存儲壽命長的高性能電泳凝膠的製作方法
2023-12-09 11:36:06
專利名稱：存儲壽命長的高性能電泳凝膠的製作方法
技術領域：
本發明涉及聚丙烯醯胺電泳和用於此類電泳的聚丙烯醯胺凝膠電泳。2.現有技術聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)之所以在研究和診斷以及生物化學實驗領域被廣泛應用，主要是因為聚丙烯醯胺凝膠的透光性和電中性，還因其對凝膠分離物質分子量廣譜的靈活性和適應性。這種靈活性來自製造者控制凝膠孔隙度的能力，這種控制是通過改變丙烯醯胺單體的濃度和雙丙烯醯胺交聯劑與丙烯醯胺單體之比。PAGE尤其適合十二烷基硫酸鈉(SDS)存在下的蛋白質分離，其中，SDS可以含於凝膠中，也可以含於電泳緩衝液中。 常用緩衝劑是三羥甲基氨基甲烷(〃 Tris")和二(2-羥乙基)氨基-三羥甲基甲烷(〃 雙-Tris")。知名蛋白質分離用聚丙烯醯胺凝膠之一是最早Laemmli所述的凝膠(U.K.， 自然(Nature) 227 :680 (1970))，它含有Tris-HCl緩衝液，ρΗ8· 8。然而，ρΗ如此之高的凝膠易隨時間而水解，即便冷藏亦是如此。水解會造成凝膠內各蛋白質遷移距離縮短，蛋白質條帶解析度降低。如果為了避免水解而降低ΡΗ，則會對凝膠內分離蛋白質解析度的銳利度造成一定程度的損失，並且，常常還會喪失有效分析蛋白質化合物的能力。解決這一問題的方法之一是在凝膠中加三乙醇胺，如本申請人的同時在審美國專利申請12/552，104(申請日2009年9月1日)所述。本發明則提供另一種方法。
發明內容
目前發現即便長期儲存也能抗水解，並且能在電泳條件下將蛋白質分離和拆分為清晰條帶的聚丙烯醯胺凝膠是含有兩性電解質的那些，所述兩性電解質為牛磺酸、天冬醯胺或牛磺酸與天冬醯胺的混合物。還發現含牛磺酸、天冬醯胺或上述兩者的預混成凝膠溶液可長期儲存，然後加入聚合催化劑形成凝膠，所得凝膠上的蛋白質分離其解析度沒有明顯下降，儘管所述溶液經歷了長期儲存。所述預混溶液含有單體和交聯劑，以及可選的用於形成產物凝膠的緩衝劑及其它組分，但是，該溶液不含任何聚合催化劑。此外，不論是經儲存的凝膠還是經儲存的預混成凝膠溶液都都含有電泳凝膠常用的緩衝液，主要的例子是Tris和雙-Tris緩衝液。本發明某些凝膠和預混溶液中還含有一種常規兩性電解質， 例如甘氨酸和tricine(N-三(羥甲基)甲基甘氨酸)，與牛磺酸或天冬醯胺構成聯合兩性電解質。某些實施方式中還包含可選的其它組分，諸如穩定劑、PH調節劑、條帶銳化劑和其它緩衝劑。當預成形和儲存備用時，本發明凝膠的優點之一是存儲壽命長，即能夠抵抗儲存期間的水解作用。本發明凝膠的優點還包括，與其它組成的凝膠相比，蛋白質拆分帶更銳
5利，不論凝膠在用前是否經歷儲存，是否用經儲存的溶液製備，還是當天即配即用或即制即用。本發明的優點還在於本發明凝膠在近中性PH銳利拆分蛋白質的能力。本發明的優點還在於本發明凝膠在高電壓下銳利拆分蛋白質的能力和相應縮短分離時間的能力。本發明凝膠尤其適合高濃度均勻(非梯度)凝膠和最高濃度較高的梯度凝膠。發明人所謂「本發明凝膠在長期儲存中能抗水解」或「預混成凝膠溶液經長期儲存後能夠製成抗水解凝膠」是指，如後文所示，儘管經歷儲存，所得凝膠保留了提供分析用蛋白質電泳分離的能力。體現本發明優點的存儲期超過1天，優選3天或以上，更優選7天或以上，更優選1個月或以上，更優選6個月或以上，甚至可長達一年。儲存條件一如預成形電泳凝膠儲存常用的那樣。這通常包括10°C以下冷藏，或約1-10°C冷藏，通常為4°C左右冷藏。本發明適用於任何尺寸和形狀的凝膠，包括管狀和板狀凝膠，以及積層凝膠與拆分凝膠的組合。以下將詳細闡述本發明的上述及其它特徵、目的和優點。
