一種從魚油中富集n-3多不飽和脂肪酸甘油酯的方法
2023-12-08 20:18:26 1
專利名稱：一種從魚油中富集n-3多不飽和脂肪酸甘油酯的方法
技術領域：
本發明提供了一種從魚油中富集n-3多不飽和脂肪酸甘油酯的方法，n-3多 不飽和脂肪酸甘油酯簡寫為n-3PUFA甘油酯，屬於食品生物及功能保健品技術 領域。
背景技術：
魚油中n-3多不飽和脂肪酸(n-3PUFA)在人體中具有重要的生物學意義， 其特徵脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的生理活性己 經明確，EPA具有預防冠心病、降血壓、消除疲勞、預防動脈粥樣硬化和腦血 栓、抗癌等生理活性，DHA能顯著地促進嬰兒的智力發育，改善大腦機能，提 高記憶力，EPA和DHA是生產預防心血管疾病和嬰兒益智食品的良好基料。
天然魚油中EPA和DHA主要以甘油酯的形式存在，但EPA和DHA含量 相對較低(20%~30%)，其醫療和保健效果並不理想。為了提高EPA和DHA的 保健和醫療效果，在過去，眾多研究者將甘油酯中的EPA和DHA轉酯化或者 水解轉化為相應的甲乙酯或者游離形式，然後再通過各種物理或者化學方法提 高DHA和EPA的含量，以此來增強DHA和EPA的保健功效，如專利 CN1236773A (二十二碳六烯酸乙酯和二十碳五烯酸乙酯的製備和分離工藝)和 專利CN1132195A (魚油多烯脂肪酸乙酯生產新工藝)。但是隨後，對魚油保健 品，人們對其游離脂肪酸型、乙酯型的安全性提出了質疑，1990年美國FDA的 研究人員通過大量實驗，發現EPA和DHA的甘油酯型、甲乙酯型和游離脂肪 酸型在人體內消化吸收有差異。Ikuo等研究的結果也表明，EPA和DHA乙酯型 在人體中不僅消化和吸收比較困難，而且可能存在安全隱患；游離型的EPA和 DHA雖然易於被人體消化和吸收，但是容易氧化生成對人體有害的物質，而且 有酸味、口感不好，直接作為食用難以被人們接受；而EPA和DHA的甘油酯 型尤其是甘油三酯在消化道中的水解速率比物理或化學方法富集得到的相應的 甲酯或乙酯快，同時，EPA和DHA的甘油酯比其甲酯或乙酯更適合機體消化吸 收，EPA和DHA甘油酯型性質穩定、不易氧化、口感好，且甘油三酯是EPA 和DHA的天然存在形式，因此EPA和DHA的甘油三酯型是魚油保健品和藥品 的最佳產品型式。
近年來，為了提高EPA甘油酯和DHA甘油酯含量，利用脂肪酶法富集DHA 甘油酯和EPA甘油酯的方法逐漸受到人們的重視。與物理和化學方法相比，酶 法具有催化效率高，使用量很少，能多次重複利用，反應條件溫和等優點。該
方法一般先使魚油完全水解，濃縮富集製得高純度的n-3PUFA，再在脂肪酶的 催化下與甘油發生酯化反應，使得n-3PUFA富集在甘油酯分子上。專利 CN101161819A (—種酶法製備n-3PUFA海洋甘油酯的方法)利用此法可製備得 到EPA和DHA總含量達50%~80%的甘油酯，其中，甘油二酯含量50%~60%, 甘油三酯含量30%~35%，甘油單酯含量15%~20%，取得了較好的富集效果。
