治療或預防肥胖症和糖尿病的微生物及含有所述微生物的藥物組合物的製作方法

2023-12-08 22:44:21

專利名稱：治療或預防肥胖症和糖尿病的微生物及含有所述微生物的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於治療或預防肥胖症和糖尿病的微生物，這些微生物通過將能被人體吸收的單糖如葡萄糖、果糖和半乳糖等或二糖轉化為不被腸道吸收的多聚體，因此可減少被吸收入人體中單糖或二糖的量，本發明還涉及含有所述微生物的藥物組合物。
根據NIH報告(The Evidence Reportclinical guideline on theidentification，evalation，and trentment of overweight and obesity inadults，1999，NIH)，約有9700萬美國人超重和過度肥胖，其中與過度肥胖相關的II型糖尿病人數達到約1570萬人。甚至，有報導每年約有20萬人死於與肥胖症相關的疾病(Dan Ferber，Science，283，pp1424，1999)。
糖尿病是在全世界傳播最廣泛的慢性病之一，其對社會公眾、糖尿病病人和他們的家屬都是相當大的花費。
此外，有許多病原因子導致幾種類型糖尿病，因此其致病原因也各不相同。例如，真正的糖尿病具有高血糖和高尿糖雙重特徵，其是由胰島素的生成或其作用不適當而引起的一種碳水化合物代謝失調。
非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)或II型糖尿病為一種成人病，他們儘管胰島素生成和作用都正常，但在外周靶組織中具有胰島素耐受性。
三種重要的代謝失調會發生非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)，如胰島素耐受性、被營養物刺激的胰島素分泌功能失調和肝臟中葡萄糖的過量合成。非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)的治療(控制血糖水平)失敗會由於動脈粥樣硬化導致死亡，還可能導致糖尿病晚期併發症，如視網膜病、腎病或神經病。
磺醯脲和雙胍化合物治療以及飲食--鍛鍊療法都包括在對非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)的治療中以控制血糖水平。近來，治療化合物如甲福明或阿卡波糖可用於治療非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)。但某些糖尿病人的高血糖通過飲食和/或鍛鍊療法或使用上述治療化合物仍然不能得到適當控制。對於這些病人，應使用外源胰島素。
對病人來說，使用外源胰島素是很昂貴和痛苦的方法。而且還會給病人帶來多種有害的現象和併發症。例如，由於沒有吃飯或不正常鍛鍊，胰島素劑量的計算錯誤會導致胰島素響應(低血糖)，而有時並找不到具體的原因。此外，胰島素注射可能發生對胰島素的局部或全身過敏或免疫抗性。
有幾種方法可用來預防或治療肥胖症和糖尿病，如飲食--鍛鍊療法、手術或化療等。飲食--鍛鍊療法為一種方法，即吃低熱量、低脂肪食物和進行有氧鍛鍊，但這種方法一般認為對普通大眾不成功，因為其需要長期地經常性地堅持這種療法。
去除體內脂肪手術能達到立竿見影的效果，但存在諸多限制，如手術風險、除脂效果難持久和花費太高等。
採用藥物療法能降低血糖水平，抑制葡萄糖的吸收，加強胰島素的作用或者誘導減少食慾等，是一種目前在該領域最積極開發的方法。至今開發出的治療和預防肥胖症和糖尿病的藥物利用了多種生理機理。
已經開發出了提高胰島素作用的一些藥物，如磺醯脲、甲福明、pioglitazone或thiazolidindione衍生物等。磺醯脲具有刺激胰腺β細胞分泌胰島素的效果，但會產生副作用引起低血糖，即使血糖值低於正常水平。
甲福明主要用於胰島素非依賴性糖尿病人，這些病人用飲食或鍛鍊療法效果不佳。該藥抑制肝中葡萄糖異生，促進葡萄糖在肌肉和脂肪組織中的儲存。但該藥已知會產生噁心、嘔吐和腹瀉等副作用。
pioglitazone由日本TAKEDA開發，通過增加細胞對胰島素的敏感性來促進胰島素的作用(Kobayashi M.et al，Diabetes，41(4)，PP476-483，1992)。
β-3-腎上腺素受體抑制劑(BRL-35135)為一種刺激體內脂肪分解的藥物，能特異性作用於脂肪細胞分解體內脂肪，並將他們轉化為熱量，同時降低血糖水平。
胰脂肪酶抑制劑(Orlistat，瑞士羅氏生產)是一種已知的抑制脂肪吸收的藥物，通過抑制胰脂肪酶的作用從而抑制脂肪吸收，但它也抑制脂溶性維生素的吸收，從而導致乳腺癌。
通常，抑制食慾的藥物作用於大腦中的兒茶酚胺而降低食慾。但右芬佛拉明和芬佛拉明具有神經毒性和引起瓣心臟病的副作用。同樣，細布曲明有增加心跳速率和提高血壓的副作用。
α-葡萄糖苷酶抑制劑(阿卡波糖，德國拜爾生產)為一種已知的葡萄糖吸收抑制劑藥物。阿卡波糖是假單糖，能競爭性的抑制存在於胃腸道微絨毛上的多種α-葡萄糖苷酶的作用。但如攝入量過大則導致腹瀉(W.Puls et al.，Front.Horm.Res.2，235，1998)。
澱粉酶抑制劑已被開發出來，通過抑制澱粉酶作用將碳水化合物轉化為低聚糖，防止源自過量攝取營養物所產生的代謝失衡(Sanches-Monge R.et al.J.Biochem.，183，0037-40，1989)。
攝取食用性纖維是獲得抑制肥胖效果最簡易的方法，通過食用多量蔬菜纖維，降低吸收到腸道中葡萄糖和脂肪的量。但這種方法存在一些問題，生產食用性纖維需要大量的設備和人工，其生產效率很低。
多聚物如異麥芽三糖，葡聚糖和普魯蘭(支鏈澱粉)抑制源自吸收葡萄糖而導致的血糖水平增加。但這些物質也有嚴重的副作用。例如，葡聚糖可延遲血液凝結時間而導致過量出血。
在上述的多種藥物中，食用性纖維被認為是預防或治療肥胖症最有用的藥物，因為其不破壞人代謝平衡，是一個天然物質。
微生物食用性纖維由微生物產生，如葡糖桿菌種(Gluconobactersp.)，土壤桿菌種(Agrobacterium sp.)，木醋桿菌(Acetobacter xylinum，)，漢氏醋桿菌(A.hansenii)，巴氏醋桿菌(A.pasteurianus)，醋化醋桿菌(A.aceti)，根瘤菌種(Rhizobium sp.)，產鹼菌種(Alcaligenes sp.)，八疊球菌種(Sarcina sp.)，嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)，乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)，瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)，保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)，清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)，路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)，乳乳桿菌(Lactobacillus lactis)，乳桿菌德氏亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.)，瑞士葡萄糖乳桿菌jugurti變種(Lactobacillus helveticusglucose var.jugurti)，明串珠菌葡聚糖保加利亞種(Leuconostoc dextranicum Bulgariscus sp.)，Campestrissp.，鞘氨醇單胞菌種(Sphingomonas sp.)。
這些微生物生產的食用性纖維用作多種食品的穩定劑、增稠劑、乳化劑、吸溼劑以及化妝品和藥品原料。微生物纖維素、黃原膠、acetan等、瓜爾豆膠、次槐豆膠、卡拉膠、藻朊酸(alginate)、來自海草的瓊脂等都已商品化。
乳桿菌種(Lactobacillus sp.)菌株是人體腸內正常微生物菌群的主要成分。它對健康消化器官的維持和陰道環境的重要作用很早以前即已知曉(Bible，D.J.，ASM News，54661-665，1988；Reid G.and A.W.Bruce，In H Lappin-Scott(de.)，Bacterial biofilms，CambridgeUniversity Press，Cambridge，England，p.274-281，1995；Reid G.，A.W.Bruce，J.A.McGroarty，K.J.Cheng，and J.W.Costerton，Clin.Microbiol.Rev.，3335-344，1990)。通常，乳桿菌菌株生存在消化器官[嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)，腸乳桿菌(L.intestinalis)，約氏乳桿菌(L.johnsonii)，路氏乳桿菌(L.reuteri)等]，陰道黏膜[陰道乳桿菌(L.vanginals)，加氏乳桿菌(L.gasseri)]，食品[希氏葡萄酒乳桿菌(wine-L.hilgardii)]，乳桿菌飲料[高加素乳桿菌(L.Kefir)，馬乳酒樣乳桿菌(L.Kefiranofaciens)]，奶酪[乾酪乳桿菌(L.casei)]，醋[耐酸乳桿菌(L.acetotolerance)]，口腔[口乳桿菌(L.oris)]，酵母[清酒乳桿菌(L.sake)，同型腐酒乳桿菌(L.homohiochi)]，果汁[L.Kunkeei，蘋果乳桿菌(L.mali)，豬雙臼乳桿菌(L.suebicus)]，發酵過的香腸或魚[香腸乳桿菌(L.farciminis)，消化乳桿菌(L.alimentarious)]等。
為維持健康的腸道和預防尿生殖道感染，許多人服用含乳桿菌種(Lactobacillus sp.)菌株的健康補充食品。近來，乳桿菌的多種微生態調節活性被公開，且其受關注程度與日俱增，這些活性如免疫控制，血液中膽固醇水平控制，癌症預防，風溼病治療，對乳糖的敏感性緩解，遺傳過敏性皮炎影響的減輕，以及腹瀉、便秘、尿生殖道感染等的預防。
根據美國公共健康服務指引，所有262種存放在ATCC裡的乳桿菌都被劃分為「生物安全性1級」，其表示至今所知這些菌種絕無潛在危險會給人類和動物帶來疾病。在大約60種乳桿菌菌株中無一對人體有毒。
近來，用乳桿菌生產胞外食用性纖維的研究正積極推進。據報導，用這些菌生產食用性纖維的方法很複雜，因有許多基因介入到所述方法中，並且食用性纖維生產量很小(Int.J.Food Microbiol.，Mar 3 401-2，87-92，1998；Current Opinion in Microbiology，2598-603，1999；Appl.Environ.Microbiol.，Feb 642，659-64，1998；FEMS Microbiol.Rev.Apr 232 153-77，1999；FEMS Microbiol.Rev.Sep 71-2，113-30，1990)。
