蛋白質的固相定量方法及其專用染色劑的製作方法
2023-12-09 11:32:41 1
專利名稱：蛋白質的固相定量方法及其專用染色劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質組學研究領域中的蛋白質的固相定量方法及其專用染色劑。
背景技術：
2D/MS(二維電泳加質譜)的分析法是蛋白質組學研究中的重要分析手段之一，而蛋白質的準確定量在電泳前的樣品準備過程中非常必要。樣品緩衝液[SDS-PAGE(SDS聚丙烯醯胺電泳)上樣緩衝液和IEF(等電聚焦)水化液]中的蛋白質總量的精確定量，對於保證足夠的蛋白上樣量以及對差異顯示的不同蛋白樣品之間進行可靠的比較分析至關重要。一些分光光度測定法，如Bradford、BCA(二喹啉甲酸)法及Lowry法已被廣泛地應用於蛋白質的定量，但是這些液相測定法的實施常常易受一系列幹擾物質的幹擾，影響其準確度。這些幹擾物質包括CHAPS(3-[(3-膽醯胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸)，SDS，DTT(二硫蘇糖醇)，硫脲，兩性電解質以及高濃度的變性劑等。此外，少量的染料如溴酚藍也會影響讀數，Bradford法尤其是這樣。某些商業的試劑盒，如Bio-Rad公司(Bio-Rad實驗室，加利福尼亞州，美國)的RC DC蛋白分析試劑盒和安瑪西亞公司(安瑪西亞，新澤西州，美國)的2-D定量試劑盒的產品說明書中聲稱用這些試劑盒來測定蛋白質不會受到這些幹擾物質的影響，但是在檢測過程中常需要進行蛋白沉澱的步驟，這不僅會消耗大量的樣品，而且往往會給低濃度的蛋白樣品造成嚴重的蛋白損失。
與上述液相測定法不同，基於固相的蛋白質測定法是一個很好的選擇，通過將蛋白質固定在如硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯(PVDF)膜這樣的固體支持物上，可以洗掉幹擾物質，其結果是幹擾物質不會影響測定結果。但問題是要有合適的能檢測出納克至微克級的蛋白染色方法。目前已開發的對固體膜上的蛋白質進行染色的方法有膠體金染色、膠體銀染色、考馬斯亮藍染色、麗春紅染色、鄰苯三酚紅一鉬酸染色、印度墨水染色和雙金屬鰲合染色法等(Mitra，P.；Pal，A.K.；Basu，D.；Hati，R.N.，Astaining procedure using Coomassie brilliant blue G-250 in phosphoric acidfor detection of protein bands with high resolution in polyacrylamide gel andnitrocellulose membrane.Anal Biochem 1994，223，(2)，327-9；Lim，M.J.；Patton，W.F.；Shojaee，N.；Shepro，D.，Solid-phase metal chelate assay for quantifyingtotal proteinresistance to chemical interference.Biotechniques 1996，21，(5)，888-92，894，896-7.)。這類方法的步驟煩多，費時而且需要多種試劑。而另一種基於螢光的蛋白質定量法雖然適用於高通量，具有靈敏度高、只需少量(1微升)蛋白樣品等特點，但是該方法需要昂貴的螢光探針和貴重的螢光檢測儀器如螢光掃描儀、紫外透射成象系統或96孔板螢光掃描儀等(Agnew，B.J.；Murray，D.；Patton，W.F.，A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitationof protein electrophoresis samples containing detergents，chaotropes，dyes，and reducing agents.Electrophoresis 2004，25，(15)，2478-85.)。