目前，雖然n-3PUFA甘油酯含量通過富集方法得到很大的提高，但有一點 不足的是作為n-3PUFA特徵脂肪酸的EPA和DHA是混合在一起的，沒有進行 分離，儘管EPA和DHA都是對人體有益的多不飽和脂肪酸，但它們的生理作 用是有較大差別的，從而決定了它們在應用上也存在著差異性。以健腦、增強 記憶力和提高視力為目的的嬰幼兒、青少年及孕婦等群體應服用以DHA為主不 含或少含EPA的產品，而以降血脂、防治動脈粥樣硬化等心血管疾病的群體則 應服用以EPA為主的產品。因此，不同的使用對象、不同的使用目的，對EPA、 DHA的要求是不一樣的，依據EPA和DHA生理功效的差異，從充分發揮EPA 和DHA各自保健功效的角度考慮，將魚油n-3PUFA中EPA和DHA分離，分 別進行開發利用，將很好地改善產品的應用針對性，提升產品的功能保健價值。 至今，尚未有將魚油中EPA和DHA分離，分別進行酯化富集的報導。
發明內容
本發明的目的就是提出一種從魚油中富集n-3PUFA甘油酯的方法。以魚 油為原料，採用化學水解法水解魚油，並通過分離純化方法，從水解魚油中獲 得高純度的EPA和DHA，再以甘油和純化的EPA、 DHA為底物，通過脂肪酶 有機相分別催化合成EPA甘油酯及DHA的甘油酯，富集製備高純度的EPA甘 油三酯及DHA甘油三酯產品，改善天然魚油產品的應用針對性，提升魚油產品 的功能保健價值。
本發明的技術方案以精製魚油為原料，先採用化學水解法水解魚油獲得 高產率的n-3多不飽和脂肪酸，然後通過色譜層析方法從n-3多不飽和脂肪酸混 合液中分離純化製備二十碳五烯酸EPA和二十二碳六烯酸DHA，最後以甘油和 純化的EPA,及甘油和純化的DHA為底物，用脂肪酶分別催化合成EPA甘油 酯及DHA甘油酯產品，步驟為 (1)魚油的化學水解
準確稱取精製魚油樣品，加入NaOH乙醇水溶液，乙醇:水體積比為6 9:1， 充氮保護，在50 6(TC條件下皂化60 卯min，加入正己烷萃取未皂化物，水化 層用3mol/L的HC1酸化，然後用正己烷萃取水解出來的游離n-3多不飽和脂肪 酸，水洗至中性，過無水Na2S04， N2吹乾溶劑得到油狀的n-3多不飽和脂肪酸;
經化學法水解，魚油水解率為90%~96%， EPA得率為85%~92%， DHA得 率為82% 90%。(2) EPA及DHA的分離純化
將魚油水解後得到的含EPA和DHA的n-3多不飽和脂肪酸混合液上C18 柱進行層析分離，流動相為甲醇/水，70%~100%甲醇梯度洗脫，洗脫液進行分 部收集，採用質譜對層析樣品進行快速分析，並利用HPLC檢測收集液的EPA 純度、及DHA純度，經反覆層析分離後製得純化的EPA產品、及DHA產品， 其EPA純度為92%~94%， DHA純度為93°/。~95%。
(3) 脂肪酶催化合成EPA甘油酯、及DHA甘油酯
以甘油和製備得到的EPA為底物、及甘油和DHA為底物，有機相脂肪酶 催化合成EPA甘油酯、及DHA甘油酯正己垸與EPA或DHA比例以mL/g計 為10~20:1， EPA或DHA與甘油的重量比為1~1.4:1，脂肪酶Novozym435添加 量為EPA或DHA重量的20%~30%，充氮保護，在40 5(TC條下150rpm振蕩水 浴進行酯化反應，反應12~24h後添加EPA或DHA重量1~1.5倍量的分子篩除 去反應生成的水份，反應48h後得到合成產物EPA甘油酯或DHA甘油酯；EPA 甘油酯及DHA甘油酯的酯化率均達到93Q/。 96。/。，其中，EPA甘油酯中甘油三 酯含量為93%~95%， DHA甘油酯中甘油三酯含量為92%~94%。
所述的精製魚油原料的理化指標控制為水分及揮發物0.02%，不溶性雜質 0.14%,酸值0.233mg/g，皂化值134.64mg/g，碘價^120mg/100g，過氧化值 1.538mmol/kg， EPA含量17.99%， DHA含量11.16%。
所述的魚油的化學水解準確稱取精製魚油樣品，每g魚油樣品加入2mol/L NaOH乙醇水溶液15mL，乙醇:水體積比為6~9:1 。
