovits等人，Nature, 362: 255-258 (1993) ; Bruggermaim等人， Year in Immunol., 7: 33 (1993);和美國專利號5,591,669、美國專利號 5,589,369、美國專利號5，545，807;和美國專利公開號20020199213。美國 專利公開號20030092125描述了用於使動物的免疫應答偏向所需表位的方 法。人抗體也可以通過體外活化的B細胞來產生(參見美國專利號 5,567,610和5,229,275 )。
人抗體也可以通過抗體展示文庫的體外篩選來產生。參見 Hoogenboom等人(1991) ， J. Mol. Biol. 227: 381;和Marks等人(1991)， J. Mol . Biol. 222: 581。各種包含抗體的噬菌體展示文庫已得到描述，並 且可以容易地製備。文庫可以包含各種各樣的人抗體序列，例如人Fab、 Fv和scFv片段，可以針對合適靶篩選這些序列。噬菌體展示文庫可以包 含非抗體的肽或蛋白質，可以篩選該肽或蛋白質以鑑定IL-ip的選擇性結 合劑。
用於製備重組人抗體基因庫的技術的發展和用於將所編碼抗體片段 展示在絲狀噬菌體表面上的技術的發展，已提供了直接製備人抗體的手 段。通過噬菌體技術產生的抗體以抗原結合片段——通常為Fv或Fab片 段——的形式在細菌中產生，且因此缺乏效應子功能。效應子功能可以通 過2種策略之一而引入這些片段可以被改造成完全抗體用於在哺乳動物 細胞中表達，或改造成具有能夠觸發效應子功能的第二結合位點的雙特異 性抗體片段。
本發明考慮用於產生靼特異性抗體或其抗原結合部分的方法，其包括 下述步驟在噬菌體上合成人抗體文庫、用靶蛋白質或其部分篩選文庫、 分離結合靶的噬菌體、且由噬菌體獲得抗體。例如，用於製備在噬菌體展示技術中使用的抗體文庫的一種方法包括下述步驟用耙抗原或其抗原性 部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人動物，以產生免疫應答，從免疫 接種的動物中提取抗體生產細胞；從提取的細胞中分離RNA，將RNA逆 轉錄以產生cDNA，使用引物擴增cDNA，且將cDNA插入噬菌體展示載 體內，從而使得抗體在噬菌體上表達。本發明的重組靶特異性抗體可以以 這種方式獲得。
噬菌體展示方法通過在絲狀噬菌體表面上展示抗體庫，且隨後通過與 所選抗原的結合來選擇噬菌體，從而模擬免疫選擇。 一種此種技術在WO 99/10494中描述，其描述了使用此種方法分離針對MPL和msk受體的高 親和力和功能性拮抗性抗體。本發明的抗體可以通過篩選重組組合抗體文 庫，優選地scFv噬菌體展示文庫進行分離，其中所述文庫可以使用由衍生 自人淋巴細胞的mRNA製備的人Vl和Vh cDNA來製備。用於製備和篩 選此種文庫的方法是本領域已知的。參見例如，美國專利號5,969,108。存 在用於產生噬菌體展示文庫的商購可得試劑盒(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System ，目錄號27-9400-01;和Stratagene SurfZAP.TM. phage display kit,目錄號240612 )。還存在其他方法和試 劑可以用於產生且篩選抗體展示文庫(參見例如，Ladner等人美國專利號 5，223，409; Kang等人PCT公開號WO 92/18619; Dower等人PCT公開 號WO 91/17271; Winter等人PCT公開號WO 92/20791; Markland等人 PCT公開號WO 92/15679; Breitling等人PCT公開號WO 93/01288; McCafferty等人PCT公開號WO 92/01047; Garrard等人PCT公開號 WO 92/09690; Fuchs等人(1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay等 人(1992 ) Hum. Antibod, Hybridomas 3: 81-85; Huse等人(1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty等人，Nature (1990 ) 348: 552-554; Griffiths 等人(1993 )EMBO J 12: 725-734; Hawkins等人(1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clackson等人(1991) Nature 352: 624-628; Gram等人(1992 ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrad等人(1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom等人(1991 )Nuc Acid Res 19:4133-4137;和Barbas等人(1991 )Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982。 在一個實施方案中，為了分離具有所需特徵的靶抗原特異性人抗體，
篩選人VH和VL文庫，以選擇具有所需特異性的抗體片段。在這種方法中
^使用的抗體文庫優選是如本文和本領域所述製備且篩選的scFv文庫 (McCafferty等人，PCT公開號WO 92/01047， McCafferty等人，(Nature 348: 552-554， 19卯)；和Griffiths等人，(EMBOJ12: 725-734, 1993)。 scFv抗體文庫優選使用靶蛋白質作為抗原進行篩選。
可替代地，抗體的Fd片段(VH-CH1)和輕鏈(VL-CL )通過PCR分 別進行克隆，並且在組合噬菌體展示文庫中隨機重組，隨後可以就與特定 抗原的結合進行選擇。這些Fab片段在噬菌體表面上表達，即與編碼其的 基因物理連接。因此，通過抗原結合來選擇Fab可以導致對Fab編碼序列 的共選擇，隨後可以擴增該序列。通過數輪抗原結合和再擴增(稱為淘選 的程序)，可以富集且最終分離對於抗原特異的Fab。
在1994年，描述了稱為"引導選擇"的用於抗體人源化的方法。引導選 擇將噬菌體展示技術的力量用於小鼠單克隆抗體的人源化(參見Jespers，
L. S.等人，Bio/Technology 12， 899-903 ( 1994))。為此，小鼠單克隆抗 體的Fd片段可以與人輕鏈文庫組合展示，並且所得到的雜交Fab文庫隨 後可以用抗原進行選擇。小鼠Fd片段從而提供了引導選擇的模板。隨後， 使所選擇的人輕鏈與人Fd片段文庫組合。對所得到的文庫的選擇產生全 人Fab。
用於從噬菌體展示文庫獲得人抗體的多種方法已得到描述(參見例 如，Hoogenboom等人，J. Mol.Biol., 227: 381 ( 1991) ; Marks等人， J. Mol.Biol, 222: 581-597 (1991);美國專利號5,565,332和5，573，卯5; Clackson， T.，和Wells, J. A.， TIBTECH 12, 173-184 (1994))。特 別地，對衍生自噬菌體展示文庫的抗體的體外選擇和進化已成為有力工具 (參見Burton, D.R.，和BarbasIII， C. F.， Adv. Immunol. 57， 191-280 (1994) ; Winter, G.等人，Annu. Rev. Immunol. 12， 433-455 (1994); 美國專利/>開號20020004215和WO 92/01047;美國專利>^開號20030190317;以及美國專利號6,054,287和5,877,293。
Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187- 193 (2002 )，和2003年3月6日z〉開 的美國專利公開號20030044772描述了通過Capture Lift用於篩選噬菌體 表達的抗體文庫或其他結合分子的方法，Capture Lift是一種涉及將候選 結合分子固定在固相載體上的方法。
Fv片段通過如下方式展示在噬菌體表面上使作為噬菌體蛋白質融合 物(例如，具有M13基因III)表達的一條鏈與作為可溶片段表達的互補 鏈結合。考慮噬菌體可以是絲狀噬菌體，例如I類噬菌體之一fd、 M13、 fl、 Ifl、 lke、 ZJ/Z、 Ff，和II類噬菌體之一Xf、 PH和PB。噬菌體可 以是M13或fd或其衍生物。
一旦逸捧了起始人Vl和Vh區段，可以執行"混合和匹配"實驗，以選 擇優選的V!7VH對組合，其中就靶的結合來篩選起始選擇的V^和VH區段 的不同對。此外，為了進一步改善抗體的質量，可以在類似於在天然免疫 應答過程中負責抗體的親和力成熟的體內體細胞突變過程的程序中；隨機 突變優選的Vl/Vh對的和VH區段，優選在VH和/或VL的CDR1 、CDR2 或CDR3區之任何一個中突變，。這種體外親和力成熟可以通過使用PCR 引物擴增Vl和VH區來完成，所述PCR引物分別與VHCDR1、 CDR2和 CDR3，或VlCDR1、 CDR2和CDR3互補，所述引物已在某些位置處摻 加了 4種核苷酸鹼基的隨機混合物，從而使得所產生的PCR產物編碼隨 機突變已引入Vh和/或VL CDR3區內的Vl和Vh區段。這些隨機突變的 VL和VH區段可以就與靶抗原的結合進行再篩選。
從重組免疫球蛋白展示文庫中篩選和分離靶特異性抗體後，編碼所選 擇抗體的核酸可以從展示包(display package)(例如，自喧菌體基因組) 中回收，並且通過標準重組DNA技術亞克隆到其他表達載體內。需要時， 核酸可以進一步處理，以產生本發明的其他抗體形式，如下文所述。為了 表達通過篩選組合文庫而分離的重組人抗體，將編碼抗體的DNA克隆到重組表達載體內，且引入哺乳動物宿主細胞內，如本文所述。
考慮噬菌體展示方法可以在細菌或宿主細胞的增變林中進行。增變林
是具有遺傳缺陷的宿主細胞，其造成在其內複製的DNA相對於親本DNA 發生突變。示例增變菌林是NR9046mutD5和NR9046 mut Tl。
還考慮噬菌體展示方法可以使用輔助噬菌體來進行。這是用於感染包 含缺陷噬菌體基因組的細胞且功能在於彌補該缺陷的噬菌體。缺陷噬菌體 基因組可以是其中某些功能編碼基因序列被去除的噬菌粒或噬菌體。輔助 噬菌體的例子是M13K07、 M13K07基因IH編號3;和展示或編碼與衣殼 蛋白融合的結合分子的噬菌體。
抗體也可以經由噬菌體展示篩選方法來產生，其中使用如WO 92/01047中公開的分層雙重組合方法(hierarchical dual combinatorial approach)，其中包含H或L鏈克隆的單菌落用於感染一個完整的文庫， 所述文庫由編碼另一條鏈(L或H)的克隆組成，並且所得到的雙鏈特異 性結合成員依照噬菌體展示技術例如本文描述的那些進行選擇。這種技術 也公開於Marks等人，(Bio/Technology ， 10: 779-783， 1992)中。
用於在酵母和微生物細胞表面上展示肽的方法也已用於鑑定抗原特 異性抗體。參見例如，美國專利號6，699，658。抗體文庫可以與酵母蛋白質 例如凝集素附著，有效地模擬在免疫系統中抗體經由B細胞的細胞表面展 示。
除噬菌體展示方法外，抗體可以使用核糖體mRNA展示方法和孩支生物 細胞展示方法進行分離。使用核糖體展示進行的多肽選擇在Hanes等人， (Proc. Natl Acad Sci USA, 94: 4937-4942， 1997)以及授予Kawasaki 的美國專利號5，643，768和5,658,754中得到描述。核糖體展示也用於抗體 的快速大M^莫突變分析。選擇性誘變方法也提供了產生具有改善活性的抗 體的方法，所述抗體可以使用核糖體展示技術進行選擇。
IL-1 (例如IL-1IJ)結合抗體和片段可以包含這樣的一個或多個部分， 其不結合IL-ljJ而是負責其他功能，例如循環半衰期、直接細胞毒性效應、 可檢測標記、或激活接受者的內源補體級聯或內源細胞毒性。抗體或片段可以包含全部或部分恆定區，並且可以具有任何同種型，包括IgA(例如， IgAl或IgA2) 、 IgD、 IgE、 IgG (例如IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4)、 或IgM。除了或代替包含恆定區，本發明的抗原結合化合物可以包括附加 表位、清道夫受體(salvage receptor)表位、用於診斷或純化用途的標籤 部分、或細胞毒性部分例如放射性核素或毒素。
本發明抗體和片段的恆定區(當存在時)可以是yl、 y2、 y3、 "、 n、 卩2或3或s類型，優選Y類型，更優選y類型，而人輕鏈的恆定部分可以 是K或x類型(其包括M、、和^亞型)，但優選K類型。
變體還包括包含經修飾的Fc區的抗體或片段，其中經修飾的Fc區包 含相對於野生型Fc區的至少一個M酸修飾。變體Fc區可以相對於包含 野生型Fc區的可比較分子進行設計，以便以更多或更小的親和力結合Fc 受體。
例如，本發明IL-ip結合抗體和片段可以包含經修飾的Fc區。Fc區 指與如下IgGC末端結構域同源的、天然存在的或合成的多肽，所述結構 域在IgG的木瓜蛋白酶消化後產生。IgG Fc具有約50 kD的分子量。在本 發明抗體和片段中，可以使用整個Fc區，或僅半衰期增強部分。此外， 氨基一列中的許多修飾是可接受的，因為天然活性並非在所有情況下都 是必需或期望的。
需要時，Fc區可以進行突變，以抑制其固定補體和以高親和力結合 Fc受體的能力。對於鼠類IgGFc， Ala殘基置換Glu 318、 Lys 320和Lys 322使得蛋白質無法指導ADCC。 Glu置換Leu 235抑制蛋白質以高親和 力結合Fc受體的能力。關於人IgG的各種突變是已知的(參見例如， Morrison等人，1994， The Immunologist 2: 119 124和Brekke等人，1994， The Immunologist 2: 125 )。
在某些實施方案中，提供了具有經修飾的Fc區的本發明抗體或片段， 其中天然存在的Fc區進行修飾以增加抗體或片段在生物環境中的半衰期， 例如血清半衰期或通過體外試驗測量的半衰期。用於改變IgG Fc區的最初 形式的方法在美國專利號6,998,253中得到描述。在某些實施方案中，可能希望修飾抗體或片段以便增加其血清半衰