利用眾所周知的生產食用性纖維的微生物醋酸桿菌(Acetobactersp.)進行纖維素合成也已進行了多種研究(Aloni Y.，cohen R.，BenzimanM.，Delmer D，J Biological chemistry 1716649-6655，1989；Ascher M.，J.Bacteriology，33249-252，1937；Benziman M.，Burger-RachamimvH.，J.，Bacteriology，84625-630，1962；Brown AM，Journal of Polymerscience，59155-169，1962；Brown AM，Gascoigne JA，Nature，1871010-1012，1960；Calvin JR，Planta DP.Benziman M.，Padan E，PANSUSA，795282-5286，1982；Dehmer DP.Brown RM Jr.，Cooper JB，Lin FC，Science，23082-825，1985)。
醋酸桿菌是一種嚴格需氧菌，但具有兩個特徵，其一是在極其稀少的氧條件下仍能生存並存活，其二在該條件下通過自身合成纖維素食用性纖維懸浮於表面尋求氧氣。根據有關醋酸桿菌將葡萄糖轉化為纖維素食用性纖維的量和速率的研究(Brown et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol 73(12)，4565-4569)，醋酸桿菌以400amol/細胞/小時的速率將葡萄糖轉化為纖維素。此速率相當於4×1015個細胞每小時將大約200g葡萄糖轉化為纖維素。
偶有報導醋酸桿菌能代謝蔗糖。但自然界中確存在著能將蔗糖轉化為葡萄糖的醋酸桿菌(PNAS，9pp14-18)。如今，美國FDA已經批准木醋桿菌(Acetobacter xylinum)用於合成乙酸和山梨糖，並被分類為一般安全性微生物(GRAS一般認為安全)。
如上所述，到目前為止，已有多種研究和努力來開發治療或預防肥胖症和糖尿病的藥物，但結果還不太令人滿意。上述的多種化學物質已被開發為治療肥胖症和糖尿病的藥，但都有幾種副作用。這些藥物使體內脂肪和有價值的蛋白質一起流失。結果，沒有任何一種藥物能單獨從源頭治療或抑制肥胖症和糖尿病。
本發明的另一個目的是提供藥物組合物，該組合物含有藥物有效劑量的所述微生物，通過從源頭降低吸入人體腸道中的寡糖量，從而治療或預防肥胖症和糖尿病。
本發明中用作藥物組合物活性成分的微生物優選屬於醋酸桿菌屬(Acetobacter genus)，葡糖桿菌屬(Gluconobacter genus)，乳桿菌屬(Lactobacillus genus)和無色桿菌屬(Acrobacterium genus)。這些微生物生活在腸道中，對人體無害，能將寡糖轉化為不被人體吸收的多糖。尤其下列微生物可作為本發明藥物組合物的微生物，如木醋桿菌(Acetobacter xylinum)，漢氏醋桿菌(A.hansenii)，巴氏醋桿菌(A.pasteurianus)，醋化醋桿菌(A.aceti)，乳脂乳球菌(Lactococcuscremoris)，瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)，保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)，清酒乳桿菌(L.sake)，路氏乳桿菌(L.reutari)，乳乳桿菌(L.lactis)以及德氏乳桿菌(L.delbrueckii)、德氏乳桿菌亞種(L.delbrueckiisubsp.)和瑞士葡萄糖乳桿菌(L.helveticusglucose)變種。用作本發明藥物組合物活性成分的微生物優選為乳桿菌種(Lactobacillus sp.)BC-Y009(KCTC0774BP)株和醋酸桿菌(Acetobacter sp.)BC-Y058(KCTC0773BP)株。
本發明藥物組合物可以藥物製劑片劑或膠囊的任一種形式給藥，所述藥物製劑包括賦形劑、藥物允許的媒介和載體，這些物質可根據給藥途徑進行選擇。本發明中藥物製劑可進一步包含輔助的活性組份。
乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、treguhkense latex，明膠、矽酸鈣、細結晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯，滑石、硬脂酸鎂或礦物油等都可用作本發明中藥物組合物的載體、賦形劑或稀釋劑等。
此外，本發明的藥物組合物可進一步包括潤滑劑、潤溼劑、乳化劑、懸浮液穩定劑、防腐劑、甜味劑和香料等。本發明的藥物組合物可通過多種公知的方法以腸衣製劑生產，以便於藥物組合物的活性成分即微生物能順利通過胃而不被胃酸所破壞。
另外，本發明的微生物可以常規方法製備的膠囊形式使用。例如，標準賦形劑和本發明的冷幹微生物混合製成小球藥丸，然後將藥丸裝填入硬的明膠膠囊中。此外，本發明的微生物和藥物允許使用的賦形劑如液體膠、纖維素、矽酸鹽或礦物油等混合製作懸浮液或分散液，這種懸浮液或分散液可裝入軟的明膠膠囊中。
本發明的藥物組合物可製成腸衣片供口服使用。本申請中的術語「腸衣」，包括所有常規藥物允許使用的包衣，這些包衣不被胃酸降解，但在小腸中能充分分解並快速釋放出本發明的微生物。
本發明的腸衣能在合成胃酸如pH1的HCl溶液中在36-38℃維持2小時以上，並優選在合成腸液如pH6.8的KH2PO4緩衝液中在0.5小時內分解。
本發明的腸衣為以每片約16-30mg，理想的為16-25mg，更理想的為16-20mg的量進行包衣。本發明中腸衣厚度為5-100μm，理想的厚度為20-80μm。腸衣成分選自己公開知曉的常規聚合物。本發明中腸衣使用的這些聚合物在下列文章中列舉和描述[The Theory andPractices of Industrial Pharmacy，3rdEdition，1986，pp.365-373 by L.Lachman，Pharmazeutische Technologie，thieme，1991，pp.355-359 by H.Sucker，Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis，4thEdition，Vol.7，pp.739，742，766，and 778，(SpringerVerlag，1971)，and Remington′sPharmaceutical Sciences，13thEdition，pp.1689 and 1691(Mack Publ.，Co.，1970)]。例如，纖維素酯衍生物、纖維素醚以及丙烯基和丙烯酸甲酯或馬來酸或磷苯二甲酸衍生物的共聚物在本發明的腸衣中可使用。
本發明優選的腸衣由纖維素乙酸鄰苯二甲酸酯聚合物或偏苯三酸酯聚合物以及異丁烯酸的共聚物(例如，含有40％以上異丁烯酸和含有甲基纖維素鄰苯二甲酸羥丙酯或其酯類衍生物的異丁烯酸的共聚物)製備。
由德國Rohm GmbH生產的Endragit L 100-55可被用作本發明中腸衣的原料。
本發明中腸衣所使用的纖維素乙酸鄰苯二甲酸酯粘度為約45-90cp，乙醯含量17-26％，鄰苯二甲酸含量30-40％。用於腸衣中的纖維素乙酸偏苯三酸酯粘度為約15-21cs，乙醯含量17-26％，trimelityl含量25-35％。纖維素乙酸偏苯三酸酯由Eastman科達公司生產，可用於本發明中的腸衣材料。
用於本發明腸衣中的羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯，分子量一般為20,000-130,000道爾頓，理想分子量為80,000-100,000道爾頓，羥丙基含量為5-10％，甲氧基含量為18-24％，鄰苯二甲醯基含量為21-35％。纖維素乙酸鄰苯二甲酸酯由Eastman科達公司生產，可用作本發明中的腸衣材料。
用於本發明腸衣中的羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯為HP50，由日本Shin-Etsu Chemidnl Co.Ltd.生產。HP50含有6-10％羥丙基含量，20-24％甲氧基含量，21-27％的丙基含量，其分子量為84,000道爾頓。另一種腸衣物質為HP55，也是由日本SHIN-ETSU Chemidnl Co.Ltd.生產。HP55能被用作本發明的腸衣材料。HP55含有5-9％的羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯含量，18-22％甲氧基含量，27-35％的鄰苯二甲酸含量，其分子量為78,000道爾頓。
本發明腸衣如下製備使用常規方法將腸衣溶液噴霧到核心上。該腸包衣方法中所有溶劑為醇類如乙醇，酮類如丙酮，滷代烴化合物如二氯甲烷，或其混合物也可使用。將軟化劑如二-正丁基鄰苯二甲酸酯和三乙酸甘油酯加入到腸衣溶液中，其比例為1份包衣物對約0.05份或約0.3份軟化劑。
噴霧方法優選連續執行和所噴霧的料量可根據包衣所採用的條件進行控制。噴霧壓力可隨意調節，一般而言，能在平均1-1.5巴壓力下獲得理想的結果。
本說明書中「藥物有效量」表示本發明中微生物的最小量，也即是能夠降低吸收進哺乳動物體內腸道中的寡糖量時所需採用的微生物的量。根據使用方法和被給藥個體的不同，可對以本發明藥物組合物形式給藥的微生物的量進行調整。
可將本發明組合物施用給所述個體，每天給藥1次或多次。給藥劑量單位表示其形式上能分開且適用於人類或其他所有哺乳動物個體的劑量。每一單位含有藥物允許的載體和有效治療量的本發明微生物。
對成人口服單位劑量，本發明微生物理想用量為0.1g或更多，而本發明組合物每次給藥為0.1-10g，理想為0.5-5.0g。本發明微生物的藥物有效劑量為每天0.1g。
但給藥量隨病人的體重和肥胖嚴重程度、所包括的補充活性組份和所使用的微生物而變化。此外如可能可分開日給藥量並且如需要可連續給藥。因此，所述給藥量無論如何都不對本發明的範圍造成限制。
本發明中的「組合物」不僅意味著藥品而且表示可作為功能性食品和健康補充食品。
在周期性地使用本發明組合物情況下，微生物在腸道內形成菌群並競爭性地阻止寡糖在體內吸收。同時，由微生物產生的非消化性纖維為腸道內其他有益微生物創造了一個健康環境並刺激了腸道活性。結果，本發明組合物就具備了治療和預防肥胖症和糖尿病的功能。
圖2顯示了使用本發明微生物後血糖水平的變化。
圖3顯示了使用過本發明微生物的肥胖鼠其能量代謝效率的變化。
圖4是以16s rRNA核苷酸序列為基礎的本發明乳桿菌(Lactobacillus)BC-Y009系統發育分析圖表。
圖5是以16s rRNA核苷酸序列為基礎的本發明乳細菌(Lactobacter)BC-Y058系統發育分析圖表。
為預防和治療肥胖症和糖尿病，能被用於本發明藥物組合物的微生物須滿足下列要求1)能在腸道層內增殖；2)能快速吸收寡糖並將它們轉化成可能消化或難消化的高分子量物質如纖維狀物質；3)對人體和動物無害。能滿足上述條件的所有微生物都可用作本發明藥物組合物的活性成分，並且可從世界上眾多的微生物保藏機構獲得。