本發明的有益效果本發明提供了一種從魚油中富集n-3PUFA甘油酯的方 法。實現了魚油中兩種具有不同生理功能的PUFA——EPA、 DHA的分離和分 別富集，改善了天然魚油產品的應用針對性，提升了魚油產品的醫療和功能保 健價值。
本發明製備的EPA甘油酯和DHA甘油酯兩種產品純度較高，根據生理功 能的不同，適應於不同功能需求的消費人群，可開發成不同保健功效的功能性 產品，滿足不同層次人群對天然魚油產品保健功能的需要。
本發明方法富集製備的n-3PUFA甘油酯產品主要以甘油三酯為主，甘油單 酯和甘油二酯很少，三酯含量達92%以上，是n-3PUFA在魚油中的天然存在形 式，更有利於人體消化吸收，具有更好的醫療和保健效果，食用安全性好。
本發明技術不僅為開發新一代的魚油保健品提供技術途徑，為魚油產品的 進一步開發、應用和工業化生產提供了可能，而且，本發明的關鍵技術也可為 低值魚資源的高效利用提供很好的技術途徑，這對於髙效利用海洋生物資源生 產高附加值產品和促進海洋經濟發展都具有積極和重要的現實意義。
具體實施例方式
實施例1
準確稱取精製魚油樣品10g，加入2mol/LNaOH乙醇水溶液150mL,乙醇/ 水比例(v/v)為6:1，充氮保護，在50。C條件下皂化60min，加入正己垸100mL 萃取未皂化物兩次，水化層用lOOmL 3mol/L的HC1酸化，然後用正己烷100mLx3 萃取水解出來的游離n-3PUFA，水洗至中性，過無水Na2S04， N2吹乾溶劑得到 n-3PUFA,經化學法水解魚油水解率為95.5%， EPA得率92%, DHA得率為90%。
將魚油水解後得到的包含EPA、 DHA的n-3PUFA混合液2g上C18柱進行 層析分離，流動相為甲醇/水，70~100%甲醇梯度洗脫，洗脫液進行分部收集， 採用質譜對層析樣品進行快速分析，並利用HPLC檢測EPA、 DHA收集液的純 度，經反覆層析分離後製得純度較高的EPA、及DHA產品，其中EPA純度為 93%， DHA純度為94。/。。
以製備得到的較高純度的EPA和甘油為底物、及DHA和甘油為底物，有 機相脂肪酶催化合成EPA甘油酯、及DHA甘油酯在反應容器中，加入正己 烷6mL，甘油0.05g， EPA或DHA0.5g，脂肪酶Novozym 435添加量為O.lg， 充氮保護，在4(TC條下150rpm振蕩水浴進行酯化反應，反應24h後添加0.5g 分子篩除去反應生成的水份，反應48h後得到合成產物，EPA甘油酯的酯化率 為95%, EPA甘油酯中甘油三酯含量為93.3%， DHA甘油酯的酯化率為94.5%， DHA甘油酯中甘油三酯含量為93.2%。
實施例2
準確稱取精製魚油樣品10g，加入2mol/LNaOH乙醇水溶液150mL，乙醇/ 水比例(v/v)為9:1，充氮保護，在6(TC條件下皂化90min，加入正己垸100mL 萃取未皂化物兩次，水化層用100mL3mol/L的HC1酸化，然後用正己烷100mLx3 萃取水解出來的游離n-3PUFA，水洗至中性，過無水Na2S04， N2吹乾溶劑得到 n-3PUFA，經化學法水解魚油水解率為92。/。，EPA得率為90。/。，DHA得率為88%。
將魚油水解後得到的包含EPA、 DHA的n-3PUFA混合液2g上C18柱進行 層析分離，流動相為甲醇/水，70 100%甲醇梯度洗脫，洗脫液進行分部收集， 採用質譜對層析樣品進行快速分析，並利用HPLC檢測EPA、 DHA收集液的純 度，經反覆層析分離後製得純度較高的EPA、及DHA產品，其中EPA純度為 94%， DHA純度為950/。。
