凋亡相關疾病的治療劑的製作方法

2023-12-08 23:34:31

專利名稱：凋亡相關疾病的治療劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於抑制凋亡的藥劑，其包括一種屬於midkine家族的蛋白質作為有效成分，而且本發明還涉及用於治療或預防凋亡相關疾病的藥劑。
背景技術：
由於與壞死的形態學差別而發現了凋亡(Kerr,J.F.R.等英國癌症雜誌(Brit.J.Cancer),26:239-257,1972)。在壞死中，整個細胞以及線粒體逐漸脹大而且發生細胞質的改變。最後，細胞膜崩解引起細胞溶解，通常伴有炎症。相反，在凋亡中，最早的改變發生在細胞核中，而且細胞核和細胞均皺縮。在細胞質中，細胞器例如線粒體仍保持正常。最終，形成凋亡小體，細胞完全被巨噬細胞或鄰近的吞噬細胞吞噬。無炎症發生。
壞死為一種「病理性細胞死亡」，其中被病理性因素例如燒傷所損傷的一群細胞同時死亡，而凋亡為一種「生理性細胞死亡」，其不僅由病理性因素引起，而且由各種生理性因素例如發育、免疫或激素作用引起。凋亡在時間和部位上隨機散在發生，而且作為對生物學現象至關重要的一種細胞死亡發揮重要的作用。
凋亡不僅在形態學上與壞死不同，而且在功能上也不同，其在組織中同與其對應的細胞分裂一起在細胞動力學上發揮重要的功能。因此，凋亡性異常與各種疾病的發生密切相關。與凋亡減少相關的疾病包括癌症、自身免疫病、病毒感染等。凋亡增加可以引起獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)、阿耳茨海默病、肌萎縮性側索硬化症、色素性視網膜病、小腦變性、再生障礙性貧血、心肌梗死、腦卒中、再灌注損傷、酒精性肝病、牙周病等(Craig,B.T.科學(Science),267:1456-1462,1995)。自從1993年，在其它凋亡研究後出現了在區域性腦缺血模型(大鼠)中支持凋亡的報導(Linnik,M.D.等中風(Stroke),24:2002-2009,1993；Li,Y.等大腦血流和代謝雜誌(J.Cereb.Blood Flow.Metab.),15:389-379,1995；Linnik,M.D.等分子腦研究(Mol.Brain Res.),32:116-124,1995；Islam,N.等神經科學通訊(Neurosci.Lett.),188:159-162,1995；Soriano,M.A.等神經報導(Neuroreport),7:425-428,1996；Charriaut-Marlangue,C.等大腦血流和代謝雜誌，16:186-194,1996；Du,C.等大腦血流和代謝雜誌，16:195-201,1996)。
最近，已經通過誘導或抑制凋亡嘗試對凋亡相關疾病進行治療或預防。例如，已知的方法包括通過給藥治療上有效且生理上可接受的二氧代哌嗪阻止或推遲凋亡的方法(WO95/03054)、通過由凋亡相關基因誘導或抑制凋亡治療和預防凋亡相關疾病(WO96/12017)、通過提高細胞中Bcl-2的活性來治療或預防引起凋亡的疾病或病態的方法(WO94/27426)、通過給藥治療上有效劑量的新型Fas蛋白質治療患者Fas介導的細胞死亡的方法(WO95/13701)、通過特異性結合人Fas抗原的一種單克隆抗體抑制Fas配體介導的凋亡的藥物組合物(WO95/10640)，等等。
發明公開無法提供治療眾多引起異常凋亡性細胞死亡的疾病的有效方法，所述的疾病包括上述所有的疾病。本發明的一個目的是提供一種通過抑制上述的凋亡來治療或預防凋亡相關疾病的方法。本發明的發明者發現midkine(MK)可以抑制由抑癌劑和缺血性應激所引起的凋亡，由此完成本發明，所述的midkine為一種結合肝素的生長和分化因子，其具有多種生物學活性，例如軸突的延長、神經細胞的存活以及血管內皮細胞中纖維蛋白溶解系統的激活。
本發明涉及用於抑制凋亡的藥劑，其包括一種屬於MK家族的蛋白質作為有效成分，更具體涉及(1)用於抑制凋亡的藥劑，其包括一種屬於MK家族的蛋白質作為有效成分；(2)(1)的用於抑制凋亡的藥劑，其中屬於MK家族的蛋白質為midkine；(3)用於治療或預防凋亡相關疾病的藥劑，其包括一種屬於MK家族的蛋白質作為有效成分；(4)(3)的用於治療或預防凋亡相關疾病的藥劑，其中凋亡相關疾病為心臟病；(5)(3)的用於治療或預防凋亡相關疾病的藥劑，其中凋亡相關疾病為腎病；(6)(3)的用於治療或預防凋亡相關疾病的藥劑，其中凋亡相關疾病為肝病；(7)(3)的用於治療或預防凋亡相關疾病的藥劑，其中凋亡相關疾病為神經變性疾病；(8)(3)至(7)的用於治療或預防凋亡相關疾病的藥劑，其中屬於MK家族的蛋白質為midkine；以及(9)一種Bcl-2增強劑，包括屬於MK家族的蛋白質作為有效成分。
本發明還涉及下述利用屬於MK家族的蛋白質的方法。
本發明涉及通過給藥一種屬於MK家族的蛋白質抑制凋亡的方法、通過給藥一種屬於MK家族的蛋白質治療或預防凋亡相關疾病的方法，以及通過給藥一種屬於MK家族的蛋白質增強Bcl-2表達的方法。
本發明進一步還涉及屬於MK家族的蛋白的下述用途。具體為，本發明涉及一種屬於MK家族的蛋白用於製備抑制凋亡的藥物組合物的用途、一種屬於MK家族的蛋白質用於製備治療或預防凋亡相關疾病的藥物組合物的用途以及一種屬於MK家族蛋白質用於製備增強Bcl-2的藥物組合物的用途。