因此，本發明藥物組合物中的微生物為下列產多糖的菌木醋桿菌(Acetobacter xylinum)，醋桿菌(Acetobacter)BC-Y058，漢氏醋桿菌(Acetobacter hansenii)，巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)，醋化醋桿菌(Acetobacter aceti)，明串珠菌種(Leuconostoc sp.)，芽孢桿菌種(Bacillus sp.)，乳桿菌(Lactobacillus)BC-Y009，短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)，保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)，乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)，高加索(Lactobacillus kefir)，馬乳酒樣乳桿菌(Lactobacillus Kerirnnofaciens)，雙歧乳桿菌(Lactyobacillas bifidus)，清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)，路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)，乳乳桿菌(Lactobacillus lactis)，德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)，瑞士葡萄糖乳桿菌jugurti變種(Lactobacillus helveticusglucos var.jugurti.)，乳脂乳球菌(Lactococcuscremoris)，雙歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidium)，嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)或片球菌種(Pediococcus sp.)。這些微生物在下列文章中進行描述，Bart Degeest and Luc De Vuyst，「氮源影響嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)LY03生產外多糖的量和大小指徵以及細菌生長和外多糖在豐富培養基中外多糖生產模型」(Appl.Envir.Microbiol.1999，652863-2870.)；Stacy A.Kimmel，Robert F.Roberts and Gregory R.Ziegler，「生長在半合成培養基中的保加利亞乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)RR最佳產外多糖條件」(Appl.Envir.Microbiol.1998，64659-664.)；P.L.Pham，I.Dupont，D.Roy，G.Lapointe and J.Cerning，「鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)R外多糖的生產及延長發酵過程中其酶降解的分析」(Appl.Envir.Microbiol.2000，662302-2310.)；Petronella J.Loojjesteijn，Ingeborg C.Boels，Michiel Kleerebezemand Jeroen Hugenholtz，「葡萄糖源對乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcuslactis subsp.cremoris)生產外多糖的調節」(Appl.Envir.Microbiol.1999，655003-5008.)；G.H.Van Geel-Schutten，E.J.Faber，E.Smit，K.Bonting，M.R.Smith，B.Ten Brink，J.P.Kamerling，J.F.G.Vliegenthart and L.Dijkhuizen，「用路氏乳桿菌(Lactobacillus reuter)野生株和突變株合成的葡聚糖和果聚糖的生化和結構特徵」(Appl.Envir.Microbiol.1999，653008-3014.)；G.J.Grobben，I.Chin-Joe，V.A.Kitzen，I.C.Boels，F.Boer，J.Sikkema，M.R.Smith and J.A.M.de Bont，「採用德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)NCFB 2772和簡單合成培養基提高外多糖產量」(Appl.Envir.Microbiol.1998，641333-1337.)；Sandrine Petry，Sylviane Furlan，Marie-Jeanne Crepeau，JuttaCerning and Michel Desmazeaud，「生長於化學合成培養基上的德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)生產外胞多糖的影響因素」(Appl.Envir.Microbiol.2000，663427-3431.)；Richard van Kranenburg，Iris I.Van Swam，Joey D.Marugg，MichielKleerebezem and Willem M.de Vos，「乳乳球菌(Lactococcus lactis)NIZOB40中外多糖生物合成參與多糖骨架合成的糖基轉移酶基因的功能分析」(J.Bacteriol.1999，181338-340.)；Deborah Low，Jeffrey A.Ahlgren，Diane Horne，Donald J.McMahon，Craig J.Oberg and Jeffery R.Broadbent，「嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)MR-1C膠囊外多糖在奶酪水分保持中的作用」(Appl.Envir.Microbiol.1998，642147-2151.)；Richard van Kranenburg and Willem M.de Vos，「參與編碼乳乳球菌(Lactococcus lactis)生產外多糖的質粒pNZ4000複製和轉移的多區域的特徵」(J.Bacteriol.1998，1805285-5290.)；F Stingele，JR Neeser，and B Mollet，「來自嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)Sfi6外多糖基因簇的鑑定和特徵」(J.Bacteriol.1996，1781680-1690.)；M Kojic，M Vujcic，A Banina，P Cocconcelli，J Cerning and LTopisirovic，「從奶酪分離的乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)CG11生產外多糖的分析」(Appl.Envir.Microbiol.1992，584086-4088.)；
Christian Chervaux，S.Dusko Ehrlich and Emmanuelle Maguin，，「在一種新型化學合成培養基中德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)菌株的生理學研究」(Appl.Envir.Microbiol.2000，665306-5311.)；J Lemoine，F Chirat，JM Wieruszeski，G Strecker，N Favre and JRNeeser，「由嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)SFi39 and Sfi12生產外胞多糖的結構特徵」(Appl.Envir.Microbiol.1997，633512-3518.)；Bart Degeest and Luc De Vuyst，「葡糖磷酸變位酶、UDP-半乳糖4-差向異構酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的活性與嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)LY03外多糖生物合成之間的相互關係」(Appl.Envir.Microbiol.2000，663519-3527.)；Petronella J.Looijesteijn，Ingeborg C.Boels，Michiel Kleerebezemand Jeroen Hugenholtz，「葡萄糖源對乳酸乳球菌乳脂亞種(LactococcusLactis subsp.cremoris)生產外多糖的調節」(Appl.Envir.Microbiol.1999，655003-5008.)；Williams WS and Cannon RE，「對木醋桿菌(Acetobacter xylinum)纖維素生產的交替環境作用」(Appl.Envir.Microbiol.1989，552448-2452.)；Brown AM and Gascoigne JA，「產醋醋桿菌(AcetobacterAcetigenum)纖維素的生物合成」(Nature 1960，1871010-1012.)；Carr JG，「一株呈現陽性纖維素反應的醋化醋桿菌(acetobacteraceti)」(Nature 1958，182265-266.)；
Carr JG and Shimwell JL，「新舊產纖維素醋酸桿菌(Acetobacter)菌株」(J.Inst.Brew.1958，64477-484.)；Colvin JR and Leppard GG，「木醋桿菌(Acetobacter xylinum)和產醋醋桿菌(Acetobacter acetigenus)纖維素的生物合成」(Can.J.Microbiol.1977，23701-709.)；Colvin JR and Webb TE，「氧消耗與木醋桿菌(Acetobacter xylinum)纖維素合成間的變化關係」(Can.J.Microbiol.1964，1011-15.)；Cook KE and Colvin JR，「纖維素生產對木醋桿菌(Acetobacterxylinum)在液體培養基中生長有利影響的證據」(Curr.Microbiol.1980，3203-205.)；Fiedler S，Fussel M and Sattler K，「細菌纖維素的生產和應用」(Zentralbl Mikrobiol.1989，144473-484.)；Kauri T，Vladuttalor M and Kushner DJ，「生長在有纖維素存在下的細菌糖虧的生產」(Abstract ASM Meeting 1986，273)；Mounter LA，「細菌纖維素的結構和形成的觀察」(BiochemicalJournal 1951，50128-132.)；Valent BS and Albersheim P，「pH對木葡聚糖結合到纖維素上的影響」(Plant Physiol.1973，51 supp.60)；Valla S and Kjosbakken J，「一種來自纖維素陰性菌株木醋桿菌(Acetobacter xylinum)新型胞外多糖的分離和特徵」(Can.J.Microbiol.1981，27599-603.)；