以製備得到的較高純度的EPA和甘油為底物、及DHA和甘油為底物，有 機相脂肪酶催化合成EPA甘油酯、及DHA甘油酯在反應容器中，加入正己 烷10mL，甘油0.05g， EPA或DHA0.7g，脂肪酶Novozym 435添加量為0.2g， 充氮保護，在5(TC條下150rpm振蕩水浴進行酯化反應，反應12h後添加lg分 子篩除去反應生成的水份，反應48h後得到合成產物，EPA甘油酯的酯化率為 96%， EPA甘油酯中甘油三酯含量為94。/。， DHA甘油酯的酯化率為95。/。， DHA 甘油酯中甘油三酯含量為93.5%。
實施例3 準確稱取精製魚油樣品10g，加入2mol/LNaOH乙醇水溶液150mL，乙醇/ 水比例(v/v)為9:1，充氮保護，在50。C條件下皂化90min,加入正己烷100mL 萃取未皂化物兩次，水化層用100mL 3mol/L的HC1酸化，然後用正己烷100mLx3 萃取水解出來的游離n-3PUFA，水洗至中性，過無水Na2S04， N2吹乾溶劑得到 n-3PUFA,經化學法水解魚油水解率為94。/。，EPA得率為9ln/。，DHA得率為89%。
將魚油水解後得到的包含EPA、 DHA的n-3PUFA混合液2g上C18柱進行 層析分離，流動相為甲醇/水，70~100%甲醇梯度洗脫，洗脫液進行分部收集， 採用質譜對層析樣品進行快速分析，並利用HPLC檢測EPA、 DHA收集液的純 度，經反覆層析分離後製得純度較高的EPA、及DHA產品，其中EPA純度為 92.5%， DHA純度為93.5。/。。
以製備得到的較高純度的EPA和甘油為底物、及DHA和甘油為底物，有 機相脂肪酶催化合成EPA甘油酯、及DHA甘油酯在反應容器中，加入正己 烷8mL，甘油0.05g， EPA或DHA0.5g，脂肪酶Novozym 435添加量為0.15g， 充氮保護，在45t:條下150 rpm振蕩水浴進行酯化反應，反應24h後添加0.5g 分子篩除去反應生成的水份，反應48h後得到合成產物，EPA甘油酯的酯化率 為93.5%， EPA甘油酯中甘油三酯含量為93.8。/。， DHA甘油酯的酯化率為94%， DHA甘油酯中甘油三酯含量為93%。
實施例4
準確稱取精製魚油樣品10g，加入2mol/LNaOH乙醇水溶液150mL，乙醇/ 水比例(v/v)為6:1，充氮保護，在6(TC條件下皂化60min，加入正己烷100mL 萃取未皂化物兩次，水化層用100mL 3mol/L的HC1酸化，然後用正己烷100mLx3 萃取水解出來的游離n-3PUFA，水洗至中性，過無水Na2S04， N2吹乾溶劑得到 n-3PUFA,經化學法水解魚油水解率為91。/。,EPA得率為86。/。，DHA得率為84%。
將魚油水解後得到的包含EPA、 DHA的n-3PUFA混合液2g上C18柱進行 層析分離，流動相為甲醇/水，70~100%甲醇梯度洗脫，洗脫液進行分部收集， 採用質譜對層析樣品進行快速分析，並利用HPLC檢測EPA、 DHA收集液的純 度，經反覆層析分離後製得純度較高的EPA、及DHA產品，其中EPA純度為 92%, DHA純度為93。/0。
以製備得到的較高純度的EPA和甘油為底物、及DHA和甘油為底物，有 機相脂肪酶催化合成EPA甘油酯、及DHA甘油酯在反應容器中，加入正己 烷12mL，甘油0.05g， EPA或DHA0.6g，脂肪酶Novozym 435添加量為0.15g， 充氮保護，在5(TC條下150rpm振蕩水浴進行酯化反應，反應12h後添加lg分 子篩除去反應生成的水份，反應48h後得到合成產物，EPA甘油酯的酯化率為 94%， EPA甘油酯中甘油三酯含量為94.2%， DHA甘油酯的酯化率為95%, DHA 甘油酯中甘油三酯含量為94%。