本發明基於發明者發現MK，一種結合肝素的生長和分化因子，可以抑制由抑癌劑和缺血性應激所引起的凋亡。因此，本發明的第一個方面為通過一種屬於MK家族的蛋白抑制凋亡。
Midkine被發現為一種基因的產物，所述基因在由視黃酸引起的胚胎腫瘤細胞的分化和誘導過程的早期階段被誘導表達(Kadomatsu,K.等生物化學與生物物理學研究通訊(Biochem.Biophys.RES.Commun.),151:1312-1318,1988)。Pleiotrophin(PTN)發現於新生大鼠的腦中，是一種具有軸突延長能力的肝素結合蛋白質(Rauvala,H.等歐洲分子生物學組織雜誌(EMBOJ.)8:2933-2941,1989)。Midkine和Pleiotrophin都是肝素結合蛋白質，能夠控制發育過程中的細胞增殖、存活和分化(Tomomura,M.等生物化學雜誌(J.Biol.Chem.),265:10765-10770；Li,Y.等科學，250:1690-1694,1990；Rauvala,H.等歐洲分子生物學組織雜誌，8:2933-2941,1989；Wellstein,A.等生物化學雜誌，267,2582-2587,1992)。成熟的MK和PTN分別由123和136個胺基酸組成，其中富含基本胺基酸和半胱氨酸，相互之間具有50％的同源性(Tomomura,M.等生物化學雜誌，265:10765-10770；Kuo,M.等生物化學(Biol.Chem.),265:18749-18752；Tsutsui,J.等生物化學與生物物理學研究通訊，176:792-797,1991)，並且組成了MK家族(Muramatsu,T.發育生長分化(Dev.Growth Differ.),36:1-8,1994)。
抑癌劑通過誘導凋亡殺傷細胞(Gunji,H.等癌症研究(CancerRes.),51:747-743,1991；Kaufmann,S.H.癌症研究，49:5870-5878,1989)。已知輻射和紫外線也能夠誘導凋亡(Miura,M.,Yamada,T.編輯實驗醫學增刊(Experimental Medicine Supplement)「術語庫凋亡」1996)。已經證實由缺血引起的腦細胞的延遲神經元死亡也是由於凋亡(神經科學雜誌(J.Neurosci.),19:4200-4210,1999)。
基於上述背景，本發明參照下列圖和表進行說明。

圖1顯示在用抑癌劑處理誘導凋亡的培養細胞中活細胞的數量(通過MTT法計數)。與只用抑癌劑處理的對照組相比，在MK+抑癌劑處理組中，活細胞數依照MK的濃度而增加。圖2顯示了用抑癌劑處理誘導凋亡並用Hoechst33342染色的培養細胞。圖案B(培養12小時)和E(培養24小時)明確顯示在只用抑癌劑處理的對照組中染色質的凝聚以及凋亡特異的凋亡小體的形成。相比之下，圖案C(培養12小時)和圖案F(培養24小時)顯示該現象在MK+抑癌劑處理組中受到抑制。圖3用數字說明了圖2的結果。結果表明，與僅用抑癌劑處理的對照組相比，在MK+抑癌劑處理組中凋亡細胞死亡率依MK的濃度而下降。
在培養的細胞系中，凋亡與細胞增殖相似，是由細胞周期控制的。在細胞周期中，G1期具有最低的DNA含量(2C)，而G2期的DNA含量是G1期的2倍(4C)。在S期，DNA含量依據DNA的合成率而介於2C和4C之間。在M期，DNA含量在細胞分裂過程中從4C降至2C。因此，通過用結合DNA的螢光染料(例如碘化丙啶、溴化乙錠等)對細胞進行染色並通過流式細胞儀(FACS)測定螢光強度來確定細胞DNA的含量可以確定在細胞周期中細胞的分布。在DNA染色之前，通過用70％乙醇固定而斷裂的低分子量DNA從細胞中滲漏，使得可以檢測到DNA含量低於G1期的凋亡細胞。本發明的發明者測定了存活細胞的DNA含量來確定細胞在G1、S和S/M期的分布。在MK存在或不存在的情況下，將神經細胞暴露於紫外線，並用DNA結合的顏料進行染色，通過FACS檢測DNA來分析細胞周期。如在表1中所示，與對照組相比，在MK存在的情況下，G1期細胞的數量幾乎增加10倍，但在S期降低了八分之一到四分之一。這些結果表明MK抑制由紫外線或輻射誘導的細胞凋亡。
此外，MK可以減輕藥物誘導的神經病和肝病(國際專利申請PCT/JP98/01050號)。進行下述的分析來證實MK是否抑制在泌尿小管細胞中的凋亡。凋亡細胞以染色質DNA在核小體(185bp)水平的斷裂為特徵。通過TdT介導的dUTP-生物素切口末端標記(TUNEL方法)可以對斷裂DNA的量進行組織化學檢測。TUNEL方法通過用生物素-dUTP標記DNA的3』-OH末端檢測DNA。
將抑癌劑給藥MK基因敲除的小鼠，並製備表現強烈損傷的代表性組織小鼠腎臟的石蠟切片，通過TUNEL方法檢測DNA斷裂(原位凋亡檢測試劑盒；TaKaRa)。在給藥鹽水的組中存在一些TUNEL陽性細胞核，而在給藥MK的組中觀察到少得相當多的TUNEL陽性細胞核(圖5)。在未處理的正常小鼠組中，未觀察到TUNEL陽性細胞核。這些結果表明MK可以抑制由抑癌劑引起的泌尿小管細胞凋亡。
本發明在MK存在下通過體外和體內凋亡誘導實驗首次證實MK可以抑制由各種刺激引起的凋亡性細胞死亡。本領域的技術人員可以很容易地料想屬於MK家族的PTN可能類似地抑制凋亡，而通過進行已建立的凋亡實驗方法可以證實該假設。因此，PTN也包括在本發明之中。