基於上述檢測方法的不足，迫切需要開發出一種快速、靈敏、高通量、耗樣少且成本低廉的蛋白質定量方法，以用於蛋白質組學研究。
發明內容
本發明的目的是提供一種用於對蛋白質進行固相定量的染色劑。
本發明所提供的染色劑，是含有體積百分濃度為0.5-1.5％染料型藍黑墨水，0.02-0.05％吐溫-20的PBS緩衝液。
所述墨水的體積百分濃度優選為1.0％，吐溫-20的濃度優選為0.03％。
所述墨水品牌的選擇是多種多樣的，優選為駝鳥牌。
所述PBS緩衝液的配方為NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO41.44g和KH2PO40.24g，用水定容至1L，pH 7.4。
本發明的第二個目的是提供一種蛋白質的固相定量方法。
本發明所提供的蛋白質的固相定量方法，包括以下步驟1)繪製蛋白濃度的標準曲線將一系列已知濃度的蛋白標準溶液以1-2μl相同的點樣量點在固相支持膜上，將膜在室溫下空氣乾燥，洗膜，然後將膜浸於上述染色劑中，用頻率為2400-2500MHz、輸出功率為700-900W的微波輻射2-5分鐘以輔助染色，洗膜，再對膜進行微波輻射使其乾燥，將乾燥的膜用礦物油或覆蓋油浸潤成半透明狀，掃描成像。對圖像進行分析，得到光密度值(OD)。然後根據不同濃度蛋白點的光密度值繪出標準曲線，橫坐標為蛋白量，縱坐標為光密度值；2)將未知濃度的蛋白樣品點在固相支持膜上，用與步驟1)相同的方法測定光密度值；3)將步驟2)測定的未知濃度蛋白樣品的光密度值與步驟1)繪製的標準曲線進行比對，得到樣品中的蛋白濃度。
在上述蛋白固相定量方法中，所述步驟1)中已知蛋白標準溶液的濃度範圍可根據實際需要進行選擇。步驟1)和步驟2)中的固相支持膜為硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯膜(PVDF)；點樣量優選為1μl；洗膜方法可為用蒸餾水在2-5分鐘內洗膜2-3次；輔助染色時的微波頻率優選為2450MHz，輸出功率優選為900W，輻射時間優選為3分鐘；利用微波輻射對膜進行乾燥的時間優選為3-6分鐘。
可用桌面式掃描儀或或光密度計進行圖像掃描，並用美國國家衛生研究院開發的軟體Image J(http//rsb.info.nih.gov/ij/)進行圖像分析，圖像的象素值被標準光密度片校準後轉換為校正過的光密度值，光密度值和蛋白量成比例，因此每個點的蛋白量對平均光密度值作圖即得到標準曲線。
所述被進行固相定量的蛋白質標準優選為γ-球蛋白、肌紅蛋白或轉鐵蛋白等。
為提高精確度，可將每種樣品的點樣個數設為2-4個，繪製標準曲線時取平均光密度值。
此外，若用電泳上樣緩衝液配製一系列已知濃度的蛋白標準溶液，並用相同的方法繪製出標準曲線，則可對未知濃度電泳樣品中的蛋白濃度進行測定。
所述電泳上樣緩衝液可為SDS-PAGE上樣緩衝液或IEF水化液等。
所述用於測定SDS-PAGE上樣緩衝液和IEF水化液中蛋白濃度的標準曲線的動態範圍可為19.5-10000ng/μl。