具體實施例方式本發明聚丙烯醯胺凝膠是按照本領域熟知的方法，由丙烯醯胺單體和丙烯醯胺交聯劑在聚合催化劑存在下聚合而成的。「丙烯醯胺交聯劑」指這樣一種分子，其在丙烯醯胺單體聚合過程中與丙烯醯胺單體反應從而形成交聯。可採用本領域已知的丙烯醯胺交聯劑，廣泛使用的知名丙烯醯胺交聯劑之一是N，N'-亞甲基-雙丙烯醯胺，亦稱「雙丙烯醯胺」或簡稱為「bis. 」。其它丙烯醯胺交聯劑有二丙烯酸乙二醇酯(ED)、二烯丙基酒石酸二醯胺(DATD)和二羥基亞乙基雙丙烯醯胺(DHEBA)。本發明適合孔隙度範圍廣泛的多種聚丙烯醯胺凝膠，然而，如前所述，特別適用於高濃度因而低孔隙度的凝膠或具有多個不同高濃度區域的凝膠(例如梯度凝膠)。根據本領域常規用途，全部單體(即丙烯醯胺加交聯劑)的總濃度以重量百分比表示，並以符號T 指代，交聯劑與單體總量之比也以重量百分比表示，並以符號C指代。T值和C值對本發明來說至關重要，但在大多數應用中，T的範圍約為4%至25%，優選約8%至約15%，C的範圍約為2%至10%，優選約2. 5%至約5%。本發明優選的高濃度凝膠中，T的範圍約為12% 至20%。對於均勻濃度凝膠來說，T值優選約15%至約18%，對梯度凝膠來說，T值的上限優選約15%至約25%，最優約20%。對梯度凝膠來說，T值通常有由一最低濃度(約4%) 升至一最高濃度(約12%至約20%)。常見的例子中，梯度凝膠的T值由4%升至12%，或由4%升至15%，或由4%升至20%，同時，優選C值如前所述。促進所述單體聚合形成凝膠的本領域已知催化劑有例如過硫酸銨(APS)，N，N'-四亞甲基乙二胺(TEMED)，核黃素和 β - 二甲氨基丙腈，它們都按催化有效量使用，各自的催化有效量對本領域技術人員來說是顯而易見的。典型的催化劑濃度之一是每毫升(mL)凝膠溶液0. 3-3. 0 μ g，而常見的例子之一是APS加TEMED組合，各自的濃度在該範圍內。如前所述，如果是製成凝膠前需長期儲存的預混溶液，加入一種或多種催化劑的時間點為適用者即將製作凝膠的時候，通常是臨近凝膠使用之前或在使用當天。凝膠和預混溶液中牛磺酸或天冬醯胺的濃度沒有限定，但多數情況下，濃度約 100-300mM、優選約150_250mM時可獲得最佳結果。牛磺酸與天冬醯胺之間，優選的是牛磺酸。如有甘氨酸或Tricine，其濃度也沒有限定，但多數情況下，甘氨酸或Tricine濃度約為50-200mM、優選約100-150mM時可獲得最佳結果。牛磺酸(或天冬醯胺)與甘氨酸(或 Tricine)濃度之比以大於1.0為佳，最好約為1. 25至2. 0。同樣，Tris或雙-Tris的濃度也沒有限定，但多數情況下，約50mM至約200mM可獲得最佳結果。典型的現有技術聚丙烯醯胺凝膠製備物中，單體溶液的PH可用合適的酸調節到所需範圍，此類酸的例子有鹽酸、 硫酸、乙酸、硼酸、磷酸和羥基乙酸。