本發明提供對於緩解或抑制凋亡有效的藥劑。本發明還包括給藥在治療上抑制或延遲凋亡有效數量的MK家族蛋白質。體內抑制凋亡的症狀包括由正常血液循環下降導致的瞬時缺血中凋亡性細胞死亡的抑制以及再灌注損傷後在心肌、腦和腎臟中凋亡性細胞死亡的抑制。已知，凋亡是由於冠狀動脈阻塞而發生再灌注損傷的一個原因；由脊髓/頭部損傷引起的或伴隨之的重度癱瘓以及由其它損傷例如凍傷引起的再灌注損傷。MK家族對於治療這些凋亡相關疾病特別有效。MK家族對於治療被認為通過超氧化物歧化酶(SOD)或抗氧化劑可治療的適應症也有效。冠狀動脈阻塞後缺血性細胞損傷可以導致急性心肌梗死(AMI)。已知AMI在微小的區域內引起栓子、血栓或局部壞死。隨後，由低血壓引起的突發的富氧血液不足影響心臟、腦、脾、腎、腸、肺和睪丸。直至最近，梗死相關的細胞死亡被認為是由缺血直接導致的。目前，已知凋亡是由缺血區中的組織以及富氧血在這些區域中的再灌注引起的。圖8和9顯示通過將MK給藥瞬時前腦缺血模型小鼠抑制了海馬區中的凋亡。此外，圖12顯示通過將MK給藥相同的缺血模型小鼠抑制了由凋亡引起的海馬區中的延遲神經元死亡。這些結果提示屬於MK家族的蛋白質可以抑制由缺血應激引起的凋亡。
另外，圖16顯示甚至在缺血發生後通過將MK給藥缺血模型小鼠也抑制了凋亡。這說明屬於MK家族的蛋白可以是治療各種因凋亡而導致的疾病的有效藥物。
在蒙古沙鼠中觀察到MK減輕瞬時前腦缺血後的海馬延遲細胞死亡。已經發現NGF和bFGF在該系統中改善延遲神經元死亡(Shigeno,T.等，神經科學雜誌(J.Neurosci.),11:2914-2919,1991；Nakata,N.等腦研究(BrainRes.),605:354-356,1993)。用於保護所需的NGF靜脈注射劑量為10μg(Shigeno,T.等，神經科學雜誌，11:2914-2919,1991)，而對於bFGF需要用滲透性微型泵持續注射(Nakata,N.等腦研究，605:354-356,1993)。通過該方法檢測的MK在體內表現出顯著的神經營養活性。
此外，給藥NGF對於在缺血損傷發生後7天挽救海馬神經細胞不發生延遲神經元死亡有效，然而在損傷後28天則無效(Ishimura,H.等腦研究，789:194-200,1998)。本發明的發明者證實MK即使在損傷後28天時也表現出顯著的活性。更重要的是，損傷後給藥的MK提高了神經細胞的存活。
MK在體內具有防止神經細胞死亡的活性的事實提示可以將MK用作在大腦梗塞和神經變性疾病中防止神經細胞死亡的藥物。在性質上MK蛋白為鹼性的，其在一定程度上可以通過血腦屏障。已經觀察到MK和NGF在促進胚胎神經細胞的存活上的協同效應(Michikawa,M.等神經科學研究雜誌(J.Neurosci.Res.)35:530-539,1993)。這提示同時給藥MK和其它神經營養因子的可能性。
因此，在急性缺血的開始和在富氧血液的循環過程中或循環之後立即給藥屬於MK家族的蛋白質也是有效的。
圖6的蛋白質印跡結果顯示在培養細胞中MK增強了Bcl-2的表達。在用抑癌劑處理細胞時也觀察到這種表達增強。
在Tsujimoto等克隆了Bcl-2基因後(Tsujimoto.Y.等科學，226:1097-1099,1984),Bcl-2基因是在凋亡調節機制研究領域中研究最深入研究的基因之一。利用雙雜交方法等，根據在Bc1-2編碼區間的同源性已經發現了組成該家族的一些分子。通過結合這些分子以及分子間的相互作用，很多研究集中在控制凋亡的機制上。對該家族分子的鑑定增加了涉及Bcl-2的凋亡調節機制的複雜性，而且人們必須考慮各分子間的關聯和量的平衡以了解全局。
各種刺激可以誘導凋亡，例如癌基因，如p53抑癌基因、c-myc、ras等，抑癌劑、紫外線和輻射以及以Fas配體為代表的某些種類細胞因子。許多誘導信號最終匯入一個由凋亡執行因子半胱天冬氨酸酶(caspase)和凋亡抑制因子Bcl-2家族控制的共同通路(Vaux,D.L.等自然(Nature),335:440-442,1998)。
在這些情況下，本發明提供了在由伴有凋亡的疾病或紊亂所影響的細胞中提高Bcl-2的藥劑，以及在癌症或病毒感染細胞中降低Bcl-2活性以提高細胞對治療的敏感性的藥劑。
本發明利用了Bcl-2的凋亡抑制活性。針對很多種疾病的共同生理學機制是有效而經濟的，因為這樣無須對每種特定的疾病研製不同的藥物。
用於實施該發明的MK和PTN可以是天然的、化學合成的或重組的蛋白質等等。MK和PTN的胺基酸序列並不僅限於完整的序列。對MK和PTN可以進行部分修飾而不破壞它們的生物學功能。通過修飾，例如對序列中胺基酸的缺失、插入或置換，可以獲得生物學上與MK和PTN相似的基因。例如，修飾為在特定的位點對遺傳序列的改變，其產生在化學上等價的胺基酸。這樣的改變應該基於胺基酸殘基間的相對相似性，包括疏水性、親水性、電荷和大小。考慮這些特性，優選的置換是本領域技術人員所共知的，其包括，但不限於，甘氨酸/丙氨酸、纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸、天門冬醯胺/穀氨醯胺、天門冬氨酸/穀氨酸、絲氨酸/蘇氨酸、賴氨酸/精氨酸以及苯丙氨酸/酪氨酸。
具有MK或PTN完整蛋白質的至少一種功能的片段包括於本發明之中。例如，MK C-末端的60-121位的C-末端部分或62-104位的C-末端部分(Muramatsu,H.等生物化學和生物物理學研究通訊203:1131-1139,1994)具有軸突延長能力和肝素結合位點，其應用屬於本領域技術人員的技術。本發明中的蛋白質包括多肽。