本發明提供了一種蛋白質的固相定量方法及其專用染色劑。該方法是以微波輔助的墨水染色法來測定電泳上樣緩衝液中的蛋白質含量，即採用普通的染料型藍黑墨水及微波輻射對點樣在固相支持膜上的蛋白點進行無背景染色，再將經染色的膜經微波乾燥及透明化後用掃描儀或光密度計掃描成像，經對圖像進行分析得到光密度值，通過與蛋白濃度標準曲線進行比對，得到檢測樣品的蛋白濃度。該方法具有以下優點1)快速利用微波輻射對固相支持膜上的蛋白樣品進行輔助染色使染色時間縮短至2-6分鐘，傳統方法則需要2小時甚至過夜(12-24小時)；同時利用微波輻射對膜進行乾燥，也極大地縮短了膜的乾燥時間，在900W的輸出功率下，微波輻射5分鐘足以使染過色的膜完全乾燥，而通常空氣乾燥需30分鐘甚至更長時間才足以使膜完全乾燥。
2)靈敏度高僅需1微升的蛋白樣品即可進行檢測，並能產生19.5-10000ng/μl500倍的動態範圍，與螢光檢測方法的靈敏度相當。
3)容易擴大至高通量的分析模式所採用的固相支持膜大小可變，檢測的樣本數不受限制，此外，已經點完樣的不同膜可以在同一個培養皿中進行染色，蛋白樣本可一次性點在膜上，也可以是分步點在膜上，使得不同時間製備的蛋白樣本可以被點在同一張膜上，然後再同時染色。
4)染色液可重複使用，且重複使用多次後染色能力保持不變固相支持膜上經染色的蛋白點很穩定，在室溫下可以浸泡於礦物油中放置幾周而顏色及形狀保持不變。重複使用多次後染色液的體積可能減少，這是由於水分蒸發所致，可以通過加入與揮發體積等量的水來恢復染色液的體積。
5)成本低染色試劑廉價，儀器簡單、易得。
6)檢測方法簡單，檢測人員易於掌握。
本發明的蛋白質的固相定量方法及其專用染色劑將在蛋白質組學的研究中發揮重要作用，應用前景廣闊。
下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
圖1為對固定在硝酸纖維素膜上的蛋白進行微波輔助染色的流程2為不同顏色及品牌的墨水對固定在硝酸纖維素膜上的蛋白的微波輔助染色結果圖3為用傳統染色方法及微波輔助染色法對固定在硝酸纖維素膜上的蛋白進行染色的結果圖4為溶解在SDS-PAGE上樣緩衝液中的標準濃度的BSA經過微波輔助蛋白固相染色後的掃描圖像及用於測定SDS-PAGE上樣緩衝液中蛋白含量的標準曲線圖5為溶解在SDS-PAGE上樣緩衝液中的標準濃度的BSA經過微波輔助蛋白固相染色後的掃描圖像及用於測定SDS-PAGE上樣緩衝液中蛋白含量的標準曲線圖6為檢測6種不同蛋白對標準曲線光密度值的影響的結果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
材料及儀器蛋白牛血清白蛋白(BSA)，γ-球蛋白，刀豆素A，肌紅蛋白和卵清蛋白購自Sigma-Aldrich公司。轉鐵蛋白購自Merck公司。
墨水鴕鳥牌藍黑墨水(203)，老闆牌藍黑墨水(883)，黑墨水(881)，英雄牌藍黑墨水(232)，奧林丹牌紅墨水(8201)，藍黑墨水(8202)和純藍墨水(8203)均購自北京向陽文體商店。
硝酸纖維素膜Immobilon-P購自Millipore公司(Millipore，MA，美國)。
輸出功率900W的微波爐購自格蘭氏公司(廣東，中國)。
桌面掃描儀PowerLook 2100XL購自Umax公司(世元資訊科技股份有限公司，上海，中國)。
試劑SDS-PAGE樣品緩衝液100mM Tris-HCl pH 6.8，2％SDS，10％丙三醇，5％β-mercaptoethanol，0.1％溴酚藍。
IEF水化液7M尿素，2M硫脲，2％CHAPS，1％DTT，0.5％IPG 3-10NL緩衝液。
PBS緩衝液NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO41.44g和KH2PO40.24g，用水定容至1L，DH 7.4。
其它試劑均為分析純試劑。
