一種甘藍型油菜CMS恢復系的快速批量選育方法與流程
2023-11-11 03:12:02 2
本發明屬於油菜育種技術領域，具體涉及一種快速批量選育CMS恢復系的育種方法。
背景技術：
我國幅員遼闊，自然條件複雜多樣，甘藍型油菜種植區域跨度很大。從播種時期分為春油菜區(春播區)和冬油菜區(秋播區)，而冬油菜區又根據氣候類型和特點分為4個大區，包括長江上、中、下遊和黃淮區。不同生態區光照、溫度、水分、土壤等條件差別很大，而甘藍型油菜對光照、溫度、水分等氣候條件較為敏感，同一品種在不同生態區的表現差別很大。
目前國內種質資源保護手段有限，出於單位自身利益考量，各育種單位之間種質資源交流、合作育種等很難進行，加上長期的自然進化和人工選擇，不同單位所擁有的種質資源，大多僅適於本生態區，導致跨區域品種選育難度大、效率低，限制了我國油菜產業的發展。目前為了跨區域品種選育，有實力的單位在目標推廣區域建立育種基地，但這對人力、物力、財力要求較高，一般單位很難做到。另外，油菜自身的性狀遺傳具有一定的保守性，對一個育種單位而言，其所擁有的種質資源，要適應新的目標生態區，即使在該區域建立育種基地，還需要一個漫長的馴化和選育過程。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種快速批量選育CMS恢復系的育種方法，旨在解決目前國內種質資源保護手段有限，出於單位自身利益考量，各育種單位之間種質資源交流、合作育種等很難進行，加上長期的自然進化和人工選擇，不同單位所擁有的種質資源，大多僅適於本生態區，導致跨區域品種選育難度大、效率低，限制了我國油菜產業發展的問題。
本發明是這樣實現的，一種甘藍型油菜細胞質雄性不育系(CMS)恢復系的快速、批量選育方法,包括如下步驟：
1)以長江上、中、下遊和黃淮區國審的18個甘藍型油菜CMS三系雜交品種等量混合做為聚合親本；
2)當年秋播，把聚合親本按1:2行比種植在隔離網室，行比1的做父本，行比2的做母本；
3)在蕾苔期，利用化學雜交劑「SX-1」誘導母本產生雄性不育；
4)在油菜花期，通過人工輔助授粉，使母本充分授粉結實，成熟時僅收取母本種子，做為下一個輪迴的親本；
5)重複步驟2)到步驟4)，直至進行4個世代的輪迴；
6)把經過4個世代輪迴產生的聚合群體秋季播種，第2年花期，選用該群體正常可育植株主花序和上部分枝上長度3.5-4.0mm的花蕾，以0.5mmol/L的秋水仙鹼加倍染色體48小時，通過小孢子培養獲得雙單倍體(DH)分離群體。
7)把該DH分離群體中正常可育的株系分別種植在4個不同生態區，依據各生態區的育種目標進行表現型選擇，同時和CMS不育系測交進行基因型鑑定，最終選育出一批分別適應長江上、中、下遊和黃淮區的優良CMS恢復系。
進一步,所選擇的聚合親本來自於4個不同生態區域，均為國內多個育種單位選育的優良國審品種，囊括了不同生態區域、不同育種單位的眾多優良性狀基因。
進一步,18個CMS三系雜交種等量混合構成的聚合親本，其基因型為S(R,r)，經過4個世代聚合重組產生新的聚合群體；花期取聚合群體正常植株的花蕾經小孢子培養獲得的DH分離群體，不育株系直接淘汰；正常株系分別種植在4個生態區，依據各生態區育種目標進行表現型選擇符合育種目標的優良株系與CMS不育系進行測交。。
進一步,把獲得的DH分離群體分別放在4個不同生態區進行表現型選擇，選育出的新的CMS恢復系，必然符合該生態區域的育種目標。
進一步,利用化學雜交劑「SX-1」誘導母本產生雄性不育，其技術要求如下：
1)在油菜蕾苔期，母本苔高20cm，主花序最大花蕾長2mm左右時，利用化學雜交劑「SX-1」塗抹油菜莖幹，誘導母本產生雄性不育。由於18個品種生育期進程並不一致，所以在蕾苔期，對母本行滿足要求的植株逐個進行塗莖處理。
2)塗莖誘導方法：吸取「SX-1」原液用食用油配成濃度為5.5-6.5mg/L的藥液，用毛筆塗抹在油菜莖幹上，塗抹位置距離地面10cm左右，塗抹長度5cm左右。
本發明方法所構建的聚合親本，來自於冬油菜區4個不同生態區域，13個育種單位，且均為國審優良品種，包含有眾多適於不同生態區域的優良性狀基因。藉助化學誘導雄性不育技術，進行4個世代的聚合重組，各優良品種進行了充分的互交，眾多優良性狀基因進行了充分的聚合重組，從而產生了一個擁有眾多新的優良性狀基因的聚合群體。通過小孢子培養獲得的DH分離群體，放在4個不同生態區進行性狀選擇和基因型鑑定，最終選育出一批分別適於各自生態區域的優良CMS恢復系。
與傳統跨區育種方法相比，本發明方法具有以下優勢：1)目標針對性強、效率高，所構建的聚合群體自身就包含有4個目標生態區的優良性狀基因，最終選育出的是一批適於各自生態區的優良CMS恢復系，這對於加速跨生態區育種進程、提高育種效率具有極其重要的意義。2)該方法中優良性狀基因雖然來自於國內多個育種單位，但均為公開發售的國審優良品種，不存在資源交流和品種權糾紛問題，對選育的優良CMS恢復系，本單位擁有完全智慧財產權。