此外，通過定點誘變可以製備MK或PTN的生物學或功能等價體。
通過在宿主細胞中表達克隆的MK或PTN而獲得的蛋白質的修飾類型和程度主要取決於宿主細胞的翻譯後修飾能力以及在蛋白質的胺基酸序列中存在的修飾信號。例如，眾所周知，在細菌細胞例如大腸桿菌中不發生糖基化。因此，當需要糖基化時，通常將蛋白質在真核細胞中表達。酵母或昆蟲細胞像哺乳動物細胞那樣通常進行翻譯後糖基化。本發明中所用的MK或PTN包括這些修飾。
在口服給藥蛋白質例如MK或PTN時，它們在消化道內迅速被蛋白酶快速消化。為了使MK或PTN在體內穩定，可以通過將其結合於水溶性大分子，例如聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮來製備雜合的MK或雜合的PTN。已經製備了它們與IL-6或TNF-α的雜合體，而且通過篩選最適雜合條件已經增強了其功能(Tsutsumi,Y.等英國癌症雜誌(Br.J.Cancer),74:1090-1095；Tsutsumi,Y.等控制釋放雜誌(J.Control Release),33:447-451,1995)。
只要疾病與凋亡相關，並未特別限定由本發明的藥劑治療或預防的凋亡相關疾病。例如，藥劑可以用於腎小球腎炎，如急性腎小球腎炎、慢性腎小球腎炎、糖尿病性腎炎、腎小球硬化或紅斑狼瘡、由腎母細胞瘤、中毒或缺血引起的泌尿小管疾病、免疫相關疾病，如AIDS、由免疫抑制劑或抑癌劑引起的胸腺細胞異常、外周T細胞下降、或免疫缺陷疾病、循環器官疾病，例如血管狹窄或缺血；肝病，如由藥物或病毒感染引起的肝病、消化道疾病、神經病，如由大腦缺血導致的神經細胞疾病、肌萎縮性側索硬化症、神經變性疾病，如阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈病或帕金森病、神經元發育疾病(精神病)等、伴隨器官或組織移植物的排斥；由細菌毒素、植物毒素或動物毒素引起的損傷；假斑禿、形態學異常；組織發生缺陷；組織萎縮等。上述疾病僅僅為實例，因此本發明用於治療凋亡相關疾病的藥劑不僅用於這些實例，而且其它疾病只要與凋亡相關也可使用。
本發明治療凋亡相關疾病的藥劑不僅可以用於治療而且可以用於預防這些疾病。
雖然根據經驗可以確定有效濃度和劑量，但一天可以給藥大約1μg至100mg/kg一次或多次。確定劑量屬於本領域技術人員的技術範疇。劑量取決於患者的性別、年齡、體重或狀態。將治療上有效劑量的MK溶於鹽水、磷酸鹽緩衝液(PBS)等中，可以通過靜脈給藥。其它給藥途徑包括口服、皮下、肌肉內、黏膜、腹腔內或直接給藥特定的器官，例如給藥心臟來治療心肌梗死伴發的細胞死亡，但是並不只限於此。
附圖簡述圖1顯示Wilms腫瘤衍生的G401細胞系在未處理組(對照組)、順鉑(100μM)處理組以及MK(1、10或100ng/ml)+順鉑(100μM)處理組中培養12和24小時的存活率，由通過MTT方法測定的吸光度(OD540-655)表示。
圖2顯示對在未處理組(對照組)、順鉑(100μM)處理組以及MK(1、10或100ng/ml)+順鉑(100μM)處理組中培養12和24小時的Wilms腫瘤衍生的G401細胞系的Hoechst 33342染色。圖案A、B和C分別顯示培養12小時的未處理組、順鉑處理組和MK+順鉑處理組。圖案D、E和F分別顯示培養24小時的未處理組、順鉑處理組和MK+順鉑處理組。
圖3顯示表現出細胞核內染色質凝聚和核碎片的凋亡性細胞死亡數量對細胞總數的百分比。
圖4顯示蘇木精-伊紅染色的129/Sv MK基因敲除小鼠(雜合子)(雄性，8至12周齡)腎臟切片。上午將鹽水(10ml)和MK(200μg)分別向鹽水給藥組和MK給藥組腹膜內給藥，在下午將順鉑(9.3mg/kg)向各組腹膜內給藥(第0天)。從第1天至第3天，將鹽水(10ml)和MK(200μg)向各組腹膜內給藥。在第4天，取出腎臟，並用石蠟包埋製備切片。用蘇木精-伊紅對所獲的切片進行染色。從未處理的野生型小鼠中製備切片並用蘇木精-伊紅染色作為對照。
圖5顯示由TUNEL方法對石蠟包埋切片的分析。
圖6顯示由如下蛋白質印跡方法對Wilms腫瘤衍生的G401細胞系中Bcl-2表達的分析。準備了6個組，由MK未處理組、人MK(100ng/ml)處理組和小鼠MK(100ng/ml)處理組組成的3個順鉑未處理組以及由MK未處理組、人MK(100ng/ml)處理組和小鼠MK(100ng/ml)處理組組成的3個順鉑(100μM)處理組。
圖7用數字顯示圖6的結果。
圖8顯示取自蒙古沙鼠得到的海馬區CA1神經細胞，對所述的蒙古沙鼠在瞬時前腦缺血性損傷發生前即刻將鹽水或MK(各2μg)注射到腦室，在注射後7天通過TUNEL方法對海馬區CA1神經細胞進行分析。顯微鏡的放大倍數為25倍。
圖9顯示相同的圖放大100倍。
圖10顯示取自蒙古沙鼠的海馬區CA1神經細胞的蘇木精-伊紅(HE)染色切片。通過在瞬時前腦缺血性損傷發生前即刻向蒙古沙鼠的腦室中注射鹽水(a)、2μg MK(c)、1μg MK(d)、0.5μg MK(e)或0.25μg MK(f)製備切片並在注射後7天染色。短線的長度代表0.5mm。顯微鏡的放大倍數為25倍。
圖11顯示與圖10中相同的切片放大100倍。短線的長度代表50μm。