期，例如給抗體片段添加分子例如PEG或其他水溶性聚合物，包括多糖 聚合物，以增加半衰期。這也可以例如通過將清道夫受體結合表位摻入抗 體片段內(例如，通過抗體片段中合適區域的突變，或通過將該表位摻入 肽標籤內(例如藉助於DNA或肽合成)，1^將肽標籤融合在抗體片段 的任一末端或中間)來達到(參見國際公開號W096/32478)。清道夫受 體結合表位指負責增加IgG分子的體內血清半衰期的IgG分子(例如， IgG,、 IgG2、 IgG3或IgG4) Fc區的表位。
清道夫受體結合表位可以包括這樣的區域，其中來自Fc結構域的1 個或2個環的任何一個或多個胺基酸殘基被轉移至抗體片段的類似位置 上。更加優選地，轉移來自Fc結構域的1個或2個環的3個或更多個氨 基酸殘基。更加優選地，表位取自Fc區(例如，IgG的Fc區)的CH2 結構域，且轉移至抗體的CH1、 CH3或VH區或超過一個此種區域上。可 替代地，表位取自Fc區的CH2結構域，且轉移至抗體片段的Cl區或VL 區或兩者。還參見國際申請WO 97/34631和WO 96/32478，其描述了 Fc 變體及其與清道夫受體的相互作用。
在Fc受體結合位點內的殘基的突變可以導致改變的效應子功能，例 如改變的ADCC或CDC活性，或改變的半衰期。潛在突變包括一個或多 個殘基的插入、缺失或置換，包括用丙氨酸置換、保守置換、非保守置換、 或用來自不同IgG亞類的相同位置處的相應胺基酸殘基替換(例如，IgGl 殘基用在那個位置處的相應IgG2殘基替換)。例如，已報告與原始嵌合 IgG4比較，使IgG4中的M酸位置241的絲氨酸突變成脯氨酸(在IgGl 和IgG2中的該位置處發現的殘基)導致同質抗體的產生，以及延長的血 清半衰期和改善的組織分布(Angal等人，Mol Immunol. 30: 105-8， 1993 )。
抗體片段是完整全長抗體的部分，例如完整抗體的抗原結合區或可變 區。抗體片段的例子包括Fab、 Fab'、 F (ab') 2和Fv片段；雙鏈抗體 (diabody);線性抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv);多特異性抗體片段 例如雙特異性、三特異性和多特異性抗體(例如，雙鏈抗體、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody));」錄型抗體(minibody);螯合重組抗體 (chelating recombinant antibody); 三體(tribody)或雙體(bibody); 胞內抗 體；納米抗體；小模塊免疫藥物(small modular immunopharmaceuticals， SMIP) 、 adnectins、結合結構域免疫球蛋白融合蛋白；駝源化抗體 (camelized antibody);含V冊的抗體；和由抗體片段形成的任何其他多肽。 本發明包括包含任何前述重或輕鏈序列且結合IL-ip的IL-ip結合抗 體片段。如本文所使用的，術語片段指抗體的任何3個或更多個連續M 酸(例如，4個或更多、5個或更多、6個或更多、8個或更多、或甚至IO 個或更多個連續胺基酸)，並且涵蓋Fab、 Fab'、 F ( ab') 2和F (v)片 段、或單個輕或重鏈可變區或其部分。IL-1(J結合片段包括例如Fab、 Fab'、 F ( ab') 2、 Fv和scFv。這些片段缺乏完整抗體的Fc片段，從循環中更快 速地被清除，並且可以具有比完整抗體更少的非特異性組織結合。參見 Wahl等人(1983) , J.Nucl.Med.， 24: 316-25。這些片段可以使用眾所 周知的方法由完整抗體產生，例如通過用酶例如木瓜蛋白酶(以產生Fab 片段)或胃蛋白酶(以產生F Ub') 2片段)的蛋白酶解切割。
用於測定IL-1(J與IL-1受體I型(IL-1R1)的結合的體外和基於細胞 的測定試驗是本領域充分描述的，包括在與IL-ip或IL-1R1結合的分子
(例如抗體、拮抗劑或其他抑制劑)存在下進行測定的試驗。(參見例如 Evans等人，(1995) ， J, Biol. Chem. 270: 11477-11483; Vigers等人，
(2000) ， J. Biol. Chem. 275: 36927-36933; Yanofsky等人，(1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7381-7386; Fredericks等人，(2004 )， Protein Eng, Des. Sel. 17: 95-106; Slack等人，(1993 ) ， J. Biol. Chem. 268: 2513-2524; Smith等人,(2003) ， Immunity 18: 87-96; Vigers等人，
(1997) ， Nature 386: 1卯畫194; Ruggiero等人，(1997)，丄Immunol. 158: 3881-3887; Guo等人，(1995 ) ， J. Biol. Chem. 270: 27562-27568; Svenson等人，(1995)， Eur. J. Immunol. 25: 2842-2850; Arend等人，
(1994) ， J. Immunol. 153: 4766-4774)。用於此種測定試驗的重組IL-1 受體I型(包括人IL-1受體I型)，可從各種商業來源容易地獲得(參見例如R&D Systems, SIGMA) 。 IL-1受體I型也可以從使用本領域已知 的標準分子生物學和轉染技術引入合適宿主細胞內的表達構建體或載體 表達。表達的IL-1受體I型隨後可以分離且純化用於在結合測定中使用， 或可替代地直接以細胞結合形式使用。
例如，IL-1 p與IL-1受體I型的結合可以通過下述進行測定固定IL-1 p 結合抗體、使IL-ip與固定抗體接觸且測定IL-ip是否與抗體結合，使可 溶形式的IL-IRI與結合的IL-ip/抗體複合物接觸，並且測定可溶IL-IRI 是否與複合物結合。該方案也可以包括在與IL-ip接觸前使可溶IL-IRI 與固定抗體接觸，以證實可溶IL-IRI不與固定抗體結合。這個方案可以使 用用於結合相互作用的動力學分析的Biacore⑧儀器來進行。此種方案也可 以用於測定抗體或其他分子是否允許或阻斷IL-ip與IL-1受體I型的結合。
對於其他IL-ip/IL-lRI結合測定試驗，對IL-lp與IL-1受體I型的結 合的允許或阻斷可以通過下述確定比較在IL-ip抗體或其IL-lj5結合片 段存在或不存在下比較IL-ip與IL-IRI的結合。在該試驗的讀出中阻斷被 鑑定為與包含相應緩衝劑或稀釋劑但不包含IL-ip抗體或其IL-ip結合 片段的對照樣品比較，在抗IL-ip抗體或其IL-ip結合片段存在下IL-l卩 與IL-1受體I型結合的指定減少。該試驗讀出可以定性地呈現為指示阻斷 的存在或不存在，或可以定量地呈現為指示由於抗體或片段的存在所致的 結合減少的百分比或倍數。
可替代地或另外地，當IL-ip結合抗體或IL-ip結合片段基本上阻斷 IL-ip與IL-IRI結合時，與在不存在抗體或片段的情況下相同濃度的IL-lj5 和IL-IRI的結合比較，IL-ip與IL-IRI的結合減少至少10倍、可替代地 至少約20倍、可替代地至少約50倍、可替代地至少約100倍、可替代地 至少約1000倍、可替^地至少約10000倍或更多。作為另一個例子，當 IL-ip結合抗體或IL-ip結合片段基本上允許IL-1|5與IL-IRI結合時，IL-l(J 與IL-IRI的結合是在不存在抗體或片段的情況下相同濃度的IL-ip和 IL-IRI的結合的至少約90 % 、可替代地至少約95% 、可替代地至少約99 %、可替代地至少約99.9%、可替代地至少約99.99%、可替代地至少約99.999%、可替代地至少約99.9999%、可替代地基本上相同。