根據需要，可將PH調至6. 4-9.0。優選中性範圍例如 6. 4-7.0的pH。現在認為，本發明的最佳實施方式是含有75mM 1Tris-HCldOOmM牛磺酸、 125mM甘氨酸、23mM HCl和各類單體T值為4_12、4_15%或4-20% T、C = 2. 6%的梯度凝膠。某些實施方式中，用於形成凝膠的溶液和用到預混溶液的本發明實施方式中的預混溶液還包含一種弱酸或兩種或更多種弱酸的組合。所述弱酸的例子有檸檬酸、馬來酸、磷酸、乙酸和硼酸。優選檸檬酸和馬來酸，最好是檸檬酸。如果存在弱酸，其濃度優選約 0. 01mol/L(10mM)至約 0. 50mol/L(500mM)，最優約為 0. 01mol/L(IOmM)至約 0. 05mol/ L(50mM)。還可以加入中性鹽來進一步提高條帶解析度，尤其是在長期儲存之後。合適的鹽有例如氯化鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、氯化鉀和磷酸鉀。如果含鹽，其濃度優選約0. Olmol/ L(IOmM)至約 0. 50mol/L(500mM)，最優約 0. 01mol/L (IOmM)至約 0. 05mol/L (50mM)。本發明凝膠用於電泳分離，方式與常規電泳凝膠的相同。將樣品上樣到成形凝膠上，施加跨凝膠的電勢差，由此引起蛋白質穿越凝膠的遷移，遷移速度與蛋白質質量、電荷或上述兩者相關，由此，根據各自不同的遷移速度，蛋白質分離為位於凝膠內遷移路徑上不同位置的條帶。如前所述，本發明優點之一是凝膠能夠在高電壓下運行，並因此縮短了運行時間，然而卻不降低解析度。有效電壓差約為每釐米(cm)凝膠長度35至75伏特，優選每釐米約40-50伏特。實施例1本實施例展示的是用Tris-HCl和不同濃度牛磺酸製備的本發明聚丙烯醯胺凝膠的性能，全部凝膠都於4°C儲存72小時後用於電泳分離。採用標準蛋白質混合物，含肌球蛋白、β -半乳糖苷酶、牛血清白蛋白、卵白蛋白、 碳酸酐酶、大豆胰蛋白酶抑制劑、溶菌酶和抑肽酶。所用樣品緩衝液含62. 5mM Tris-HCl, 2%十二烷基硫酸鈉、25%甘油和0.01%溴酚藍，pH 6.8，所用電泳緩衝液含25福Tris, 192mM甘氨酸和0. 十二烷基硫酸鈉、pH 8. 3。進行200V的恆壓電泳分離。除非另作說明，所有百分比均為重量百分比。在板式凝膠電泳盒中，用10%丙烯醯胺/雙丙烯醯胺水溶液(T = 10% )澆鑄一系列聚丙烯醯胺凝膠，溶液中雙丙烯醯胺佔單體混合物的2. 6% (C = 2.6%)。澆鑄溶液中還含有 150mM Tris-HCl 和濃度分別為 20mM、40mM、80mM、150mM、160mM、200mM和 250mM 的牛磺酸。該盒製作的凝膠為8cmX8cm，凝膠厚度為1mm。澆鑄後，立即將凝膠於4°C保存一個周末(即72小時左右)。然後在每塊凝膠上，在10根平行泳道中進行蛋白質混合物的電泳，電泳在MINI-PROTEAN III電泳槽上進行，採用標準Tris-甘氨酸SDS (十二烷基硫酸鈉)電泳緩衝液，200V恆壓，電泳時間為33至50分鐘。