圖12顯示在圖10的海馬區CA1中HE染色的存活神經細胞中細胞核的數量與CA1區的全長的比。n代表動物的數量。
圖13顯示在瞬時前腦缺血性損傷發生前即刻向腦室內注射2μg MK後1、2、3和4周取自蒙古沙鼠的海馬CA1區中存活的神經細胞數量與CA1區全長的比。
圖14顯示通過TUNEL方法分析的海馬區CA1中的神經細胞。通過在瞬時前腦缺血性損傷發生前即刻向蒙古沙鼠的腦室中注射鹽水(a)、2μgMK(c)、1μg MK(d)或0.5μg MK(e)製備神經細胞並在注射後7天進行分析。凋亡的細胞深染。短線的長度代表50μm。
圖15顯示海馬區CA1中凋亡細胞的數量與整個細胞數量的比。
圖16顯示海馬區CA1中存活神經細胞的數量與CA1區長度的比。通過在蒙古沙鼠中瞬時前腦缺血性損傷發生後2、4、6、12和24小時向腦室內注射2μg MK製備細胞，並在注射後7天對每種處理的存活細胞數進行計數。
實施本發明的最佳方式下面參考實施例對本發明進行詳細說明，但不能認為將其限於此。
實施例1MK的製備(1)通過未審查公開的日本專利申請(JP-A)平9-95454號中實施例1的方法製備用於實施例2至7(1)的midkine(SEQ ID NO:3)。
(2)通過下述方法製備用於實施例7(2)至8的midkine。
為了製備人MK蛋白質，將包括人MK開放讀框的cDNA片段(1-432位核苷酸，J.Tsutsui等生物化學和生物物理學研究通訊，176卷，792-797,1991)插入到酵母表達載體pPIC9(Invitrogen)中。將該重組質粒轉染到酵母(畢赤酵母(Pichia pasrotis GS115；Research Corporation Technologies)中，並用組氨酸和G418篩選目的克隆。隨後利用柱色譜依下述順序對酵母分泌到培養基中的人MK蛋白質進行純化。
1．SP Steamlines(Pharmacia；用20mM pH5.5的醋酸鹽緩衝液吸附並洗滌，用含NaCl的20mM pH3.5的醋酸鹽緩衝液洗脫)2．Sulfated Cellulofine(Seikagaku Kogyo，日本；用10mM pH7.2的磷酸鹽緩衝液吸附，用含0.7M NaCl的緩衝液洗滌，用含2.0M NaCl的緩衝液洗脫)3．Superdex 75pg(Pharmacia；用鹽水進行凝膠過濾)4．Poly Sulfoethyl A(Poly LC Co.；用含0.6M NaCl的20mM緩衝液吸附，用含0.88M NaCl的緩衝液洗滌，用含2M NaCl的緩衝液洗脫)。
5．Superdex 75pg(Pharmacia；用鹽水進行凝膠過濾)將Midkine製劑用鹽水透析，並將純化的蛋白質按每份0.1ml分裝儲存於-80℃。在蛋白融化後立即使用，以免反覆冷凍和融化。利用MK促進胚胎神經元存活的活性作為指標對純化的MK蛋白質的活性進行檢測(M.Michikawa，等神經科學研究雜誌(J.Neurosci.Res.)35,530-539,1993)。
實施例2對抑癌劑所誘導凋亡的抑制效應(MTT方法)通過抑癌劑在由嬰兒腎癌Wilms腫瘤衍生的G401細胞系中誘導凋亡以通過MTT方法檢測MK的凋亡抑制效應。
準備5個組未處理組、順鉑(100μM)處理組以及MK(1、10或100ng/ml)+順鉑處理組。
將G401細胞懸於含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco調整的Eagle培養基(10％FBS/DMEM)中，並以5000個細胞/孔接種於96孔板中。將培養板在CO2溫箱中溫育(37℃,5％CO2；本文中後面也用此條件)以便細胞能夠貼附於培養板。
用含有0.1％FBS的DMEM(0.1％FBS/DMEM)洗滌細胞兩次(以後除非特別說明，均將0.1％FBS/DMEM用於洗滌。)，並在0.1％FBS/DMEM中培養過夜。培養後，將MK以1、10或100ng/ml加入到MK處理組中。將各組培養6小時。向順鉑處理組中加入0.5mg/ml的順鉑(Bristol-Myers SquibCompany；東京)6μl(100μM)。將各組在0.1％FBS/DMEM中培養2小時。然後將細胞洗滌3次，並向MK處理組中加入MK至1、10或100n/gml。將各組在0.1％FBS/DMEM中培養12小時或24小時。
向上述5組的各孔中加入15μl的MTT試劑(5mg/ml)(Wako PureChemical Laboratories；大阪)並培養4小時。然後向各孔中加入100μl含有20％SDS的10mM鹽酸並在室溫放置24小時。利用微量培養板讀出器測定各孔的吸光度(OD540-655)。結果示於圖1中。
在12小時培養組中，與順鉑處理組相比，MK(1、10或100ng/ml)+順鉑(100μM)處理組顯示存活細胞數以MK濃度依賴的方式增加。這個結果揭示MK抑制由抑癌劑引起的細胞死亡。
實施例3對抑癌劑所誘導凋亡的抑制效應(Hoechst染色方法)準備5個組未處理組、順鉑(100μM)處理組以及MK(1、10或100ng/ml)+順鉑處理組。
將G401細胞(2×104)接種於3.5cm培養皿中並在10％FBS/DMEM中培養過夜。向各培養皿中加入10％FBS/DMEM並繼續培養24到48小時。將細胞洗滌兩次並在0.1％FBS/DMEM中培養過夜。向MK處理組中加入MK至1、10或100ng/ml，並在0.1％FBS/DMEM中培養6小時。向順鉑處理組中加入順鉑至100μM，並在0.1％FBS/DMEM中培養2小時。培養後，將細胞洗滌3次。然後，向MK處理組中加入人MK至1、10或100ng/ml，並在0.1％FBS/DMEM中培養12小時或24小時。