在某些實施方案中，本發明可以包括IL-ip結合抗體或IL-ip結合片 段，其與本文公開的一種或多種示例性抗體結合相同的表位或基本上相同 的表位。可替代地或另外地，該IL-ip結合抗體或IL-l(5結合片段與具有 美國申請號11/472813中描述的AB7可變區序列(序列在下文顯示)的抗 體竟爭結合。可替代地或另外地，本發明包括IL-ip結合抗體和片段，其 結合氨基紗列ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE ( SEQ ID NO: 1) 中包含的表位，命名為AB5和AB7的抗體(美國申請號11/472813 )所結 合的表位。如本文考慮的，可以使用本領域幾種已知方法中的任何一種容 易地測定IL-ip結合抗體或片段是否與一種或多種示例性抗體，例如命名 為AB7的抗體結合相同的表位或基本上相同的表位。
例如，由IL-ip結合抗體或片段結合的關鍵胺基酸殘基(表位)可以 使用肽陣列進行測定，例如PepSpotTM肽陣列(JPT P叩tide Technologies, Berlin, Germany)，其中在膜上直接合成跨越整個IL-1(5胺基酸序列的 一系列12個胺基酸的掃描肽，每種肽與前一種肽重疊11個胺基酸。攜帶 肽的膜隨後用抗體在室溫下例如以2 ng/ml的濃度探測2小時，以針對所 述抗體獲取表位結合信息。抗體與膜結合肽的結合可以使用二級HRP綴 合的山羊抗人(或適當時，小鼠)抗體，隨後使用增強型化學發光(ECL) 進行檢測。對應於成熟IL-ip蛋白質的特定胺基酸殘基或序列並且對於抗 體結合具有正評分的肽點，指示由該特定抗體結合的表位。
可替代地或另外地，可以執行抗體竟爭實驗，並且此種測定試驗是本 領域眾所周知的。例如，為了測定抗體或片段是否與如下肽序列中包含的 表位結合，所述肽序列包含對應於成熟IL-ip蛋白質的殘基83-105的M 酸ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE ( SEQ ID NO: 1)，可以將未知
(例如，AB7)進行比較。結合竟爭測定可以例如使用用於結合相互作用 的動力學分^f的813(:0^@儀器或通過ELISA來進^f亍。在此種測定中，未知 表位特異性的抗體就其與已知比較抗體(例如，AB7)竟爭結合的能力進行評估。與特定表位的竟爭結合通過已知抗體(例如，AB7)與該IL-ip 表位的結合減少至少約50%,或至少約70%、或至少約80%、或至少約 90%、或至少約95%、或至少約99%或約100%來確定，並且可以指示與 基本上相同的表位結合。
鑑於本公開中鑑定了示例性抗體的IL-ip結合區域和/或這些公開抗體 所識別的表位，可以考慮產生具有相似結合特徵和治療或i貪斷用途的其它 抗體，其是與本/〉開的實施方案平行的實施方案。
抗體的抗原結合片段包括保留與抗原特異性結合的能力(一般通過保 留抗體的抗原結合部分)的片段。已經充分確立了抗體的抗原結合功能可 以通過全長抗體的片段來實現。抗原結^P分的例子包括(i) Fab片段， 其為由VL、 VH、 CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii) F ( ab， ) 2片 段，其為包含在鉸鏈區處由二硫橋連接的2個Fab片段的二價片段；(iii) Fd片段，其為VH和CH1結構域；(iv) Fv片段，其為抗體單臂的VL 和VH結構域，(v)dAb片段(Ward等人，(1989 )Nature 341: 544-546)， 其為VH結構域；和(vi)分離的互補決定區(CDR)。單鏈抗體也包含 在術語抗體的抗原結合部分內。本發明的IL-ip結合抗體和片段也涵蓋單 價或多價、或者單體或多聚體(例如，四聚體)、含或不含支架(例如， 蛋白質或碳水化合物支架)的CDR衍生的結合結構域。
本發明的IL-ip結合抗體或片段可以是較大免疫粘附分子的部分，通 過抗體或抗體部分與一個或多個其他蛋白質或肽的共價或非共價結合而 形成。此種免疫粘附分子的例子包括使用鏈黴親和素核心區以構成四聚體 scFv分子(Kipriyanov, S. M.等人(1995 ) Human Antibodies and Hybridomas6: 93-101)，和使用半胱氨酸殘基、標記肽和C末端多組氨 酸標籤以構成二價和生物素化的scFv分子(Kipriyanov， S. M.等人(1994 ) Mol. Immunol. 31: 1047-1058)。包含抗體和片段的免疫粘附分子可以使 用標準重組DNA技術來獲得，如本文所述。優選的抗原結合部分是完整 結構域或完整結構域對。
本發明的IL-1卩結合抗體和片段也涵蓋由VH結構域組成的結構域抗
51體(dAb)片段(Ward等人，Nature 341: 544-546， 1989)。本發明的 IL-ip結合抗體和片段也涵蓋雙鏈抗體，它是二價抗體，其中Vh和V^結 構域在單條多肽鏈上表達，但使用的接頭太短而不允許相同鏈上的2個結 構域之間發生配對，從而迫使這些結構域與另一條鏈的互補結構域配對， 產生2個抗原結合位點(參見例如，EP 404,097; WO 93/11161; Holliger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci, USA 90: 6444-6448， 1993，和Poljak等人， Structure 2: 1121-1123， 1994)。雙鏈抗體可以是雙特異性或單特異性的。
本發明的IL-ip結合抗體和片段也涵蓋與IL-ip結合的單鏈抗體片段 (scFv) 。 scFv包含與抗體輕鏈可變區(VL)可操作地連接的抗體重鏈可 變區(VH)，其中重鏈可變區和輕鏈可變區一起或各自地形成結合IL-ip 的結合位點。scFv可以包含在M末端處的VH區和在氛基末端處的 區。可替代地，scFv可以包含在氨基末端處的VL區和在貌基末端處的VH 區。此外，儘管Fv片段的2個結構域V!^和Vu由分開的基因編碼，但它 們可以使用重組方法通過合成接頭而連接，所述合成接頭使得它們能夠被 製備成單條多肽鏈，其中Vl和Vh區配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv);參見例如Bird等人(1988) Science 242: 423-426;和Huston 等人(1988 ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 )。