結果如下20mM牛磺酸凝膠第50分鐘時，蛋白質分布正常，僅高分子量蛋白質沒有形成銳利條帶；40mM牛磺酸凝膠染料前沿在第25分鐘開始扭曲，至48分鐘時，染料前沿是直的，不扭曲，但高分子量蛋白質沒有形成銳利條帶；SOmM牛磺酸凝膠染料前沿在前38分鐘是直的，高分子量蛋白質條帶比較明顯， 但仍然寬且不集中；150mM牛磺酸凝膠第38分鐘時，染料前沿呈波浪狀，高分子量蛋白質條帶比SOmM 牛磺酸凝膠中更清晰，但仍不夠集中；160mM牛磺酸凝膠第38分鐘時，染料前沿呈波浪狀，結果與150mM牛磺酸凝膠中的相似；200mM牛磺酸凝膠第33分鐘時，染料前沿和蛋白質分布正常；高分子量蛋白質條帶更銳利、更明顯；250mM牛磺酸凝膠第38分鐘時，蛋白質分布扭曲，高分子量蛋白質不如200mM凝膠銳利；以上結果提示雖然區別凝膠表現都合格，但200mM凝膠的全部範圍內各分子量蛋白質條帶最清晰，染料前沿扭曲最小。實施例2本實施例是本發明聚丙烯醯胺凝膠存儲壽命的加速測試。如實施例1所述，在板式凝膠電泳盒中用τ = 10%,C = 2. 6%的丙烯醯胺/雙丙烯醯胺水性溶液澆鑄相同尺寸的凝膠。三份凝膠含75mM Tris-HCl和200mM牛磺酸，pH 6. 5 ；另三份凝膠含75mM Tris-HCl, 83mM天冬醯胺和300mM甘氨酸，pH 6. 5。兩種凝膠中各取一塊立即使用，其餘則於37°C保存不同時間後使用(37°C—天相對於4°C典型溫度的一個月)。Tris-牛磺酸凝膠分別保存 14天和18天，Tris-天冬醯胺-甘氨酸凝膠分別保存8天和15天。如實施例1所述，在所有凝膠上進行標準蛋白質混合物的電泳。所有情況下，凝膠均提供了可接受蛋白質分布，這提示凝膠在儲存期間保持穩定。實施例3本實施例顯示本發明凝膠在200V以上不同電泳電壓下的不同效果。按照實施例1 和2，用T = 10%和C = 2.6%含150mM iTris-HCl和200mM牛磺酸、pH 6.5的丙烯醯胺/雙丙烯醯胺水溶液在板式凝膠電泳盒中澆鑄8cmX8cmX Imm的凝膠。全部凝膠都是在將組分混好後立即澆鑄。將兩種複雜蛋白質混合物上樣到各凝膠，一份來自大豆提取物，另一份來自大鼠肝臟，另外還有4份標準品，各含不同染料標記的人造蛋白質的混合物，這些蛋白質混合物所跨的電泳遷移率範圍覆蓋了所述大豆提取物和大鼠肝臟樣品中蛋白質的遷移率範圍。標準品來自Bio-Rad實驗室(赫拉克勒斯，加利福尼亞，美國)(Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, California, USA)),通用商品名為「超準蛋白」(「Precision Plus Protein")標準品。加了相同樣品的相同凝膠在MINI-PROTEAN III電泳槽和TETRA電泳槽中電泳。分別用以下電壓進行分離200V (25V/cm凝膠長度)、300V (37. 5V/cm凝膠長度)、 350V (43. 75V/cm凝膠長度)和400V (50V/cm凝膠長度)。每次的電泳時間以及內腔(上緩衝液腔)和外腔(下緩衝液腔)的最終溫度如表I所示。表 I變壓測試結果最終溫度