Valla S，Kjosbakken J and Coucheron DH，「木醋桿菌(Acetobacterxylinum)含有幾種質粒參與纖維素形成的證據」(Archives ofMicrobiology 1983，1349-11.)；Walker TK and Kaushal R，「產醋醋桿菌(Acetobacter acetigenus)纖維素的形成」(Nature 1947，160572-573.)；Walker TK and Kaushal R，「醋桿菌(Acetobacter)某種的纖維素形成」(Biochemical J.1951，48618-621.)；Webb TE and Colvin JR，「氧消耗與株木醋桿菌(Acetobacterxylinum)纖維素合成間的變化關係」(Can.J.Microbiol.1964，1011-15.)；Webb TE and Colvin JR，「株木醋桿菌(Acetobacter xylinum)胞外蛋白以及與纖維素合成間的關係」(Can.J.Biochemistry 1966，45465-476.)；Wong HC，et al，「株木醋桿菌(Acetobacter xylinum)中纖維素的遺傳結構」(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，878130-8134.)；Higashimura M，Mulder-Bosman BW，Reich R，Iwasaki T and RobijnGW，「來自乳酸乳桿菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)SBT0495外多糖，維利亞的溶液特徵」(Biopolymers 2000，Aug 542 143-158.)；Knoshaug EP，Ahlgren JA and Trempy JE，「與乳酸乳桿菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subspecies cremoris)Ropy352外多糖表達相關聯的生長」(J.Dairy Sci.2000，Apr 834 633-640.)；
Micheli L，Uccelletti D，Palleschi C and Crescenzi V，「一種產外多糖-酸乳酒胞外多糖的粘液乳桿菌(Lactobacillus)菌株的分離和特徵」(Appl.Microbiol.Biotechnol.1999，Dec 531 69-74.)；Smitinont T，Tansakul C，Tanasupawat S，Keeratipibul S，Navarini L，Bosco M and Cescutti P，「來自傳統泰國發酵食品產外多糖的乳酸菌菌株分離、鑑定和外多糖特徵」(Int.J.Food Microbiol.1999，Oct 15512-3 105-111.)；Breedveld M，Bonting K and Dijkhuizen L，「清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)0-1的外多糖生物合成突變分析」(FEMS Microbiol.Lett.1998，Dec 15 1692 241-249.)；De Vuyst L，Vanderveken F，Van de Ven S and Degeest B，「來自生長在牛奶培養基嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)外多糖的分離和生產以及與生長相關的生物合成的證據」(J.Appl.Microbiol.1998，Jun 846 1059-1068.)；Kimmel SA and Roberts RF，「一種適用於產外多糖德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii ssp.Bulgaricus)RR生長培養基的開發」(Int.J.Food Microbiol.1998，Mar 3 401-2 87-92.)；Duenas-Chasco MT，Rodriguez-Carvajal MA，Tejero-Mateo P，Espartero JL，Irastorza-Iribas A and Gil-Serrano AM，「產自乳桿菌spp.(Lactobacillus spp.)G-77外多糖的結構分析」(Carbohydr.Res.1998，Feb 3071-2 125-133.)；Espartero JL，Irastorza-Iribas A，Gil-Serrano AM，Duenas-ChascoMT，Rodriguez-Carvajal MA，Tejero Mateo P and Franco-Rodriguez G，「產自有害片球菌(Pediococcus damnosus)2.6外多糖的結構分析」(Carbohydr.Res.1997，Oct 7 3034 453-458.)；Stingele F，Lemoine J and Neeser JR，「瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)Lh59分泌一種與產自瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)TN-4相同的外多糖，瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)TN-4推測為一個瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)TY1--2自發突變株」(Carbohydr.Res.1997，Aug 7 3023-4 197-202.)；Bubb WA，Urashima T，Fujiwara R，Shinnai T and Ariga H，「產自嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)OR901胞外多糖的結構特徵」(Carbohydr.Res.1997，Jun 11 3011-2 41-50.)；Staaf M，Widmalm G，Yang Z and Huttunen E，「一種產自瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)胞外多糖的結構闡明」(Carbohydr.Res.1996，Sep 23 291155-164.)；Robijn GW，Gutierrez Gallego R，van den Berg DJ，Haas H，Kamerling JP and Vliegenthart JF，「產自嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)LMG9433外多糖的結構特徵」(Carbohydr.Res.1996，Jul 19288203-218.)；和Robijn GW，Wienk HL，van den Berg DJ，Haas H，Kamerling JP andVliegenthart JF，「產自類乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)34-1外多糖的結構研究」(Carbohydr.Res.1996，May 14 285129-139.)這些文章包括附圖，引入本文作為參考，如同全文在此列入一樣。
另外，本發明人已經分離和獲得了能用作本發明藥物組合物中活性成分的新型微生物。
為了分離和獲得微生物，滿足作為本發明藥物組合物活性成分的條件，本發明人進行了如下研究。
從糖廠汙水和其他地點微生物取樣收集，接種在含環己醯亞胺(放線菌酮)的MRS和BHS瓊脂培養基中進行培養。然後將瓊脂培養基上形成的菌落接種到MRS和BHS的液體培養基中，靜置培養。選擇在培養基頂層能形成基質或膜狀的微生物。分離所形成的膜並測試是否被腸道中的消化酶分解。測定結果決定是否產生了不可消化或難消化的高分子量的化合物。在這些微生物中，因其高產胞外多糖(食用性纖維)，BC-Y009和BC-Y058被篩選出來。
通過觀察BC-Y009和BC-Y058形態和比較16s rRNA的部分DNA序列，證實與乳桿菌(Lactobacillus)和醋酸桿菌(Acetobacter)每種都顯示了高比例的同源性序列。根據表型和16s rRNA的序列分析，可確認BC-Y009為一種新型微生物，隸屬於乳桿菌屬(Lactobaccilusgenus)，而BC-Y058為醋酸桿菌屬(Acetobacter genus)中的一種新型微生物。
本發明中的乳桿菌BC-Y009和醋酸桿菌BC-Y058給已被誘導為肥胖症和糖尿病的小鼠施用。在給藥後，給藥小鼠的血糖水平已經降低了近70％。
根據這些結果，證明本發明的微生物具有降低血糖水平的效果，因此對治療和預防糖尿病有效。
當本發明的微生物BC-Y009和BC-Y058在已誘導為糖尿病和肥胖症的小鼠身上施用時，與對照組小鼠比較，飼料的消耗速率增加了17-24％。但是，體重增重與飼料消耗量的比例則下降了。結果表明人類可以使用本發明的微生物組合物而無需擔心肥胖症和糖尿病。
在服用這些微生物的情況下，血脂量也比對照組低，由此得知本發明微生物能控制糖尿病、肥胖症和循環疾病(如動脈硬化、心肌梗塞)的發生。
在下文中，本發明將參照下列例子作進一步解釋。所給出的這些例子只解釋發明，而不是限制本發明的範圍。
從樣本中選擇可產胞外多糖的微生物為了分離出能產食用性纖維的微生物，從糖廠汙水和其他地點收集樣本。從收集的樣本中取出10g混合物破裂後懸浮於90ml的生理鹽水(0.85％ NaCl)。所述的懸浮樣本用生理鹽水稀釋為10-2，10-4，10-6。然後將這些稀釋樣品分別塗抹在每100ml培養基含1mg環己醯亞胺(放線菌酮)的MRS瓊脂培養基(1％蛋白腖，1％牛肉膏，0.5％酵母粉，2％葡萄糖，0.1％Tween-80，0.2％檸檬酸銨，0.5％乙酸鈉，0.01％ MgSO4，0.005％ MnSO4，0.2％磷酸鈉pH6.5)和BSH瓊脂培養基(2％葡萄糖，0.5％蛋白腖，0.5％酵母粉，0.27％ Na2HPO4，0.115％檸檬酸pH5.0)(Hestirin and Schramn，J.Gen.Microbiol.，11123，1954)中，30℃培養72小時。大約2000個菌落被分離出來並首先接種到5mlMRS液體培養基和BSH液體培養基中30℃靜置培養72小時。將能在液體培養基上層形成膜狀或形成膠囊狀胞外多糖且其培養基透明澄清的微生物挑選出來。這些微生物再次轉接到5ml MRS液體培養基和BSH液體培養基中30℃震蕩培養，其吸光度在600nm處用分光光度計測定。微生物用BSH液體培養基稀釋直至吸光度達到0.2。10ml經過稀釋的微生物接種到100ml的BSH液體培養基中，30℃靜置培養72小時。
為了測定所產胞外多糖(食用性纖維)量，每種培養基4℃、6000rpm離心獲得微生物沉澱。細胞膜用0.1N NaOH溶液鹼性裂解破裂，放置於80℃ 30分鐘，然後4℃、6000rpm離心，上述過程完整地重複多次。象白色絲線樣纏繞的胞外多糖分離出來凍幹以測定其量。挑選出高產胞外多糖的微生物，並對胞外多糖產率相互比較(表1.)。
表1.胞外多糖產率的比較