scFv可以任選地進一步包含在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的多肽 接頭。此種多肽接頭一般包含1-50個胺基酸，可替代地3-12個胺基酸， 可替代地2個胺基酸。用於連接scFv中的重和輕鏈的接頭肽的例子包括5 胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 2)。其他例子包括這個 序列的一個或多個串聯重複(例如，包含Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ( SEQ ID NO: 2)的2-4個重複的多肽)，以產生接頭。
本發明的IL-ip結合抗體和片段也涵蓋重鏈抗體(HCAb)。在駝類 動物(camelids)(駱驅(camel)、單峰駝(dromedary)和美洲乾(llama); Hamers-Casterman等人，1993 Nature 363:446; Nguyen等人，1998 J. Mol. Biol. 275: 413 )、慈狀鯊(Nuttall等人，Mol Immunol. 38: 313-26， 2001 )、 護士篁(Greenberg等人，Nature 374: 168-73， 1995; Roux等人，1998 Proc,Nat. Acad. Sci. USA 95: 11804 )和科氏兔銀鮫(Nguyen等人，"Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation," 2002 Immunogenetics 54 (1 ) : 39-47)的某些免疫球蛋白同種型中發現常規抗 體H2L2結構的例外。這些抗體看起來可以僅使用重鏈可變區形成抗原結合 區域，因為這些功能抗體是僅重鏈的二聚體(稱為"重鏈抗體"或 "HCAbs")。因此，本發明的IL-ip結合抗體和片段的某些實施方案可以 是與IL-ip特異性結合的重鏈抗體。例如，IgG類的且缺乏輕鏈的重鏈抗 體由駝科(camelidae)動物產生，所述駝科動物包括駱駝、單峰駝和美洲 駝(Hamers陽Casterman等人，Nature 363: 446-448 ( 1993) ) 。 HCAbs 具有約95 kDa而不是常規IgG抗體的約160 kDa的分子量。它們的結合 結構域僅由重鏈可變結構域組成，通常稱為VHH以使其與常規VH區分。 Muyldermans等人，J. Mol. Recognit. 12: 131-140 (1999 )。重鏈抗體的 可變結構域有的稱為納米抗體(Cortez-Retamozo等人，Cancer Research 64: 2853-57， 2004)。納米抗體文庫可以如Conrath等人，(Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12， 2001 )中所述由免疫接種的單峰駝產生 或使用重組方法來產生。
因為不存在第一個恆定結構域(CH1)(由於缺失剪接共有信號故在 mRNA加工過程中被剪接掉)，所以可變結構域(VHH)之後緊接為鉸鏈 區、CH2和CH3結構域(Nguyen等人，Mol Immunol. 36: 515-524 (1999 ); Woolven等人，Immunogenetics 50: 98-101 ( 1999))。駝科V冊據才艮告 與IgG2和IgG3恆定區重組，所述IgG2和IgG3恆定區包含鉸鏈、CH2 和CH3結構域且缺乏CH1結構域(Hamers-Casterman等人，同上引文)。 例如，美洲駝IgGl是常規(H2L2)抗體同種型，其中VH與包含鉸鏈、 CH1、 CH2和CH3結構域的恆定區重組，而美洲駝IgG2和IgG3是僅重 鏈的同種型，其缺乏CH1結構域且不包含輕鏈。
儘管HCAbs缺乏輕鏈，但它們具有抗原結合庫(repereoire) 。 HCAbs 的遺傳產生機制在Nguyen等人Adv. Immunol 79: 261-296 (2001)和 Nguyen等人，Immunogenetics 54: 39-47 (2002)中得到綜述。篁魚，包括護士置，顯示相似的含抗原受體的單個單體V結構域。Irving等人，J. Immunol. Methods 248: 31-45 (2001) ; Roux等人，Pro" Natl. Acad. Sci. USA 95: 11804 (1998)。
Vhh包含小的完整抗原結合片段(例如，約15 kDa， 118-136個殘基 的片段)。已發現駝科V冊結構域以高親和力與抗原結合(Desmyter等人， J. Biol Chem. 276: 26285-卯，2001 )，其中V冊親和力一般在納摩爾範圍 內，並且可與Fab和scFv片段的親和力相當。V冊是高度可溶的且比Fab 和scFv片段的相應衍生物更穩定。VH片段相對難以以可溶形式產生，但 當構架殘基改變成更vhh樣時，可以獲得可溶性和特異性結合的改善。(參 見例如，Reichman等人，J Immunol Methods 1999， 231: 25-38.) 。 V冊 攜帶使得其更親水且阻止與BiP (免疫球蛋白重鏈結合蛋白質)長期相互 作用的氛基酸置換，正常在摺疊和裝配過程中Bip將在內質網(ER)中與 H鏈結合，直至它被L鏈替換。因為vhh增加的親水性，所以改善了從 ER中的分泌。
功能性vhh可以通過蛋白酶解切割所免疫的駝類動物的HCAb，通過 從所免疫的駝類動物的B細胞(導致重組VHH)、或從天然的或合成的文庫 中直接克隆V冊基因，而獲得。具有所需抗原特異性的V冊也可以通過謹 菌體展示技術來獲得。與Fabs或scFvs比較，在噬菌體展示中使用VHH 更筒單且更有效，因為僅需要克隆且表達l個結構域以獲得功能抗原結合 片段。Muyldermans, Biotechnol. 74: 277-302 (2001 ); Ghahroudi等人， FEBS Lett. 414: 521-526 (1997 );和van der Linden等人，J. Biotechnol. 80: 261-270 (2000)。用於產生具有駝科重鏈的抗體的方法也在美國專利 申請號20050136049和20050037421中得到描述。
核糖體展示方法可以用於鑑定且分離具有所需結合活性和親和力的 scFv和/或V冊分子。Irving等人，J. Immunol. Methods 248: 31國45( 2001 )。 核糖體展示和選擇具有產生和展示大型文庫(1014)的潛力。
其他實施方案提供通過駝源化過程產生的V冊樣分子，在該過程中修
飾非駝科VH，例如人V冊，以改善其溶解性且阻止非特異性結合。這通過用V冊樣殘基替換Vh的VL側上的殘基來達到，從而模擬更可溶的V冊
片段。當在體內施用於患者時，駝源化VH片段，特別U於人構架的那
些，預期顯示出大大減少的免疫應答，並且因此預期具有用於治療應用的
顯著優點。Davies等人，FEBS Lett. 339: 285-290 (1994); Davies等人, Protein Eng. 9: 531-537 (1996) ; Tanha等人，J. Biol. Chem. 276: 24774-24780 (2001) 和Riechmaim等人，Immunol. Methods 231: 25-38 (1999)。
廣泛多樣的表達系統可用於產生IL-l卩片段，包括Fab片段、scFv和 VHH。例如，原核和真核起源的表達系統可以用於大M^莫生產抗體片段和 抗體融合蛋白。特別有利的是允許將大量抗體片段分泌到培養基中的表達 系統。