電壓電泳時間內腔溫度外腔溫度200V32分鐘34 0C29 "C3 OOV22分鐘47 36 0C350V16分鐘52 0C4VC400V9分鐘60 0C35.6V400V電泳凝膠的圖像顯示移動較快的條帶不如較低電壓下凝膠上的相應條帶銳利，各中心泳道上條帶的彎曲比各外圍泳道明顯。但是，各凝膠上，蛋白質條帶都清楚的彼此分開，可以識別，而且，所有凝膠上的條帶分布情況基本一致。這些結果提示提高電壓可縮短分離時間，但不明顯降低解析度，也不會令緩衝液的溫度升得過高而破壞凝膠或幹擾分離。實施例4本實施例顯示加聚合催化劑之前經長期儲存的不同成凝膠預混溶液的效果。預混溶液都是丙烯醯胺/雙丙烯醯胺的水溶液，T = 10%, C = 2. 6%，並含有150mM Tris-HCl 和200mM牛磺酸，pH 6.5。配好後立即將它們在加速老化實驗條件下存放不同時期，該實驗採用37°C作為儲存溫度，而不是通常的4°C。各溶液存放了各指定時間後，將2. 0μ L TEMED 和0. 5mg APS加入1毫升各溶液，將所得溶液澆鑄成8cmX 8cmX Imm的凝膠。在凝膠上加大豆提取物樣品和大鼠肝臟樣品，還有三份「超準蛋白」標準品樣品，在TETRA電泳槽中進行200V電泳。在預混溶液儲存期的第0天澆鑄兩塊相同凝膠並走電泳，另四塊在37°C存放6天後(相對於4°C存放6個月)走電泳，還有兩塊在37°C存放13天後(相對於4°C存放13個月)。結果都是條帶清晰，目測可分辨，只是，儲存13天後澆鑄的凝膠上的條帶不如儲存第0天和6天後澆鑄的深和銳利。比較實施例本實施例將含絲氨酸作為聯合兩性電解質的凝膠與含牛磺酸作為聯合兩性電解質的凝膠進行了性能比較。前者不屬於本發明，後者屬於本發明。凝膠組成如下表II所示。除此之外，兩種凝膠與前述實施例中的相同，並且都是當日(6小時之內)配製、澆鑄和使用。表II比較實驗中的凝膠組成本發明凝膠含絲氨酸凝膠
丙烯醯胺/雙丙烯醯胺丙烯醯胺/雙丙烯醯胺 T= 10%, C=2.6%T= 10%, C=2.6%
75mM Tris75mM Tris
200mM牛磺酸200mM絲氨酸
125mM甘氨酸125mM甘氨酸
37mM HCl37mMHCl
pH: 6.5pH: 6.5將各凝膠之ー置於MINI-PROTEAN III電泳槽中，並將各凝膠之ー置於TETRA電泳 槽中(也是Bio-Rad實驗室的產品)。按實施例1所述在全部凝膠上進行標準蛋白混合物 的電泳。比較顯示含絲氨酸凝膠上的中部條帶不如牛磺酸凝膠上相應條帶清晰。在權利要求中，所有「一」都包括複數含義，「包含」或其變體例如「包括」、「含」等 都表示可加入其它可選而未被排除的步驟或元素。說明書中引用的全部專利、專利申請及 其它出版物文獻都通過引用納入本發明之中。引用的文獻或其它普通現有技術與本說明書 的講述不一致，傾向於遵從本說明書的教導。這包括某個單詞或詞組的業內解釋與本說明 書對其做出的定義之間的不一致。
權利要求
1.聚丙烯醯胺凝膠，包含交聯的聚丙烯醯胺、選自三(羥甲基)氨基甲烷和二(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷的緩衝劑和選自牛磺酸和天冬醯胺的兩性電解質。
2.如權利要求1所述的聚丙烯醯胺凝膠，所述兩性電解質是牛磺酸。
3.如權利要求1所述的聚丙烯醯胺凝膠，所述聚丙烯醯胺按重量計約佔所述凝膠的 4%至 25%。
4.如權利要求1所述的聚丙烯醯胺凝膠，所述聚丙烯醯胺按重量計約佔所述凝膠的 4%至25%，所述丙烯醯胺交聯劑按重量計約為所述聚丙烯醯胺的2%至10%，所述兩性電解質的濃度約為IOOmM至約300mM，所述凝膠的pH約為6. 4至9. 0。