實施例2.
挑選的BC-Y009和BC-Y058的特徵和形態學鑑定從實施例1中挑選出的高產多糖的微生物是BC-Y009，BC-Y002，BC-Y015，BC-Y026，BC-Y058，BC-Y112，BC-Y130和BC-Y201。通過觀察部分DNA序列，BC-Y009，BC-Y002，BC-Y015和BC-Y026為乳桿菌屬(Lactobacillus genus)微生物，而BC-Y058，BC-Y112，BC-Y130和BC-Y201為醋酸桿菌屬(Acetobacter genus)微生物。
在上述微生物中，BC-Y009和BC-Y058表現為高的多糖產率，將它們接種到MRS和BSH的液體培養基中，30℃懸浮培養72小時。培養液4℃、6000rpm離心收集微生物，其核酸採用CTAB/NaCl方法分離。通過使用16s rRNA共有序列引物，採用PCR方法擴增16srRNA，測定所得序列。採用BLAST分析(NCBI，美國)對序列進行測定，其結果顯示了與希氏乳桿菌(Lactobacillus hilgardii)，木醋桿菌(Acetobacter xylinum)，葡糖桿菌種(Gluconobacter sp.)，眾多其他的乳桿菌種(Lactobacillus sp.)和醋酸桿菌種(Acetobacter sp.)有高百分比的序列同源性(表2.和表3.)。
表2.乳桿菌種(Lactobacillus sp.)BC-Y009 16s rRNA核苷酸序列比較