附圖說明
圖1是本發明實施例提供的CMS恢復系選育圖。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
本發明目的在於提供一種快速批量選育甘藍型油菜CMS恢復系的方法。與傳統跨區域品種選育相比，利用該方法選育甘藍型油菜CMS恢復系目標性更強、效率更高，並且不存在資源交換和品種權糾紛問題。
如圖1所示，本發明通過以下技術方案實現：一種甘藍型油菜CMS恢復系的快速批量選育方法，包括如下步驟：
1)以長江上、中、下遊和黃淮區國審的18個甘藍型油菜CMS三系雜交品種(見附表)等量混合做為聚合親本；
2)當年秋播，把聚合親本按1:2行比種植在隔離網室，行比1的做父本，行比2的做母本；
3)在蕾苔期，利用化學雜交劑「SX-1」誘導母本產生雄性不育；
4)在油菜花期，通過人工輔助授粉，使母本充分授粉結實，成熟時僅收取母本種子，做為下一個輪迴的親本；
5)重複步驟2)到步驟4)，直至進行4個世代的輪迴；
6)把經過4個世代輪迴產生的聚合群體秋季播種，第2年花期，選用該群體正常可育植株主花序和上部分枝上長度3.5-4.0mm的花蕾，以0.5mmol/L的秋水仙鹼加倍染色體48小時，通過小孢子培養獲得雙單倍體(DH)分離群體。
7)把該DH分離群體中正常可育的株系分別種植在4個不同生態區，依據該生態區的育種目標進行表現型選擇，同時和CMS不育系測交進行基因型鑑定，最終選育出一批分別適應長江上、中、下遊和黃淮區的優良CMS恢復系。
18個CMS三系雜交種等量混合構成的聚合親本，其基因型為S(R,r)，經過4個世代聚合重組產生的新的聚合群體，理論上其不育植株S(r,r)佔1/4，正常植株S(R,R)和S(R,r)共佔3/4。花期取聚合群體正常植株花蕾經小孢子培養獲得的DH分離群體，理論上不育株系S(r,r)佔DH群體總數的1/3，恢復株系S(R,R)佔2/3。在油菜花期，不育株系直接淘汰；正常可育株系分別種植在長江上、中、下遊和黃淮區，依據各生態區育種目標進行表現性選擇；符合育種目標的株系與CMS不育系進行測交，能夠恢復CMS不育系育性的株系即為恢復系。
更具體的技術方案如下所述：
1、利用化學雜交劑「SX-1」誘導母本產生雄性不育，其技術要求如下：
1)在油菜蕾苔期，母本苔高20cm，主花序最大花蕾長2mm左右時，利用化學雜交劑「SX-1」塗抹油菜莖幹，誘導母本產生雄性不育。由於18個品種生育期進程並不一致，所以在蕾苔期，對母本行滿足要求的植株逐個進行塗莖處理。
2)塗莖誘導方法：吸取「SX-1」原液用食用油配成濃度為5.5-6.5mg/L的藥液，用毛筆塗抹在油菜莖幹上，塗抹位置距離地面10cm左右，塗抹長度5cm左右。
2、油菜小孢子培養方法：
1)油菜小孢子的分離提取
在油菜初花一周內，取輪迴群體正常可育植株主花序和上部分枝花序上長度為3.5-4.0mm的花蕾(用生物顯微鏡抽檢小孢子發育是否處於單核晚期)用蒸餾水衝洗乾淨；在超淨工作檯上先用70％酒精滅菌30s，再用20％次氯酸鈉滅菌15min，然後用無菌水衝洗3次；取滅菌好的花蕾放入B5培養基中研磨成勻漿；用300目雙層尼龍網過濾，10ml離心管收集濾液，經800rpm離心5min，吸去上清液，加入液體B5培養基懸浮小孢子，再離心，重複3次，吸去上清液。
2)染色體加倍
在上述離心管中加入含有0.5mmol/L秋水仙鹼的NLN-13培養基，懸浮小孢子，並分裝於150ml三角瓶中(每瓶40-45個花蕾，20-25ml培養液)，用滅菌的尼龍紙封口，32℃暗培養48h。
3)小孢子培養
將經過上述處理的溶液1000rpm離心5min，吸取上清液，去除秋水仙鹼，並加入無激素的NLN-13培養基懸浮洗劑和離心1次，最後加入含6-BA0.05mg/L、NAA0.5mg/L的NLN-13培養基懸浮小孢子，接著將小孢子溶液分裝於直徑為7.5cm的無菌培養皿中，每皿7.5ml(每皿約5-6個花蕾)，Parafilm封口，在32℃的水浴恆溫培養箱中暗培養24h，然後轉移至25℃的水浴恆溫培養箱中培養。當肉眼可見胚時，將培養皿轉移至搖床上，在25℃下40-60rpm暗培養7d。7d後改用較大的培養皿和含有ABA0.3mg/L的NLN-13培養基在25℃條件下40-60rpm搖床光照培養。以後用相同的培養條件每7d繼代1次，直到胚發育成熟，並長出完整的子葉，分化成苗後將其轉移至含有6-BA0.5mg/L的B5固體培養基上進行繼代和增殖，適時移栽至大田。
附表：本發明輪迴親本所用品種名錄
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。