雙特異性Fab-scFv ("雙體,，)和三特異性Fab- ( scFv) (2 )("三體，，) 的產生在Schoonjans等人(J Immunol. 165: 7050-57， 2000 )和Willems 等人(J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786: 161-76， 2003 ) 中得到描述。對於雙體或三體，使scFv分子與VL-CL (L)和VH-CI^ (Fd)鏈中的一個或兩個融合，例如為了產生三體，使2個scFvs與Fab 的C末端融合，而在雙體中，使l個scFv與Fab的C末端融合。由經由 肽接頭(無鉸鏈)或經由IgG鉸鏈與CH3融合scFv組成的"微型抗體"已 在Olafsen等人，Protein Eng Des Sel. 2004 Apr; 17(4): 315-23中得到 描述。
胞內抗體是顯示細胞內表達且可以操作細胞內蛋白質功能的單鏈抗 體(Biocca等人，EMBOJ.9: 101-108， 1990; Colby等人，Proc Natl Acad Sci USA. 101: 17616-21， 2004)。包含如下細胞信號序列的胞內抗體可以 如Mhashilkar等人(EMBO J 14: 1542-51， 1995 )和Wheeler等人(FASEB J. 17: 1733-5.2003)中所述產生，所述細胞信號序列使抗體構建體保留在 細胞內區域中。穿膜抗體(transbody)是可穿過細胞的抗體，其中蛋白質 轉導結構域(PTD )與單鏈可變片段(scFv)抗體融合。Heng等人，(Med Hypotheses. 64: 1105-8， 2005)。本發明的IL-ip結合抗體和片段也涵蓋這樣的抗體，其為SMIPs或對 於靶蛋白質特異的結合結構域免疫球蛋白融合蛋白。這些構建體是包含與 免疫球蛋白結構域融合的抗原結合結構域的單鏈多肽，所述免疫球蛋白結 構域是執行抗體效應子功能所需的。參見例如，WO03/041600、美國專利 申請20030133939和美國專利申請20030118592。
本發明的IL-ip結合抗體和片段也涵蓋免疫粘附素。一個或多個CDRs 可以共價或非共價地摻入分子內，以使其成為免疫粘附素。免疫粘附素可 以摻入CDR (s)作為較大多肽鏈的部分，可以使CDR (s)與另一條多 肽鏈共價連接，或可以非共價摻入CDR (s)。本文公開的CDRs允許免 疫粘附素與IL-lp特異性結合。
本發明的IL-ip結合抗體和片段也涵蓋抗體模擬物，其包含在有機或 分子支架(例如蛋白質或碳7K化合物支架)上構建的一個或多個IL-ip結 合部分。具有相對限定的三維結構、通常稱為蛋白質支架的蛋白質，可以 用作試劑用於^L計抗體模擬物。這些支架一般包含一個或多個易接受特異 的或隨機的序列變異的區域，通常對此類序列隨機化以產生蛋白質文庫， 由其中可以選擇出期望的產物。例如，抗體模擬物可以包含具有免疫球蛋 白樣結構域的嵌合非免疫球蛋白結合多肽，所述多肽包含具有2個或更多 個溶劑暴露環的支架，所述溶劑暴露環含有插入每個環內的來自親本抗體 的不同CDR,並對親本抗體所結合的配體顯示出選擇性結合活性。已提出
(Tramontano等人，J. Mol. Recognit. 7: 9， 1994; McConnell和Hoess, J. Mol. Biol. 250: 460， 1995)。其他蛋白質已作為構架進4亍測試，並且 已用於在a螺旋表面上(Nord等人，Nat. Biotechnol. 15: 772, 1997; Nord 等人，Protein Eng. 8: 601 ， 1995 ),在a螺旋束的a螺旋之間的環上(Ku 和Schultz， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6552， 1995)，和在由二石克橋 約束的環上，例如小蛋白酶抑制劑的那些環上(Markland等人， Biochemistry 35: 8045， 1996; Markland等人，Biochemistry 35: 8058, 1996; Rottgen和Collins, Gene 164: 243， 1995; Wang等人，J. Biol. Chem.270: 12250， 1995)展示隨機化的殘基。關於將支架用於抗體模擬物的方 法公開於美國專利5，770，380以及美國專利申請2004/0171116 、 2004/0266993和2005/0038229中。
依照本發明使用的優選IL-lj3抗體或抗體片段一般以高親和力與人 IL-ip結合(例如，如用BIACORE測定的)，例如對於IL-ip具有平衡 結合解離常數(KD)為約10nM或更少、約5nM或更少、約lnM或更 少、約500pM或更少，或更優選約250pM或更少、約100pM或更少、 約50pM或更少、約25pM或更少、約10pM或更少、約5pM或更少、 約3 pM或更少、約1 pM或更少、約0.75 pM或更少、約0.5 pM或更少、 或約0.3 pM或更少。
如通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)測定的，本發明的抗體或片段可 以例如以約10nM或更少，約5nM或更少、約2nM或更少、約1 nM或 更少、約0.75 nM或更少、約0.5 nM或更少、約0.4 nM或更少、約0.3 nM 或更少、或甚至約0.2 nM或更少的ICsn與IL-1卩結合。優選地，本發明 的抗體或抗體片段不與除IL-1外的任何靶交叉反應。例如，本發明抗體和 片段可以與IL-ip結合，但不與IL-la可檢測地結合，或相對於其與IL-la 的結合，其與IL-ip的結合具有高至少約100倍(例如，至少約150倍、 至少約200倍、或甚至至少約250倍)的選擇性。在某些實施方案中，與 在未施用本發明的抗體或片段的IL-ip刺激的動物中的血清IL-6水平比 較，根據本發明使用的抗體或片段可以使動物中IL-ip誘導的血清IL-6表 達受到至少50% (例如，至少60%、至少70%、或甚至至少80%)的抑 制。抗體可以結合IL-ip，但允許或基本上允許結合的IL-ip配體與IL-1 受體I型(IL-RI)結合。與阻斷或基本上幹擾IL-ip與IL-1RI結合的許 多已知IL-ip結合抗體不同，命名為AB5和AB7 (美國申請號11/472813 ) 的抗體與IL-ip配體選擇性結合，但允許結合的IL-ip配體與IL-1RI結合。 例如，命名為AB7的抗體與IL-ip表位結合，但仍允許結合的IL-ip與 IL-1RI結合。在某些實施方案中，抗體可以減少結合的IL-ip與IL-1RI 的相互作用的親和力。因此，在一個相關方面，本發明提供了具有至少一個上述特徵的IL-ip結合抗體或IL-ip結合抗體片段的用途。如本文所述， 本發明的任何前述抗體、抗體片段或多肽都可以是人源化的或人工程化 的。
本領域已知的各種IL-1 (例如，IL-ip)抗體和片段可以根據本文提 供的方法使用，包括例如下述專利和專利申請中描述的抗體或使用下述專 利和專利申請中描述的方法獲得的抗體US4，935，343; US 2003/0026806; US 2003/0124617; WO 2006/081139; WO 03/034984; WO 95/01997; WO 02/16436; WO 03/010282; WO 03/073982、 WO 2004/072116、 WO 2004/067568、 EP 0 267 611 Bl、 EP 0 364 778 Bl和美國申請號11/472813。 作為非限制性例子，抗體AB5和AB7 (美國申請號11/472813、 WO2007/002261 )可以依照本發明來使用。AB5和AB7的可變區序列如 下
