一種酶催化法合成α-熊果苷的純化方法與流程
2024-04-14 22:27:05
一種酶催化法合成
α-熊果苷的純化方法
技術領域
1.本發明屬於α-熊果苷製備技術領域，涉及一種從酶催化法合成α-熊果苷的反應液中分離出高純度α-熊果苷的純化方法。
背景技術：
2.熊果苷是一種氫醌苷類化合物，是酪氨酸酶的抑制劑，能阻斷多巴及多巴醌的合成，從而有效地抑制黑色素的生成，具有美白作用。天然提取物中含的是β-熊果苷，但α-熊果苷的美白效果是β-熊果苷的10倍以上，有效性和安全性高於β-熊果苷。然而，α-熊果苷化學合成比較難，易形成α-熊果苷和β-熊果苷的混合物，分離難度大。因此，越來越多的研究傾向於用微生物法或酶法合成α-熊果苷。
3.酶催化法合成α-熊果苷採用麥芽糖、對苯二酚做原料，在酶催化反應結束後會有少量的對苯二酚殘餘，而對苯二酚是一種已知的皮膚致敏物，禁用於護膚品中，因此，在α-熊果苷的分離純化過程中若不能有效除去對苯二酚，會直接影響產品質量甚至導致產品不合格。
4.目前市場對對苯二酚殘留量要求極高，需要小於10ppm或者未檢出，但目前生產α-熊果苷的工藝在分離純化過程中，基本都是先通過弱極性大孔吸附樹脂去除色素分子，再通過強極性大孔吸附樹脂吸附，使α-熊果苷和對苯二酚按極性不同進行分離，這種分離方法因α-熊果苷和對苯二酚極性差異不大，對苯二酚很難徹底去除乾淨，效率較低，很難應用於工業化生產。
5.公開號為cn103483401α的中國發明專利公開了一種從α-熊果苷發酵液中分離對苯二酚的方法，其通過磷酸三丁酯進行多次萃取與反萃取，並需引入無機鹽，因此該方法工藝複雜，且所使用的磷酸三丁酯對環境不友好。
技術實現要素：
6.本發明的目的是針對現有純化方法成本高、效率低，且效果不理想的問題，提供一種酶催化法合成α-熊果苷的純化方法。本發明利用大孔極性吸附樹脂與deαe-陰離子高分子聚合填料進行兩步操作，從酶催化法合成α-熊果苷的反應液中分離α-熊果苷，具有產物純度高、無有機溶劑殘留、生產過程中無汙染排放的特點。
7.本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：
8.一種酶催化法合成α-熊果苷的純化方法，該方法包括以下步驟：
9.1)將酶催化反應液過濾除去菌體，得到濾液；
10.2)將濾液調至酸性，之後用大孔極性吸附樹脂吸附濾液中的α-熊果苷及對苯二酚，經洗脫、溶劑置換後，得到混合液；
11.3)將混合液調至鹼性，使對苯二酚反應生成對苯二酚鹽，之後用deαe-陰離子高分子聚合填料去除混合液中的對苯二酚鹽，得到純化後的α-熊果苷液。
12.進一步地，步驟1)中，所述的酶催化反應液中含有菌體、麥芽糖、磷酸鹽、α-熊果苷
及對苯二酚。
13.進一步地，步驟1)中，將酶催化反應液通過中空纖維膜過濾，除去菌體。
14.進一步地，所述的中空纖維膜的截留分子量為6000-10000dr。
15.進一步地，步驟2)中，用鹽酸將濾液調至ph值為1-3。
16.進一步地，步驟2)中，用乙醇溶液進行洗脫；洗脫前，先用平衡液清洗大孔極性吸附樹脂。
17.進一步地，溶劑置換過程為：先旋轉蒸發去除乙醇，得到乾粉，之後將乾粉溶於水中。
18.進一步地，步驟3)中，將混合液調至ph值為9-10。
19.進一步地，步驟3)中，用氫氧化鈉將混合液調至鹼性。
20.進一步地，步驟3)中，純化後的α-熊果苷液經低溫凍幹，得到α-熊果苷乾粉。
21.與現有技術相比，本發明在分離純化酶催化反應液中的α-熊果苷時，先通過中空纖維膜過濾除去菌體，之後用大孔極性吸附樹脂吸附α-熊果苷及雜質對苯二酚，再用deαe-陰離子高分子聚合填料吸附去除對苯二酚，從而得到高純度、不含有機溶劑的α-熊果苷液，經低溫凍幹可進一步得到得α-熊果苷乾粉，具有產物純度高、無有機溶劑殘留、生產過程中無汙染排放的特點。