5.如權利要求1所述的聚丙烯醯胺凝膠，所述聚丙烯醯胺按重量計約佔所述凝膠的 8%至15%，所述丙烯醯胺交聯劑按重量計約為所述聚丙烯醯胺的2. 5%至5%，所述兩性電解質是濃度約150mM至約250mM的牛磺酸，所述凝膠的pH約6. 4至7. 0
6.如權利要求1所述的聚丙烯醯胺凝膠，所述凝膠是梯度凝膠，其具有的聚丙烯醯胺濃度梯度按重量計由最低約4 %升至最高約12 %至約20 %。
7.用於澆鑄聚丙烯醯胺電泳凝膠的預混溶液，所述預混溶液包含溶於水中的以下組分(i)丙烯醯胺單體，(ii)丙烯醯胺交聯劑，(iii)選自三(羥甲基)氨基甲烷和二(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷的緩衝劑和(iv)選自牛磺酸和天冬醯胺的兩性電解質。
8.如權利要求7所述的預混溶液，所述兩性電解質是牛磺酸。
9.如權利要求7所述的預混溶液，所述丙烯醯胺單體和所述丙烯醯胺交聯劑之和按重量計約佔所述預混溶液的4 %至25 %。
10.如權利要求7所述的預混溶液，所述丙烯醯胺單體和所述丙烯醯胺交聯劑之和按重量計約佔所述預混溶液的4%至25%。
11.如權利要求7所述的預混溶液，所述丙烯醯胺交聯劑按重量計約佔所述丙烯醯胺單體和所述丙烯醯胺交聯劑之和的2%至10%。
12.如權利要求7所述的預混溶液，所述兩性電解質的濃度約為IOOmM至約300mM.
13.如權利要求7所述的預混溶液，所述丙烯醯胺單體與所述丙烯醯胺交聯劑之和按重量計約佔所述預混溶液的4 %至25 %，所述丙烯醯胺交聯劑按重量計約佔所述丙烯醯胺單體與所述丙烯醯胺交聯劑之和的2 %至10 %，所述兩性電解質的濃度約為IOOmM至 300mM,所述預混溶液的pH約為6. 4至約9. 0。
14.如權利要求7所述的預混溶液，所述丙烯醯胺單體與所述丙烯醯胺交聯劑之和按重量計約佔所述預混溶液的8 %至約15 %，所述丙烯醯胺交聯劑按重量計約佔所述丙烯醯胺單體與所述丙烯醯胺交聯劑之和的2. 5%至5 %，所述兩性電解質是濃度約150mM至 250mM的牛磺酸，所述預混溶液的pH約為6. 4至7. 0。
15.如權利要求7所述的預混溶液，所述丙烯醯胺交聯劑是雙丙烯醯胺。
16.一種形成聚丙烯醯胺電泳凝膠的方法，所述方法包括(a)將包含溶於水中的以下組分的預混溶液儲存超過M小時，(i)丙烯醯胺單體，( )丙烯醯胺交聯劑，(iii)選自三(羥甲基)氨基甲烷和二 O-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷的緩衝劑，和(iv)選自牛磺酸和天冬醯胺的兩性電解質；(b)向所述預混溶液加入聚合催化劑引發所述丙烯醯胺與丙烯醯胺交聯劑聚合形成交聯的聚丙烯醯胺，並由此將所述預混溶液轉化為凝膠。
17.如權利要求16所述的方法，所述時間超過7天。
18.如權利要求16所述的方法，所述時間在7天至1年之間。
19.如權利要求16所述的方法，所述時間在1個月至1年之間。
20.如權利要求16所述的方法，所述時間在6個月至1年之間。
21.如權利要求16所述的方法，步驟(a)進行的溫度約為1-10°C。
22.如權利要求16所述的方法，所述兩性電解質是牛磺酸。
23.如權利要求16所述的方法，所述丙烯醯胺單體與所述丙烯醯胺交聯劑之和按重量計約佔所述預混溶液的4 %至25 %。