用固定劑(甲醇∶乙酸=3∶1)將細胞在室溫下固定10分鐘，並在室溫下乾燥30分鐘。向其中加入Hoechst 33342(ICN Biomedicals；Ohio，美國)在室溫下對細胞染色10到30分鐘。用水洗滌細胞3次，風乾並放置在螢光顯微鏡上(Olympus,BX60)並照相。圖2A、2B和2C顯示未處理組、順鉑(100μM)處理組以及MK(100ng/ml)+順鉑(100μM)處理組，這些組均培養了12小時。圖2D、2E和2F顯示未處理組、順鉑(100μM)處理組以及MK(100ng/ml)+順鉑(100μM)處理組，這些組均培養了24小時。與B和E相比，含有Hoechst 33342染色的細胞核並帶有凝聚染色質和核碎片的細胞數在C和F中明顯降低。
圖3顯示死於凋亡並含有凝聚染色質和核碎片的細胞核的細胞數與具有Hoechst 33342染色的細胞核的細胞總數之間的比。與順鉑(100μM)處理組相比，在培養了12小時和24小時的MK(1、10或100ng/ml)+順鉑(100μM)處理組中凋亡性細胞死亡的頻率均以MK濃度依賴的方式降低。在24小時培養組中，與12小時培養組相比，活細胞數也增加。
實施例4誘導凋亡的神經細胞中DNA含量的測定將培養瓶用100ng/ml MK或10μg/ml MK進行包被。還準備了未用MK包被的培養瓶(對照)。
將小鼠神經母細胞瘤C1300和膠質瘤的雜交細胞(Nelson P.G.等腦研究，147:245,1978)NG108細胞系培養於含有10％FBS/DMEM的Falcon 3110細胞培養瓶(75cm2,BECTON DICKINSON)中直至細胞接近匯合。培養後，將細胞暴露於紫外線數小時(UV照射量60-100J/m2)以誘導凋亡。
通過離心收集細胞(4℃,100rpm,10min)，並用10到12ml的樣品緩衝液[1g葡萄糖/1L PBS(-)；用0.22μm濾器過濾]洗滌兩次。用樣品緩衝液將細胞調整為1×106至3×106個細胞/ml，並將其1ml在離心管(FALCON；15×75mm)中離心(4℃,1000rpm,10min)。棄掉上清液並將沉澱劇烈振蕩10秒。向其中滴加冰冷的乙醇(70％)(1ml)並在4℃固定過夜。
將固定過夜的細胞短暫振蕩並離心(3000rpm,5min)。將上清液中的70％乙醇棄掉至0.2ml或更少。緩慢振蕩含有細胞的離心管，並向其中加入1ml碘化丙錠(PI)染劑。PI染劑含有0.5ml的20×PI溶液、0.1ml的100×RNA酶A溶液以及10ml的樣品緩衝液。通過製備1mg/ml的PI溶液(SIGMA)，將其經0.22μm濾器過濾並在4℃避光保存獲得PI的20倍稀釋物。通過將核糖核酸酶A(I-A型)(SIGMA)(10000U/ml)調整至125mg/ml(80U/ml)製備RNA酶A溶液(100×)。
將細胞輕輕晃動，在室溫下溫育30分鐘或更久，並通過流式細胞術進行檢測。結果示於表1中。與對照組相比，在MK存在下G1期細胞的比例增加大約10倍，而S期細胞的比例降低了八分之一到四分之一。這些結果表明MK可以抑制由紫外線或輻射誘導的細胞凋亡。。
表1各細胞周期中細胞的比例(％)

實施例5腎臟泌尿細胞中對凋亡的抑制效應將其中破壞了MK基因的部分第2和第3外顯子的129/Sv雜合基因敲除小鼠(雄性，8至12周齡)(生物化學(Biochemistry)7,1997,68卷，1239頁，4-p-1244)分成2組鹽水給藥組和MK給藥組(每組14隻小鼠)。製備未處理的野生型小鼠(4隻小鼠)作為對照。MK的劑量為200μg/kg而鹽水的劑量為10ml/kg。
在上午將MK或鹽水向兩個組的小鼠腹膜內給藥，在同一天的下午將順鉑9.3mg/kg向兩個組的小鼠腹膜內給藥(該天為第0天)。
在第1天的上午，將MK或鹽水以與第1天相同的方式向各小鼠腹膜內給藥。
在第2天，從各組(未處理的野生型小鼠組和兩個處理組)中選出4隻小鼠收集尿液和全血。將所收集血液中的凝塊在37℃收縮1小時並離心(4℃,8000rpm,10min)以分離血清。將血清在-20℃保存直至實驗。從各小鼠中切除腎臟，用福馬林緩衝液固定(2到4天)，並利用自動包埋機(SAKURA,ETP-120A)用石蠟包埋。利用切片機(ERMA OPTICAL WORKSLTD,NO.1061)對石蠟包埋的腎臟進行切割以調節至4μm。至於兩組中的其餘小鼠，將MK或鹽水以與第1天相同的方式腹膜內給藥。
在第3天，以與第2天相同的方式從2個處理組的每個組中選出6隻小鼠收集尿液和全血。從各小鼠中切除腎臟，並用石蠟包埋。至於兩組中的其餘小鼠，將MK或鹽水以與第2天相同的方式腹膜內給藥。
在第4天，即最後一天，從2個處理組的每個組中的4隻小鼠收集尿液和全血。切除各小鼠的腎臟並用石蠟包埋。
對日常診斷中通常用作腎功能不全的指標的血液尿素氮(BUN)和血清肌酐進行測定，並對尿液中的蛋白質進行簡單定量。用蘇木素-伊紅對腎臟的石蠟切片進行染色(圖4)。在MK給藥組中觀察到MK緩解由順鉑引起的腎功能不全的效應。結果提示MK可以抑制腎臟泌尿小管細胞中的凋亡。隨後，進行了下述的實驗。