實施例1、比較不同類型、顏色及品牌的墨水對固定在硝酸纖維素膜上的蛋白的微波輔助染色效果用下述實驗比較不同類型、顏色及品牌的墨水對固定在硝酸纖維素膜上的蛋白的微波輔助染色效果，具體方法包括以下步驟1)配製染色劑將鴕鳥牌藍黑墨水(203)，老闆牌藍黑墨水(883)，黑墨水(881)，英雄牌藍黑墨水(232)，奧林丹牌紅墨水(8201)，藍黑墨水(8202)和純藍墨水(8203)分別與吐溫-20添加到PBS緩衝液中，混勻後得到含有體積百分濃度為1.0％墨水，0.03％吐溫-20的PBS緩衝液。
2)配製蛋白樣品溶液將BSA的溶解在IEF水化液中，得到濃度分別為10ng/μl、100ng/μl、1000ng/μl和10000ng/μl的BSA溶液，以不含有BSA的IEF水化液為對照。
3)微波輔助染色(流程圖見圖1)以1微升的點樣量將步驟2)的各種濃度的蛋白樣品溶液點在硝酸纖維素膜Immobilon-P上，製備7塊膜，將膜在室溫下空氣乾燥後，用蒸餾水在5分鐘內洗3次，然後進行微波輔助的墨水染色，即將7塊別浸於裝有步驟1)配製的不同染色劑的平皿中，將平皿置於輸出功率為900W的格蘭氏微波爐中用微波輻射3分鐘，然後將膜取出，用蒸餾水洗膜2分鐘，最後再用微波輻射5分鐘，使膜乾燥。
4)將膜用礦物油浸潤成半透明狀，用桌面式掃描儀(或光密度計)掃描成像。染色結果如圖2所示(1，鴕鳥牌藍黑墨水；2，英雄牌藍黑墨水；3老闆牌黑墨水；4，老闆牌藍黑墨水；5，奧林丹紅墨水；6，奧林丹藍黑墨水；7，奧林丹純藍墨水)，印度墨水對蛋白點染色的強度太弱無法分析(圖中未顯示)，而在所採用的多種染料型墨水中，只有各個品牌的藍黑墨水能給出可用的靈敏度，其它顏色墨水如黑墨水產生的背景太深，紅墨水和純藍墨水的靈敏度太低。染料型墨水染出的蛋白的顏色和墨水的顏色一致，這很可能是染料與蛋白特異性結合的結果。上述實驗結果表明藍黑墨水可作為靈敏染料對固定在膜上的蛋白進行定量。此外，在所有品牌的藍黑墨水中，鴕鳥牌藍黑墨水染色的靈敏度最高。
實施例2、比較傳統染色方法及微波輔助染色法對固定在硝酸纖維素膜上的蛋白的染色效果染色劑含有體積百分濃度為1.0％鴕鳥牌藍黑墨水，0.03％吐溫-20的PBS緩衝液。
蛋白樣品溶液將BSA的溶解在IEF水化液中，得到濃度分別為10ng/μl、100ng/μl、1000ng/μl和10000ng/μl的BSA溶液。
用下述實驗比較傳統染色方法及微波輔助染色法對固定在硝酸纖維素膜上的蛋白的染色效果，具體方法如下以1微升的點樣量將各種濃度的蛋白樣品溶液點在硝酸纖維素膜Immobilon-P上，以不含有BSA的IEF水化液為對照，製備6塊膜，將膜在室溫下空氣乾燥後，用蒸餾水在5分鐘內洗3次，然後進行微波輔助的墨水染色，即將6塊膜分別浸於裝有染色劑的不同平皿中，將4個平皿置於輸出功率為900W的格蘭氏微波爐中用微波分別輻射1、2、3和5分鐘，將另外兩個平皿分別在室溫下染色2小時和過夜(12-24小時)，染色結束後將膜取出，用蒸餾水洗膜2分鐘，最後再用微波輻射5分鐘，使膜乾燥。將乾燥的膜用礦物油浸潤成半透明狀，用桌面式掃描儀(或光密度計)掃描成像。
染色結果如圖3所示，用傳統方法對固定在硝酸纖維素膜上的蛋白進行染色，染色時間需要2小時甚至過夜(12-24小時)，而用本發明的微波輻射輔助染色法加速了染色進程，微波處理20秒後膜上的蛋白點就可見(用傳統方法在室溫下溫育15分鐘後膜上的蛋白點才可見)，染色在2-5分鐘內即可完成，原因可能是熱效應和微波輻射的非熱效應協同作用，加速了染料與蛋白特異結合的速度。此外，用微波輻射至5分鐘時會導致點的變形，因此優選的微波輔助染色時間為3分鐘，此時點的形狀保持完好且能產生足夠的靈敏度。而且，和傳統的室溫下孵育的染色方法相比，微波輻射處理能加深對低濃度蛋白點的染色。上述實驗結果表明用本發明的微波輔助染色法對蛋白進行固相染色，可獲得快速靈敏的染色效果。