AB5
輕^
PSRFSGSGSGTDYSLTISNLEOEDIATYFCLOGKMLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 3)
有下劃線的序列描述(從左到右)CDR1、 2和3。 重鏈
LVTVSS (SEQIDNO:4)
有下劃線的序列描述(從左到右)CDR1、 2和3。
AB7 輕^
PSRFSGSGSGTDYTLTISSLOOEDFATYFCLOGKMLPWTFGOGTKLEIK (SEQ ID NO: 5)
有下劃線的序列描述(從左到右)CDR1、 2和3。,鏈
OVOLOESGPGLVKPSOTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIROPSGKGLEWLAHIWWD
TLVTVSS (SEQ ID NO: 6)
有下劃線的序列描述(從左到右)CDR1、 2和3。
本文描述的抗體和抗體片段可以通過任何合適的方法進^f亍製備。用於 製備此種抗體和抗體片段的合適方法是本領域已知的。用於製備抗體和抗 體片段的其他方法如本文所描述的作為本發明的部分。如本文所描述的， 本發明的抗體、抗體片段或多肽可以分離或純化至任何程度。如本文所<吏 用的，分離的化合物是已從其天然環境中取出的化合物。純化的化合物是 在純度方面已增加的化合物，從而與其(i)在其天然環境中時或(ii)當 在實驗室條件下最初合成和/或擴增時比較，該化合物以更純的形式存在， 其中"純度"是相對術語，不一定指"絕對純度，，。
藥物組合物
根據本發明4吏用的IL-1 (例如，IL-ip)結合抗體和抗體片段可以配 制在組合物，特別是藥物組合物中，用於在本文的方法中使用。此種組合 物包含與合適載體混合的治療或預防有效量的本發明的IL-ip結合抗體或 抗體片段，所述載體例如藥學上可接受的試劑。 一般地，為了給動物施用， 在配製於藥物組合物中之前，充分純化本發明的IL-ip結合抗體和抗體片 段。
藥學上可接受的試劑包括載體、賦形劑、稀釋劑、抗氧化劑、防腐劑、 著色劑、調味劑和稀釋劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、填充劑、增量劑(bulking agent)、緩衝劑、遞送媒介物、張力劑、共溶劑、溼潤劑、M劑、緩衝 試劑、抗微生物劑和表面活性劑。
中性緩衝鹽水或與白蛋白混合的鹽7JC是示例性合適的栽體。藥物組合 物可以包括抗氧化劑例如抗壞血酸；低分子量多肽；蛋白質，例如血清白 蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；M酸例如 甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA;糖醇例如甘露 糖醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子例如鈉；和/或非離子型表面活性劑例如 Tween、普流尼克(pluronics)或聚乙二醇(PEG)。此外，例如，合適 的張力增強劑包括鹼金屬卣化物(優選氯化鈉或鉀)、甘露糖醇、山梨糖 醇等。合適的防腐劑包括勤L氯銨、疏柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸曱酯、 對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸等。過氧化氫也可以用作防腐劑。合 適的共溶劑包括甘油、丙二醇和PEG。合適的*劑包括咖啡因、聚乙烯 吡咯烷酮、P-環糊精或羥丙基-P-環糊精。合適的表面活性劑或溼潤劑包括 脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯例如聚山梨醇酯80、氣基丁三醇、卵磷脂、 膽固醇、tyloxapal等。緩衝劑可以是常規緩沖劑例如乙酸鹽、硼酸鹽、檸 檬酸鹽、磷酸鹽、碳酸氫鹽或Tris-HCl。乙酸鹽緩沖液可以是約pH 4-5.5， 和Tris緩沖液可以是約pH 7-8.5。另外的藥學試劑在Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,A. R. Geimaro，編輯,Mack Publishing Company, 1990中闡述。
組合物可以是液體形式或凍幹或冷凍乾燥形式，並且可以包括一種或 多種冷凍防護劑、賦形劑、表面活性劑、高分子量結構添加劑和/或增量劑 (參見例如美國專利6,685,940、 6，566，329和6,372,716)。在一個實施方 案中，包括冷凍防護劑，其為非還原糖例如蔗糖、乳糖或海藻糖。 一般包 括的冷凍防護劑的量使得在重構後所得到的製劑將是等滲的，儘管高滲或 略微低滲的製劑也可以是合適的。此外，冷凍防護劑的量應足以阻止蛋白 質在凍幹後不可接受量的降解和/或聚集。在凍幹前製劑中對於糖(例如， 蔗糖、乳糖、海藻糖)而言示例性冷凍防護劑濃度是約10 mM -約400 mM。在另一個實施方案中，包括表面活性劑，例如非離子型表面活性劑 和離子型表面活性劑，例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯 80 );泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188 );聚(乙二醇)苯基醚(例如Triton ); 十二烷1^L酸鈉(SDS);月桂^^克酸鈉；辛M苷鈉；月桂基-、肉豆蔻 基-、亞油基-或硬脂基-磺基甜菜鹼；月桂基-、肉豆蔻基-、亞油基-或硬脂 基-肌氨酸；亞油基-、肉豆蔻基-或鯨蠟基-甜菜鹼；月桂醯氨基丙基-、椰油醯M丙基-、亞油醯M丙基-、肉豆蔻醯氨基丙基-、棕櫚醯M丙基國
或異硬脂醯M丙基-甜菜鹼(例如月桂醯M丙基)；肉豆蔻醯氨基丙基 -、棕櫚醯氨基丙基-或異硬脂醯氨基丙基-二甲胺；曱基椰油醯基牛磺酸鈉
或甲基油基-牛磺酸二鈉；和MONAQUATtm系列(Mona Industries, Inc., Paterson， NJ.)、聚乙二醇、聚丙二醇、以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例 如普流尼克、PF68等)。可以存在於預凍千製劑中的表面活性劑的示例性 量是約0.001-0.5 % 。高分子量結構添加劑(例如充填劑、粘合劑)可以包 括例如阿拉伯樹膠、白蛋白、海藻酸、磷酸釣(二代)、纖維素、羧甲基 纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖 維素、孩史晶纖維素、葡聚糖、糊精、dextrates、蔗糖、tylose、預糊化澱粉、 硫酸鉤、直鏈澱粉、甘氨酸、膨潤土、麥芽糖、山梨糖醇、乙基纖維素、 磷酸氫二鈉、磷酸二鈉、焦亞硫酸二鈉、聚乙烯醇、明膠、葡萄糖、瓜爾 膠、液體葡萄糖、可壓縮糖、矽酸鎂鋁、麥芽糖糊精、聚氧化乙烯、聚曱 基丙烯酸酯、聚維酮、海藻酸鈉、黃蓍膠微晶纖維素、澱粉和玉米醇溶蛋 白。高分子量結構添加劑的示例性濃度為0.1重量％-10重量％。在其他實 施方案中，可以包括增量劑(例如，甘露糖醇、甘氨酸)。