在第4天，通過TUNEL方法對腎臟石蠟切片中代表嚴重損傷的DNA斷裂進行分析(原位凋亡檢測試劑盒；TaKaRa)。結果示於圖5中。在鹽水給藥組中一些細胞核為TUNEL反應陽性，而在MK給藥組中TUNEL陽性細胞數量顯著降低。在未處理的野生型組中未觀察到TUNEL陽性細胞核。這些結果顯示MK抑制在腎臟泌尿小管細胞中順鉑誘導的凋亡。
實施例6增強Bcl-2表達的效應對MK在Bcl-2基因表達上的效應進行了檢測。準備了6個組未處理組、順鉑(100μM)處理組、人MK(100ng/ml)處理組、人MK(100ng/ml)+順鉑(100μm)處理組、小鼠MK(100ng/ml)處理組以及小鼠MK(100ng/ml)+順鉑(100μm)處理組。
將G401細胞接種於3.5cm培養皿中並在10％FBS/DMEM中培養直至細胞接近匯合。將細胞洗滌兩次並在0.1％FBS/DMEM中培養過夜。然後，將人MK或小鼠MK(JP-A平8-196293號)以100ng/ml加入到MK處理組中並培養6小時。向順鉑處理組中加入順鉑至100μM，並培養2小時。培養後，用0.1％FBS/DMEM將細胞洗滌3次，在0.1％FBS/DMEM中培養10小時並用PBS洗滌3次。
向每個培養皿中加入200μl緩衝液[1％Triton X-100,150mM NaCl,10mM Tris(pH7.4),1.0mM EGTA,0.5％NP-40,1mM PMSF,0.1μg/mlapiotinin,40nM Iewpeptin]並在冰上放置20分鐘。用細胞刮子將各培養皿中的細胞刮下並利用帶26號針頭的注射器混合8到10次。將各培養皿的細胞在離心管中於4℃以12000rpm離心30分鐘。對沉澱的蛋白進行定量(BCA試劑盒；PIERCE)。通過蛋白質印跡法利用抗Bcl-2單克隆抗體(500×)(Dako，丹麥)和抗小鼠HRP抗體(Jackson Immuno Research)對由各培養皿製備的沉澱物(50μg)進行分析(圖6)。將每個泳道中的帶進行數位化顯示(圖7)。
圖6和7顯示人MK和小鼠MK均增強了培養細胞中Bcl-2的表達。對抑癌劑處理的細胞也觀察到相似的增強效應(圖7)。在利用這些細胞時，表現出增強效應的濃度為大約10ng/ml或更高(數據未示)。
實施例7體內凋亡抑制效應(在缺血損傷前給藥)(1)將每組6至16隻蒙古沙鼠(6至8周齡，體重60-80g)放置於「HONEYMATICM-3」(KIMURA MEDICAL INSTRUMENT LTD.)中，其為一種氟烷的麻醉劑傳送裝置，而且該容器中充滿了適量的吸入麻醉劑「氟烷」(根據日本藥典為三氟溴氯乙烷)。將被麻醉的動物固定於裝備有注射器的手術桌(NARISHINGE SCEITIFIC INSTRUMENT LAB.；SR-5N型，第97024號)上。對頭進行中線切開後，用牙鑽在距前囟點2mm的位點處朝左眼球方向鑽一個用於插入適當大小注射器的洞。通過這個洞，將2μl 0.25mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的MK溶液(0.5μg、1.0μg、2.0μg)(在生理鹽水中)用微量注射器(HAMILTON MICROLITER#701)分別注射到腦室中。製備注射鹽水組和偽手術(Sham-op)組作為對照組。在向腦室中注射後，將小鼠放置4分鐘並縫合手術部位。將胸部在中線切開以暴露右和左頸總動脈。用兩個Sugita腦動脈夾(標準型；MIZUHO)將兩條動脈都結紮以停止血流5分鐘，然後讓血液再次循環。在進行缺血過程中保持腦溫和體溫恆定(37±2℃)。區別各小鼠，在其從麻醉中甦醒後並放置於保育籠中飼養使動物可以自由攝水和攝食。一周後，將小鼠在用含有0.2％的肝素(Novo Heparin Injection100；Japan Hoechet Marion Russell LTD)和4％多聚甲醛溶液的鹽水灌注時固定並斷頭。利用剪刀將腦切開取出，並再在4％多聚甲醛固定劑中浸泡一天。利用雙刃刮刀(Feather)將前囟點前2mm後方的部分分成3份。將這些切片進一步固定24小時。將含有背側海馬的組織脫水、浸染並用石蠟包埋。
由該石蠟塊從距海馬頂端0.5到1.0mm處或從矢狀縫後1.4到1.9mm處製備5μm的切片，並通過TUNEL方法觀察(原位凋亡檢測試劑盒，TaKaRa)。結果示於圖8(25倍)和圖9(100倍)中。圖8顯示僅僅在鹽水給藥組中在海馬神經元區CA1中觀察到大量含有TUNEL反應陽性細胞核的細胞。圖9也顯示只有在鹽水給藥組中觀察到含有TUNEL反應陽性細胞核的細胞，而且還顯示很多萎縮的神經細胞。在偽手術組或MK給藥組中，未觀察到這種神經細胞。這些結果揭示MK可以保護神經細胞不發生缺血應激誘導的凋亡。
(2)按照在(1)中所述的方法，就在缺血損傷發生前將MK溶液(0.063μg、0.125μg、0.25μg、0.5μg、1μg或2μg)注射到腦室中來檢驗MK對延遲的神經元死亡的保護效應。損傷7天後，將CA1區用蘇木素-伊紅染色。低放大倍數(25倍)的顯微照片示於圖10中(圖10a鹽水組、圖10b偽手術組、圖10cMK2μg、圖10dMK1μg、圖10eMK0.5μg、圖10fMK0.25μg)，而高放大倍數(100倍)的顯微照片示於圖11中(圖11a鹽水組、圖11b偽手術組、圖11cMK2μg、圖11dMK1μg、圖11eMK0.5μg、圖11fMK0.25μg)。在鹽水給藥組(圖10a)、對照偽手術組(圖10b)以及施各種濃度MK組(圖10c-f)中未觀察到形態學差別。與偽手術組(圖10b)或施0.5到2μg MK組(圖10c-e)相比，在鹽水給藥組中神經細胞的數量明顯降低。在高放大倍數下，在鹽水組(圖11a)中觀察到萎縮細胞核的退化，而在偽手術組(圖11b)或施0.5-2μg MK組(圖11c-e)中觀察到存活的圓形核。在施0.25μg MK組(圖11f,1.0mM EDTA)中觀察到退化的細胞核。