在所包括比較的1400個鹼基對中，表的右上方表示的是有差異的鹼基對數，而左下方表示的是序列同源性的百分比。
表3.醋桿菌種(Acetobacter sp.)BC-Y058 16s rRNA核苷酸序列比較


在所包括比較的1320個鹼基對中，表的右上方表示的是有差異的鹼基對數，而左下方表示的是序列同源性的百分比。
BC-Y009是一種革蘭氏陽性菌，大小為0.5-3.0μm。它是一種非遊動的短杆狀菌，不產生孢子，為兼性厭氧菌。生長溫度為20-37℃，pH範圍為2.0-8.0，最適pH為4.0-7.0。實驗結果顯示該菌在牛奶中凝結，對過氧化氫酶表現為陰性反應(不反應)，在豐富培養基中形成白色菌落。它在MRS和BSH液體培養基中以白色膠囊沉澱出來。液體培養基的濁度清亮，微生物產生的胞外多糖在透明的培養基中，如震蕩液體培養基，則胞外多糖(食用性纖維)碎成小顆粒。
BC-Y058是革蘭氏陰性菌，杆狀，大小為0.6-0.8μm，以單個或成對存在。也是非遊動不產生孢子。其生長速率慢，需要5-7天培養時間，所形成的菌落既小又硬。在液體培養基中可形成透明的纖維素菌膜。乙醇，乙酸或乳酸能用作底物，對過氧化氫酶表現為陽性反應。該種微生物可利用葡萄糖產酸，但在HOIER培養基中不生長。
考慮到表型和16s rRNA DNA序列分析的結果，BC-Y009命名為乳桿菌種(Lactobacillus sp.)BC-Y009，BC-Y058命名為醋酸桿菌種(Acetobacter sp.)BC-Y058。它們於2000年5月30日被保藏於KCTC(韓國典型培養物保藏中心)，保藏號分別為KCTC BC-Y009，KCTCBC-Y058。
腸道消化酶降解胞外多糖(食用性纖維)的程度為了測定所述微生物產生的食用性纖維是否被腸道消化酶降解，1g豬胰酶製劑(sigma公司生產)顯示3倍的美國藥典活性，其包含了澱粉酶、脂肪酶、蛋白酶和核酸酶，將其懸浮在1g幹的食用性纖維的緩衝液(pH7.5)中。該懸浮液40℃培養7天，懸浮液每天收集一次，其中的葡萄糖使用DNS(3，5-二硝基水楊酸)定量測定。測定結果顯示食用性纖維根本不被分解。
因此可證實本發明的微生物所產生的食用性纖維在腸道內不降解。
細菌對葡萄糖的吸收速率已知為微生態調節菌的嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)(KCTC3140)和希氏乳桿菌(L.hilgardii)(KCTC3500)以及所述乳桿菌(Lactobacillus)BC-Y009，醋酸桿菌(Acetobacter)BC-Y002，醋酸桿菌(Acetobacter)BC-Y058和大腸桿菌(E.coli)的葡萄糖吸收速率在腸道條件下進行測定。結果表示在