24.如權利要求16所述的方法，所述丙烯醯胺交聯劑按重量計約佔所述丙烯醯胺單體與所述丙烯醯胺交聯劑之和的2%至10%。
25.如權利要求16所述的方法，所述兩性電解質在所述預混溶液中的濃度約為IOOmM 至約300mM。
26.如權利要求16所述的方法，所述丙烯醯胺單體與所述丙烯醯胺交聯劑之和按重量計約佔所述預混溶液的4%至25%，所述丙烯醯胺交聯劑按重量計約佔所述丙烯醯胺單體與所述丙烯醯胺交聯劑之和的2%至10%，所述兩性電解質的濃度約為IOOmM至約300mM， 所述預混溶液的PH約為6. 4至約9. 0。
27.如權利要求16所述的方法，所述丙烯醯胺單體與所述丙烯醯胺交聯劑之和按重量計約佔所述預混溶液的8%至15，所述丙烯醯胺交聯劑按重量計約佔所述丙烯醯胺單體與所述丙烯醯胺交聯劑之和的2. 5%至5%，所述兩性電解質是濃度約150mM至約250mM的牛磺酸，所述預混溶液的PH約為6. 4至約7. 0。
28.如權利要求16所述的方法，所述丙烯醯胺單體與所述丙烯醯胺交聯劑之和按重量計約佔所述預混溶液的4 %至25 %。
29.一種通過電泳分離液體樣品中蛋白質的方法，所述方法包括(a)將所述樣品上樣到含交聯聚丙烯醯胺、選自三(羥甲基)氨基甲烷和二(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷的緩衝劑和選自牛磺酸和天冬醯胺的兩性電解質的聚丙烯醯胺凝膠上；(b)施加跨凝膠的電勢差，由此引起蛋白質穿越凝膠的遷移，遷移速度與蛋白質的質量、電荷或上述兩者相關，由此，根據各自不同的遷移速度分離為凝膠內的各條帶。
30.如權利要求四所述的方法，所述兩性電解質是牛磺酸。
31.如權利要求四所述的方法，所述聚丙烯醯胺按重量計約佔所述凝膠的4%至25%。
32.如權利要求四所述的方法，所述聚丙烯醯胺按重量計約佔所述凝膠的4%至25%， 所述丙烯醯胺交聯劑按重量計為所述聚丙烯醯胺的約2%至約10%，所述兩性電解質的濃度約為IOOmM至約300mM，所述凝膠的pH約6. 4至9. 0。
33.如權利要求四所述的方法，所述聚丙烯醯胺按重量計約佔所述凝膠的8%至15，所述丙烯醯胺交聯劑按重量計約佔所述聚丙烯醯胺的2. 5%至5%，所述兩性電解質是濃度約150mM至約250mM的牛磺酸，所述凝膠的pH約為6. 4至約7. 0。
34.如權利要求四所述的方法，所述凝膠是梯度凝膠，其具有的聚丙烯醯胺濃度梯度按重量計由最低約4%升至最高約12%至約20%。
35.如權利要求四所述的方法，所述電勢差約為每釐米凝膠35至75伏特。
36.如權利要求四所述的方法，所述電勢差約為每釐米凝膠40至50伏特。
全文摘要
本發明製作了用作電泳介質的聚丙烯醯胺凝膠，其具有高解析度和對儲存期間水解作用的高抗性，所述凝膠包含作為兩性電解質的牛磺酸、天冬醯胺或上述兩者和作為緩衝劑的三(羥甲基)氨基甲烷或二(2-羥乙基)氨基-三羥甲基甲烷，以及其它常規組分。
文檔編號G01N27/447GK102292633SQ201080006324
公開日2011年12月21日 申請日期2010年1月26日 優先權日2009年1月27日
發明者C·勞維爾, C·帕納託尼, S·彼得森 申請人:生物輻射實驗室股份有限公司