為進行定量評價，獲得了CA1區中每個單位長度CA1中所含的存活細胞核的數量(圖12)。該值在鹽水給藥組為18±25/mm(n=15，均值±標準差)，而偽手術組為265±38/mm(n=23)。對於0.5、1或2μg MK給藥組，該值分別為217±109(n=7)、228±84(n=8)和243±82(n=10)。在低濃度MK時該值降低(圖12)。在鹽水給藥組和MK(0.5至2μg MK)給藥組之間有顯著性差異(ANOVA和post-hoc Fisher’s PLSD分析，p＜0.0001)。
對MK的用藥效果是否持續進行了檢測。在偽手術組中神經細胞的數量為263±31個細胞/mm(n=11)，而在鹽水給藥組中為10±10個細胞/mm(n=15)，在這些組中動物在缺血損傷後7天被斷頭。在再次給藥2μg MK並在缺血後1、2、3或4周被斷頭的蒙古沙鼠中，神經細胞的數量如下1周後219±74(n=10)2周後152±72(n=5)3周後185±83(n=4)4周後157±60(n=4)通過ANOVA和post-hoc Fisher’s PLSD分析(p＜0.0001)比較表明在任何測試組中神經細胞的存活率均顯著高於鹽水給藥組。與1周時神經細胞的數量相比，2周時神經細胞的數量降低，但該值在此後甚至4周後也沒有降低(圖13)。因此，MK阻止延遲的神經元死亡而並非將其延遲。
因為在海馬區CA1中延遲的神經元死亡被認為時由凋亡引起的，所以通過TUNEL方法對切片進行染色來檢測凋亡引起的DNA斷裂。在結紮前即刻給藥MK，在缺血損傷後7天評價效果。在鹽水給藥組中觀察到大量深染的細胞核(圖14b)，而在偽手術組中未觀察到著色的細胞核(圖14b)。在施0.5到2μg MK組中觀察到少量著色的細胞核(圖14c-e)。通過測定表現出凋亡陽性反應的細胞核的數量與細胞總數的比進行定量評價(圖15)。該值對鹽水給藥組為69.7±17.0(n=7)，而對於偽手術組為0.0±0.0(n=8)。對於施0.5、1或2μg MK組，該值分別為7.8±19.8(n=7)、11.0±14.7(n=8)和4.6±12.2(n=7)。在鹽水給藥組和MK(0.5至2μg MK)給藥組之間在統計學上有顯著性差異(ANOVA和post-hoc Fisher’s PLSD分析，p＜0.0001)。由這些結果證實MK能夠抑制凋亡引起的延遲的神經細胞死亡。
實施例8體內凋亡抑制效應(缺血損傷後給藥MK)將MK(2.0μg)在缺血損傷後2、4、6、12或24小時注射到蒙古沙鼠瞬時前腦缺血模型的腦室中。在缺血損傷7天後計數存活海馬神經細胞的數量(圖16)。當在損傷後2小時給藥MK時，與偽手術組相比，存活神經細胞的數量降低，而其大大高於鹽水給藥組。即使在損傷後24小時給藥MK存活率也增加(圖16)。
在結紮後2、4、6、12或24小時給藥的組中存活海馬神經細胞的數量分別為120±36(n=4)、90±23(n=6)、80±13(n=6)、86±34(n=6)以及93±22(n=4)個細胞/mm(圖16)。這些值顯著高於鹽水給藥組(p＜0.05)。
產業適用性本發明的發明者發現屬於MK家族的蛋白可以延遲或抑制由各種刺激，如抑癌劑、紫外線和輻射、缺血應激等所誘導的凋亡。基於該發現，本發明提供了用於治療或預防各種凋亡所致疾病，例如腦病、心臟病、腎病、神經病或肝病等的新型藥劑，其包括屬於MK家族的蛋白質作為有效成為。
權利要求
1．用於抑制凋亡的藥劑，其包括屬於MK家族的蛋白質作為有效成分。
2．權利要求1的用於抑制凋亡的藥劑，其中屬於MK家族的蛋白質為midkine。
3．用於治療或預防凋亡相關疾病的藥劑，其包括屬於MK家族的蛋白質作為有效成分。
4．權利要求3的用於治療或預防凋亡相關疾病的藥劑，其中凋亡相關疾病為心臟病。
5．權利要求3的用於治療或預防凋亡相關疾病的藥劑，其中凋亡相關疾病為腎病。
6．權利要求3的用於治療或預防凋亡相關疾病的藥劑，其中凋亡相關疾病為肝病。
7．權利要求3的用於治療或預防凋亡相關疾病的藥劑，其中凋亡相關疾病為神經變性疾病。
8．權利要求3至7中任一項的用於治療或預防凋亡相關疾病的藥劑，其中屬於MK家族的蛋白質為midkine。
9．一種Bcl-2增強劑，其包括屬於MK家族的蛋白質作為有效成分。
全文摘要
一種屬於midkine(MK)家族的蛋白質被發現抑制由抗癌藥、紫外線照射以及局部缺血性應激所誘導的凋亡。該發現使得提供含有屬於MK家族的蛋白質作為活性成分的新型藥物用於治療和預防由凋亡引起的任何疾病，例如心臟疾病、腎臟疾病、神經系統疾病或肝臟疾病成為可能。
文檔編號A61K38/18GK1316907SQ99810696
公開日2001年10月10日 申請日期1999年7月9日 優先權日1998年7月10日
發明者池松真也, 小田宗宏, 佐久間貞俊, 吉田義弘, 門松健治, 蘆田欣也, 紀光助, 村松喬 申請人:明治乳業株式會社, 村松喬