圖1和表4中。
如圖1和表4所闡明，根據葡萄糖的吸收速率，本發明的微生物優於其他乳酸菌。
表4.每單位O.D.每單位時間的菌葡萄糖濃度的降低


實施例5.
施給微生物後腸道中微生物的濃度和存活比率小鼠C57BL/6J Lepobob/ob(下簡稱「OB小鼠」)被遺傳性地誘導為肥胖症和糖尿病，餓18小時，連續7天餵食含1％(w/w乾重)乳桿菌(Lactobacillus)BC-Y009和醋酸桿菌(Acetobacter)BC-Y058的本發明組合物(組合物中的微生物數為1.0×1013CFU/g)，然後再分析這些小鼠十二指腸、空腸和大腸中的菌濃度。同時，餵食不含本發明微生物的對照OB小鼠，對其十二指腸、空腸和大腸中的菌濃度也進行分析。
為了測定乳桿菌的量，已經餵食乳桿菌的小鼠和對照組的小鼠，它們的十二指腸、空腸和大腸都被切取出來。器官的每一個表面都用生理鹽水中淋洗，並將內容物懸浮於生理鹽水中。然後接種於MRS瓊脂培養基中37℃培養。3天後，絮凝物計數減去對照組乳桿菌量測定出菌量從而確定菌量的變化(表5)。
為了證實醋酸桿菌的存在，小鼠的每一個器官都被取出，用生理鹽水溶液淋洗器官表面。內容物懸浮於生理鹽水溶液中，然後接種於BSH液體培養基中37℃培養3天。通過檢查出現在液體培養基上層的菌膜，可證實產纖維醋酸桿菌的存在(表6)。
根據表5和表6所示的結果，所述兩種微生物皆能夠在腸道中增殖。
表5.小鼠十二指腸、空腸和大腸中乳桿菌種(Lactobacillus sp.)量

表6.小鼠十二指腸、空腸和大腸中醋酸桿菌種(Acetobacter sp.)量

實施例6.
餵食BC-Y009和BC-Y058後血糖水平的變化100g小鼠飼料購自SAMYANG公司，與400g韓國大米混合成為一組合物，其碳水化合物含量為60％，然後將5g幹乳桿菌BC-Y009或醋酸桿菌BC-Y058加進來製成凍乾片劑。用該種片劑伴水餵食小鼠。
所有用於本實施例的小鼠皆為雌性OB小鼠。醋酸桿菌餵食組(OB-058)，乳桿菌餵食組(OB-009)和對照組(OB-con，即飼料中不含本發明的微生物)分開飼養。飼養條件是12小時的光照周期(900-2100燈亮，2100-900燈滅)，溫度維持在20-24℃，溼度在40-60％。
另外，將腸衣溶液噴霧到乾燥的乳桿菌BC-Y009或醋酸桿菌BC-Y058生成含有腸衣微生物的本發明組合物。包括在組合物中的腸衣物質的重量每片約為16-30mg或更少。這些製作腸衣的物質選自常規的高分子物質如纖維素乙酸鄰苯二甲酸酯，偏苯三酸酯，甲基丙烯酸共聚物(甲基丙烯酸含量40％或以上，特別是包括羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸及其酯類衍生物的甲基丙烯酸共聚物)或它們的混合物。
在本實施例中使用的甲基丙烯酸是Endragit L 100-55，由德國Rohm GmbH生產，纖維素乙酸鄰苯二甲酸酯粘度45-90cp，乙醯含量17-26％，鄰苯二甲酸含量30-40％。或者，使用纖維素乙酸偏苯三酸酯，其由Eastman科達公司生產，粘度約15-20cs，乙醯含量17-26％，偏苯三甲醯含量25-35％。
腸衣製作採用常規包衣方法。將腸衣溶液噴霧到核心上。使用乙醇和丙酮溶劑混合物，軟化劑以1比大約0.005或0.3的比例加入到包衣溶液中。
使用上述方法製成的本發明腸包衣組合物和水一起提供給小鼠自由服用。測定已經服用腸包衣組合物的小鼠血糖水平。
在測定每一組小鼠的血糖水平之前，每個小鼠禁食18小時。在禁食後的60分鐘內，提供足夠量的飼料，在60分鐘後，從後眼眶靜脈叢用無抗凝劑的毛細血管收集血清。
血糖水平採用酶比色法的Trinder試劑盒(Cat.315-500，美國Sigma)在505nm處測定吸光度。結果的統計學誤差以每個實驗組平均值±標準偏差來表示，每個組平均差別的統計學上的顯著性通過ANOVA測試(P＜0.02)。
血糖水平數據顯示在圖2中。如圖2所示，OB-con組的血糖水平約為500mg/dl，而OB-058血糖水平較低。此外，由於施給了醋酸桿菌BC-Y058和乳桿菌BC-Y009，每隻小鼠的血糖水平都降低了約70％和53％(表7.)。
表7.施用醋酸桿菌BC-Y058和乳桿菌BC-Y009後血糖水平的變化

實施例7.
由於服用BC-Y058和BC-Y009飲食量和體重的變化及代謝效率小鼠劃分為三組OB-Y058組，OB-Y009組，OB-con組，醋酸桿菌BC-Y058和乳酸桿菌BC-Y009給每組施用並每隔一周檢測每隻小鼠的體重。除了檢測體重的變化外，小鼠消耗飼料的量也進行測定，因此可調查每組代謝效率的變化。
在遺傳特徵有區別的每個種中，體重變化的差異是明顯的，但在遺傳特徵相同的組中，體重變化的差異可忽略不計。如表8所示，在7周內，不管其施使用了醋酸桿菌BC-Y058或乳桿菌BC-Y009，OB小鼠的體重都約增加了47％的體重。但如表9和表10顯示的相反，依賴於所施用的微生物，飼料消耗百分比在OB小鼠組中增加了17-24％。
那就是，在消耗含有本發明微生物飼料的情況下，體重增加與餵食不含本發明微生物的飼料時所獲得的體重增加相同。結果表明醋酸桿菌BC-Y058和乳桿菌BC-Y009在飯後抑制了血糖水平，因此作為補償，可消耗更多的飼料。由於BC-Y058和BC-Y009微生物將葡萄糖轉化成食用性纖維，代謝效率發生了改變。
根據如下代表的公式，計算出能量效率的變化，其依賴於飼料消耗，在表10中表示出來。
能量代謝效率＝(體重增加(g)/飼料量(g))×1000如圖10所示，假如微生物給OB小鼠施用，當與不使用本發明微生物的對照組相比較時，能量代謝效率為75-85％(圖3)。表8.小鼠體重(g)的變化

表9.根據施用醋酸桿菌BC-Y058和乳桿菌BC-Y009後飼料消耗量的變化(g)