組合物可以適合於腸胃外施用。示例性組合物適合於通過技術人員可 用的任何途徑注射或輸注到動物體內，例如關節內、皮下、靜脈內、肌內、 腹膜內、腦內(腦實質內)、腦室內、肌內、目艮內、動脈內、損傷內、直 腸內、經皮、經口和吸入途徑。腸胃外製劑一般將是無菌、無致熱原、等 滲的水溶液，任選包含藥學上可接受的防腐劑。
非水溶劑的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油例如歉脫油、和可注 射有機酯例如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳狀液或懸浮液， 包括鹽水和緩衝介質。腸胃外媒介物包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡 萄糖和氯化鈉、乳酸g氏液或不揮發性油。靜脈內媒介物包括液體和營 養補充劑、電解質補充劑，例如基於林格氏葡萄糖的那些，等。也可以存 在防腐劑和其他添加劑，例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣 體等。 一般參見，引入本文作為參考的Remington's PharmaceuticalScience,第16版，Mack編輯，1980。
本文描述的藥物組合物可以配製用於以這樣的方式控制或持續遞送， 所述方式在特定局部環境中提供局部濃度的產物(例如，快速濃注(bolus )、 貯庫(depot)效應)的持續釋放和/或增加的穩定性或半衰期。本發明考 慮，在某些實施方案中，此種組合物在初始貯存物中可以包括顯著更大量 的抗體或片段，而依照;$^>開內容實際上在任何時間點上釋放且可用的抗 體或片段的有效量是比初始貯存物低得多的量。組合物可以包括本發明的 IL-ip結合抗體、抗體片段、核酸或載體與聚合化合物(例如聚乳酸、聚 乙醇酸等)顆粒製品、以及試劑例如生物可降解基質、可注射孩i球體、微 嚢顆粒、微嚢、生物可蝕解顆粒珠、脂質體和可#^遞送裝置(提供活性 劑的控制或持續釋放)的製劑，隨後該製劑可以以貯庫型注射劑的形式遞 送。用於配製此種持續或控制遞送手段的技術是已知的，並且各種聚合物 已得到開發和用於藥物的控制釋方文和遞送。此種聚合物一般是生物可降解 和生物相容的。聚合物水凝膠，包括由對映體聚合物或多肽區段的^而 形成的聚合物水凝膠，以及具有溫度或pH敏感性質的水凝膠，由於在捕 獲生物活性蛋白質試劑(例如抗體)時涉及的溫和水性條件，而可能是用 於提供藥物貯庫效應所期望的。參見例如，在PCT申請公開WO 93/15722 中用於遞送藥物組合物的控制釋放多孔聚合物微粒的描述。
用於這個用途的合適材料包括聚乳酸(參見例如，美國專利 3,773,919)、聚(a-羥基羧酸)聚合物，例如聚-D- (-) -3-羥丁酸(EP 133，988A) 、 L-穀氨酸和y乙基-L-穀氨酸酯的共聚物(Sidman等人， Biopolymers， 22: 547-556( 1983 ))、聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)(Langer 等人，J. Biomed. Mater.Res.， 15: 167-277 ( 1981 )，和Langer， Chem. Tech.， 12: 98-105 (1982))、乙烯乙酸乙烯酯、或聚-D (-)-3-羥丁酸。 其他生物可降解聚合物包括聚(內酯)、聚(縮醛)、聚(原酸酯)和聚 (原碳酸酯)。持續釋放組合物還可以包括脂質體，其可以通過本領域已 知的數種方法中的任何一種進行制4<參見例如，Eppstein等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 82: 3688-92 (1985))。載體自身或其降解產物在耙組織中應是無毒的，並且不應使病症進一步惡化。這可以通過在耙病症的動 物模型中的常規篩選進行測定，或者如果此種模型不可得的話，在正常動 物中測定。
用於持續釋放的重組蛋白質的微嚢化已用人生長激素(rhGH)、幹 擾素-(rhlFN—)、白介素-2和MNrgpl20成功地進行。Johnson等人， Nat.Med.， 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993) ; Hora等人，Bio/Technologv. 8: 755-758 (19卯);Cleland， "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, 編輯，(Plenum Press: New York, 1995),第439-462頁；WO 97/03692， WO 96/40072， WO 96/07399;和美國專利號5,654,010。這些蛋白質的持續釋放製劑4吏用 聚丙交酯共乙交酯(PLGA)聚合物(由於其生物相容性和廣泛範圍的生 物可降解性質)進行開發。PLGA的降解產物——乳酸和乙醇酸可以在人 體內被快速清除。此外，這種聚合物的降解度可以取決於其分子量和組成。 Lewis ， "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (編輯)，Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems ( Marcel Dekker: New York, 1990 )， 第1-41 頁。持續釋放組合物的另外例子包括例如EP 58,481 A，美國專利號 3,887,699， EP 158，277A，加拿大專利號1176565， U. Sidman等人， Biopolymers 22， 547 [1983], R. Langer等人，Chem. Tech. 12， 98 [1982， Sinha等人，J. Control. Release 90， 261 [2003], Zhu等人，Nat. Biotechnol. 18， 24 [2000，和Dai等人，Colloids Surf B Biointerfaces 41 ， 117 [2005。
生物粘附聚合物也預期用於在本發明的組合物中使用或與本發明的 組合物一起使用。生物粘附劑是能夠與生物基底長時間粘附的合成和天然 存在的材料。例如，卡波姆和聚卡波非是聚(丙烯酸)的合成交聯衍生物。 基於天然存在物質的生物粘附遞送系統包括例如透明質酸，也稱為乙醯透 明質酸。透明質^A由D-葡糖醛酸和N-乙醯-D-葡糖胺殘基組成的天然存在的粘多糖。透明質酸存在於脊推動物的細胞外組織基質中，包括在結締 組織中，以及在滑液以及眼的玻璃體液和房水中。透明質酸的酯化衍生物 已用於產生微球體用於在遞送中使用，所述微球體是生物相容和生物可降
解的(參見例如，Cortivo等人，Biomaterials( 1991 )12: 727- 730; European
發明者A·索林格, D·埃裡瓦, P·J·斯加儂, R·J·鮑爾 申請人:愛克索馬技術有限公司