實施例3、利用本發明的蛋白固相定量染色法檢測電泳樣本中的蛋白含量染色劑含有體積百分濃度為1.0％鴕鳥牌藍黑墨水，0.03％吐溫-20的PBS緩衝液。
可利用本發明的微波輔助蛋白固相染色法檢測電泳樣本(如SDS-PAGE或IEF)中的蛋白含量，其中標準曲線的獲得方法包括以下步驟1)蛋白標準溶液的配製用天平精確稱量BSA蛋白乾粉，將其分別溶於SDS-PAGE上樣緩衝液和IEF水化液中配成10000ng/μl的蛋白溶液，再將兩種蛋白溶液進行兩倍梯度稀釋得到一系列蛋白標準溶液(19.5-10000ng/μl)。
2)微波輔助染色以1微升的點樣量將各種濃度的蛋白樣品溶液點在硝酸纖維素膜Immobilon-P上，每個濃度點3個樣，以不含有BSA的SDS-PAGE上樣緩衝液和IEF水化液為對照，將膜在室溫下空氣乾燥後，用蒸餾水在5分鐘內洗3次，然後進行微波輔助的墨水染色，即將膜浸於裝有染色劑的平皿中，將平皿置於輸出功率為900W的格蘭氏微波爐中用微波輻射3分鐘，然後將膜取出，用蒸餾水洗膜2分鐘，最後再用微波輻射5分鐘，使膜乾燥。
3)將乾燥的膜用礦物油浸潤成半透明狀，用桌面式掃描儀掃描成像，用美國國家衛生研究院開發的軟體Image J(http//rsb.info.nih.gov/ij/)進行圖像分析，圖像的象素值被標準光密度片校準後轉換為校正過的光密度值(OD)，光密度值和蛋白量成比例，因此每個點的蛋白量對平均光密度值作圖即得到標準曲線。可根據此標準曲線對未知濃度的SDS-PAGE上樣緩衝液和IEF水化液進行定量。
溶解在SDS-PAGE上樣緩衝液中的標準濃度的BSA經過微波輔助蛋白固相染色後的掃描圖像見圖4中的圖B不同濃度的蛋白質標準的變化係數都小於3％，BSA標準曲線見圖4中的圖A(其中，小圖表示一段範圍更小的標準曲線，濃度從19.5ng/μl到1250ng/μl)，BSA的動態範圍是19.5ng/μl-10000ng/μl；溶解在IEF水化液中的標準濃度的BSA經過微波輔助蛋白固相染色後的掃描圖像見圖5中的圖B，不同濃度的蛋白質標準的變化係數都小於3％，BSA標準曲線見圖5中的圖A，兩種緩衝液的BSA標準曲線的動態範圍都是19.5ng/μl-10000ng/μl，而SDS-PAGE上樣緩衝液的和IEF水化液的BSA標準曲線的線性範圍分別是39ng-1000ng/μl和19.5ng/μl-2500ng/μl。對於這些上樣緩衝液的BSA標準曲線的線性範圍足夠覆蓋實驗室常用的直接用於SDS-PAGE電泳分析或者IEF分離的蛋白樣本濃度。在SDS-PAGE緩衝液中的BSA標準曲線的線性範圍略窄於在IEF水化液中的標準曲線線性範圍的原因可能是高濃度的SDS幹擾了蛋白在硝酸纖維素膜上的固定效率。
實施例4、檢測不同蛋白對標準曲線光密度值的影響將分子量，pI以及翻譯後修飾都不同的6種蛋白牛血清白蛋白(BSA)、肌紅蛋白(Myoglobin)、刀豆素A(ConA)、γ-球蛋白(γ-Globin)、轉鐵蛋白(Transferrin)和卵清蛋白(Albumin)分別溶解在IEF水化液中，配成10000ng/μl的蛋白溶液，並按照實施例5的方法進行微波輔助蛋白固相染色，每種蛋白點3個樣，掃描圖像，並對圖像進行圖像分析，得到平均光密度值，以檢測不同蛋白對標準曲線光密度值的影響。檢測結果如圖6所示，最大的差異來自於糖蛋白Con A，可能是糖基化修飾導致了蛋白與硝酸纖維素膜的結合效率下降或者蛋白被染色的強度下降。單個蛋白的變化係數仍然不到3％，而6個蛋白之間的變化係數約30.7％，其中除Con A之外的5種蛋白的變化係數為15.4％。這種蛋白之間的差異程度與通常的蛋白質染色方法，如考馬斯亮藍染色或BCA方法相當。其中γ-球蛋白，肌紅蛋白和轉鐵蛋白更適合作蛋白質標準，因為這些蛋白的染色強度與平均值更接近。