權利要求
1.一種從魚油中富集n-3多不飽和脂肪酸甘油酯的方法，其特徵是以精製魚油為原料，先採用化學水解法水解魚油獲得n-3多不飽和脂肪酸，然後通過色譜層析方法從n-3多不飽和脂肪酸混合液中分離純化製備二十碳五烯酸EPA和二十二碳六烯酸DHA，最後以甘油和純化的EPA，及甘油和純化的DHA為底物，用脂肪酶分別催化合成EPA甘油酯及DHA甘油酯產品，步驟為(1)魚油的化學水解準確稱取精製魚油樣品，加入NaOH乙醇水溶液，乙醇∶水體積比為6～9∶1，充氮保護，在50～60℃條件下皂化60～90min，加入正己烷萃取未皂化物，水化層用3mol/L的HCl酸化，然後用正己烷萃取水解出來的游離n-3多不飽和脂肪酸，水洗至中性，過無水Na2SO4，N2吹乾溶劑得到油狀的n-3多不飽和脂肪酸；(2)EPA及DHA的分離純化將魚油水解後得到的含EPA和DHA的n-3多不飽和脂肪酸混合液上C18柱進行層析分離，流動相為甲醇/水，70％～100％甲醇梯度洗脫，洗脫液進行分部收集，採用質譜對層析樣品進行快速分析，並利用HPLC檢測收集液的EPA純度、及DHA純度，經反覆層析分離後製得純化的EPA產品、及DHA產品，其EPA純度為92％～94％，DHA純度為93％～95％；(3)脂肪酶催化合成EPA甘油酯、及DHA甘油酯以甘油和製備得到的EPA、及甘油和DHA為底物，有機相脂肪酶催化合成EPA甘油酯、及DHA甘油酯∶正己烷與EPA或DHA比例以mL/g計為10～20∶1，EPA或DHA與甘油的重量比為1～1.4∶1，脂肪酶Novozym 435添加量為EPA或DHA重量的20％～30％，充氮保護，在40～50℃條下150rpm振蕩水浴進行酯化反應，反應12～24h後添加EPA或DHA重量1～1.5倍量的分子篩除去反應生成的水份，反應48h後得到合成產物EPA甘油酯或DHA甘油酯；EPA甘油酯及DHA甘油酯的酯化率均達到93％～96％，其中，EPA甘油酯中甘油三酯含量為93％～95％，DHA甘油酯中甘油三酯含量為92％～94％。
2、 根據權利要求1所述的一種從魚油中富集n-3多不飽和脂肪酸甘油酯的 方法，其特徵是所述的魚油的化學水解準確稱取精製魚油樣品，每g魚油樣 品加入2mol/LNaOH乙醇水溶液15mL，乙醇:水體積比為6~9:1。
全文摘要
一種從魚油中富集n-3多不飽和脂肪酸(n-3PUFA)甘油酯的方法，屬於食品生物及功能保健品技術領域。本發明以魚油為原料，用化學水解法水解魚油，並通過分離純化，從水解魚油中分別獲得高純度的二十碳五烯酸(EPA)及二十二碳六烯酸(DHA)，再以甘油和純化的EPA或DHA為原料，利用脂肪酶在有機相中分別催化合成EPA甘油酯或DHA甘油酯產品。產品中主要為n-3PUFA甘油三酯，產品純度較高，EPA甘油酯中EPA甘油三酯濃度為93％～95％，DHA甘油酯中DHA甘油三酯濃度為92％～94％。本發明製備的高純度的EPA甘油三酯及DHA甘油三酯產品，很好地改善了天然魚油產品不同保健功效的應用針對性，提升了魚油產品的功能保健價值。
文檔編號C07C57/00GK101348807SQ20081019627
公開日2009年1月21日 申請日期2008年8月26日 優先權日2008年8月26日
發明者何志勇, 全文琴, 唐學燕, 潔 陳, 陳小娥, 陶冠軍 申請人:江南大學