表10.能量代謝效率

實施例8.
施用BC-Y058和BC-Y009後的脂水平變化本發明微生物施用後，分析血脂的變化尤其是膽固醇的變化並證實微生物除糖尿病和肥胖症以外是否影響循環疾病如動脈硬化和心肌梗塞。
脂分析如實施例6中採用酶比色法進行，通過使用TG-glycezyme-V(Young-Yeoun化學公司，日本)，HDL-zyme-V(Young-Yeoun化學公司，日本)，Cholestezyme-V(Young-Yeoun公司，日本)，LDL膽固醇(Cat.61532，BioMeriux，法國)，參照標準液在505-570nm處測定吸光度，然後計算出血脂量。
如表11所示，在餵食飼料前脂濃度在肥胖小鼠中未顯出任何差別，但施給醋酸桿菌BC-Y058和乳桿菌BC-Y009後如表12所示，7周後脂濃度有明顯變化。
肥胖小鼠在服用過本發明微生物後，脂濃度與本實驗早期階段的數據比較無變化，並且未服用過本發明微生物的對照小鼠，則血中總脂含量提高了。
表11.施用飼料前血脂量(mg/dl)

N＝4TG甘油三酯HDL-C高密度脂蛋白膽固醇LDL-C低密度脂蛋白膽固醇表12.餵食飼料後血脂量(mg/dl)

N＝4，*P＜0.05TG甘油三酯HDL-C高密度脂蛋白膽固醇LDL-C低密度脂蛋白膽固醇本發明的工業應用性本發明中微生物能在腸內生存，將單糖和雙糖轉化為高分子量物質，該物質在腸內不能被吸收和難以消化，這樣就顯著降低了可吸收的單糖量，導致在代謝活性中所需的能量由積累在體內的脂肪和蛋白質提供，因此有效地抑制了肥胖症和糖尿病。此外，本發明中的微生物在腸內產生的食用性纖維，使之隨有害物質一起排洩掉，可預防闌尾炎，大腸癌，抑制膽固醇的吸收以及清潔腸道等。
當本發明參照所列舉的實施例已經詳細地展示和闡述時，本領域的技術人員能夠理解形式上和細節的各種變化可以在不背離所附權利要求書所限定的實質和範圍的前提下得出。
根據布達佩斯條約用於專利途徑的微生物保藏國際識別國際表格原始保藏收據根據第7.1條頒布授予人Bioneer公司韓國高科技園區#124.Chuckbook-ri，Namee-myun，Cheongwon-kun，Chungbuk 363-810

根據布達佩斯條約用於專利途徑的微生物保藏國際識別國際表格原始保藏收據根據第7.1條頒布授予人Bioneer公司韓國高科技園區#124.Chuckbook-ri，Namee-myun，Cheongwon-kun，Chungbuk 363-810

權利要求
1.乳桿菌菌種(Lactobacillus sp.)BC-Y009(KCTC-0774BP)。
2.醋酸桿菌菌種(Acetobacter sp.)BC-Y058(KCTC-0773BP)。
3.一種用於治療和預防肥胖症的藥物組合物，包括可藥用載體和藥物有效量的微生物，所述微生物選自產生多糖的醋酸桿菌種(Acetobacter sp.)、明串珠菌種(Leuconostoc sp.)、芽孢桿菌種(Bacillussp.)、乳桿菌種(Lactobacillus sp.)、鏈球菌種(Streptococcus sp.)、雙歧桿菌種(Bifidobacterium sp.)、乳球菌種(Lactococcus sp.)以及片球菌種(Pediococcus sp.)。
4.根據權利要求3所述的藥物組合物，其中所述微生物選自產生多糖的醋酸桿菌種(Acetobacter sp.)、乳桿菌種(Lactobacillus sp.)、乳球菌種(Lactococcus sp.)。
5.根據權利要求3所述的藥物組合物，其中所述微生物選自產生多糖的木酸桿菌(Acetobacter xylinum)，醋桿菌(Acetobacter)BC-Y058，漢氏醋桿菌(Acetobacter hansenii)，巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianus)，醋化醋桿菌(Acetobacter aceti)，明串珠菌種(Leuconostocsp.)，芽孢桿菌種(Bacillus sp.)，乳桿菌(Lactobacillus)BC-Y009，短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)，保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)，乾酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)，高加索乳桿菌(Lactobacillus kefir)，馬乳酒樣乳桿菌(Lactobacilluskeriranofaciens)，雙歧乳桿菌(Lactobacillus bifidus)，清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)，路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)，乳乳桿菌(Lactobacillus lactis)，德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)，瑞士葡萄糖乳桿菌jugurti變種(Lactobacillus helveticusglucos var.jugurti.)，乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)，雙歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidium)，嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)和片球菌種(Pediococcus sp.)。
6.根據權利要求3所述的藥物組合物，其特徵在於所述微生物被腸衣物質所包衣。
7.一種用於治療和預防糖尿病的藥物組合物，包括可藥用載體和藥物有效量的微生物，這些微生物選自產生多糖的醋酸桿菌種(Acetobacter sp.)，明串珠菌種(Leuconostoc sp.)，芽孢桿菌種(Bacillussp.)，乳桿菌種(Lactobacillus sp.)，鏈球菌種(Streptococcus sp.)，雙歧桿菌種(Bifidobacterium sp.)，乳球菌種(Lactococcus sp.)以及片球菌種(Pediococcus sp.)。
8.根據權利要求7所述的藥物組合物，其中所述微生物選自產生多糖的醋酸桿菌種(Acetobacter sp.)，乳桿菌種(Lactobacillus sp.)和乳球菌種(Lactococcus sp.)。
9.根據權利要求7所述的藥物組合物，其中所述微生物選自產生多糖的木酸桿菌(Acetobacter xylinum)，醋桿菌(Acetobacter)BC-Y058，漢氏醋桿菌(Acetobacter hansenii)，巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianus)，醋化醋桿菌(Acetobacter aceti)，明串珠菌種(Leuconostocsp.)，芽孢桿菌種(Bacillus sp.)，乳桿菌(Lactobacillus)BC-Y009，短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)，保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)，乾酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)，高加索乳桿菌(Lactobacillus kefir)，馬乳酒樣乳桿菌(Lactobacilluskeriranofaciens)，雙歧乳桿菌(Lactobacillus bifidus)，清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)，路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)，乳乳桿菌(Lactobacillus lactis)，德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)，瑞士葡萄糖乳桿菌jugurti變種(Lactobacillus helveticusglucos var.jugurti.)，乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)，雙歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidium)，嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)和片球菌種(Pediococcus sp.)。
10.根據權利要求7所述的藥物組合物，其特徵在於所述微生物被腸衣物質所包衣。
全文摘要
本發明涉及用於治療或預防肥胖症和糖尿病的微生物,這些微生物通過將單糖如葡萄糖、果糖和半乳糖等和二糖轉化為聚合物,而這些聚合物不能被腸道吸收,因此可減少被吸收入人體中單糖或二糖的量,本發明還涉及含有所述微生物的藥物組合物。
文檔編號A61P3/10GK1380902SQ01801286
公開日2002年11月20日 申請日期2001年2月23日 優先權日2000年5月17日
發明者樸翰浯, 方英培, 丁海重, 金峰徹, 金恆來 申請人:株式會社百尼爾