權利要求
1.用於對蛋白質進行固相定量的染色劑，是含有體積百分濃度為0.5-1.5％染料型藍黑墨水，0.02-0.05％吐溫-20的PBS緩衝液。
2.根據權利要求1所述的染色劑，其特徵在於所述墨水的體積百分濃度為1.0％，吐溫-20的濃度為0.03％。
3.根據權利要求1所述的染色劑，其特徵在於所述墨水品牌為駝牌。
4.一種蛋白質的固相定量方法，包括以下步驟1)繪製蛋白濃度的標準曲線將一系列已知濃度的蛋白標準溶液以1-2μl相同的點樣量點在固相支持膜上，將膜在室溫下空氣乾燥，洗膜，然後將膜浸於權利要求1-3任一所述的染色劑中，用頻率為2400-2500MHz、輸出功率為700-900W的微波輻射2-5分鐘，洗膜，再對膜進行微波輻射使其乾燥，將乾燥的膜用礦物油或覆蓋油浸潤成半透明狀，掃描成像，對圖像進行分析，得到光密度值，然後根據不同濃度蛋白點的光密度值繪出標準曲線；2)將未知濃度的蛋白樣品點在固相支持膜上，用與步驟1)相同的方法測定光密度值；3)將步驟2)測定的未知濃度蛋白樣品的光密度值與步驟1)繪製的標準曲線進行比對，得到樣品中的蛋白濃度。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述步驟1)和步驟2)中的固相支持膜為硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯膜；點樣量為1μl；洗膜方法為用蒸餾水在2-5分鐘內洗膜2-3次；輔助染色時的微波頻率為2450MHz，輸出功率為900W，輻射時間為3分鐘；利用微波輻射對膜進行乾燥的時間為3-6分鐘。
6.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述圖像分析軟體為Image J。
7.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述被進行固相定量的蛋白為γ-球蛋白、肌紅蛋白或轉鐵蛋白；每種樣品的點樣個數為2-4個，繪製標準曲線時取平均光密度值。
8.根據權利要求4-7任一項所述的方法，其特徵在於用電泳上樣緩衝液配製一系列已知濃度的蛋白標準溶液和待測蛋白溶液。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述電泳上樣緩衝液為SDS-PAGE上樣緩衝液或IEF水化液。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述用於測定SDS-PAGE上樣緩衝液和IEF水化液中蛋白濃度的標準曲線的動態範圍為19.5-10000ng/μl。
全文摘要
本發明公開了一種蛋白質的固相定量方法及其專用染色劑。該染色劑是含有體積百分濃度為0.5－1.5％染料型藍黑墨水，0.02－0.05％吐溫－20的PBS緩衝液。該定量方法，包括以下步驟1)繪製蛋白濃度的標準曲線；2)將未知濃度的蛋白樣品點在固相支持膜上，再對其進行染色，乾燥，浸潤及光密度值測定；3)將步驟2)測定的未知濃度蛋白樣品的光密度值與步驟1)繪製的標準曲線進行比對，得到樣品中的蛋白濃度。該方法具有快速、靈敏度高、容易擴大至高通量的分析模式、染色液可重複使用，且重複使用多次後染色能力保持不變、成本低及簡單等諸多優點，將在蛋白質組學的研究中發揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號G01N21/25GK1877289SQ20061008967
公開日2006年12月13日 申請日期2006年7月11日 優先權日2006年7月11日
發明者劉進元, 吳雪萍, 程永升 申請人:清華大學