具體實施方式
22.下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。本實施例以本發明技術方案為前提進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。
23.本發明提供了一種酶催化法合成α-熊果苷的純化方法，包括以下步驟：
24.1)將酶催化反應液過濾除去菌體，得到濾液；
25.2)將濾液調至酸性，之後用大孔極性吸附樹脂吸附濾液中的α-熊果苷及對苯二酚，經洗脫、溶劑置換後，得到混合液；
26.3)將混合液調至鹼性，使對苯二酚反應生成對苯二酚鹽，之後用deαe-陰離子高分子聚合填料去除混合液中的對苯二酚鹽，得到純化後的α-熊果苷液。
27.步驟1)中，酶催化反應液中含有菌體、麥芽糖、磷酸鹽、α-熊果苷及對苯二酚。將酶催化反應液通過中空纖維膜過濾，除去菌體。中空纖維膜的截留分子量為6000-10000dr。
28.步驟2)中，用鹽酸將濾液調至ph值為1-3。用乙醇溶液進行洗脫；洗脫前，先用平衡液清洗大孔極性吸附樹脂。溶劑置換過程為：先旋轉蒸發去除乙醇，得到乾粉，之後將乾粉溶於水中。
29.步驟3)中，用氫氧化鈉將混合液調至ph值為9-10。純化後的α-熊果苷液經低溫凍幹，得到α-熊果苷乾粉。
30.實施例：
31.一種酶催化法合成α-熊果苷的純化方法，具體操作如下：
32.1)將酶催化反應液通過中空纖維膜過濾，除去菌體，得到濾液。
33.中空纖維膜過濾採用外壓型纖維超濾膜柱，截留分子量為6000-10000dr，下進液上流岀得濾液。
34.2)大孔極性吸附樹脂分離。
35.分離目的：
36.大孔極性吸附樹脂吸附濾液中的α-熊果苷及雜質對苯二酚，穿出麥芽糖和磷酸鹽(此步不對α-熊果苷進行分離，目的是去除麥芽糖及磷酸鹽，這種分離方式的作用是吸附α-熊果苷的同時，樹脂在ph＝1-3時氫醌的保留強度增加，使進樣流岀液中不含不能直接排放的對苯二酚，減少了汙水處理費用。
37.分離過程：
38.大孔極性吸附樹脂：seplite.lx-lge(西安藍曉科技新材料股份有限公司生產)，顆粒度：0.1-0.6mm。
39.色譜柱尺寸：直徑50mm
×
長度1000mm，柱體積：1.962l。
40.流動相：平衡液：純淨水用鹽酸調ph至2.0；
41.洗脫液：30％(體積分數)乙醇溶液；
42.再生液：80％(體積分數)乙醇溶液。
43.取濾液5l，含α-熊果苷130g、對苯二酚4.8g，用鹽酸調ph至2.0，以0.5bv/h的流速從柱尾由下至上進樣，進樣結束後用3倍柱體積的平衡液洗柱，再用2倍柱體積的洗脫液洗柱並收集α-熊果苷洗脫液。
44.用3倍柱體積的再生液洗柱，再用5倍柱體積的平衡液洗柱，即可再次進樣分離。
45.檢測結果：30％(體積分數)乙醇溶液洗脫收集體積：4l；
46.α-熊果苷：113.5g，收率87.3％；
47.對苯二酚：3.85g；
48.麥芽糖：未檢出。
49.α-熊果苷洗脫液經旋轉蒸發脫乙醇，得到的乾粉用1l的純淨水溶解。
50.3)deαe-陰離子交換色譜層析。
51.分離原理：
52.對苯二酚的酚羥基具有弱酸性，可以失去一個或兩個質子生成相應的酚鹽負離子。旋蒸乾粉加少量水溶解並調ph至弱鹼性，對苯二酚反應生成帶負電荷的酚鹽，吸附在deαe-陰離子高分子聚合填料上，α-熊果苷與deαe-陰離子高分子聚合填料作用力小，基本不吸附而穿出柱體，從而實現與對苯二酚的分離。
53.分離過程：
54.層析填料：deαe-陰離子高分子聚合填料(上海漁霽生物技術有限公司生產)，顆粒度：50-80μm。
55.柱尺寸：直徑40mm
×
長度500mm，柱體積：0.628l。
56.uv檢測：280nm，分離流速：0.5bv/h。
57.分離樣品檢測：α-熊果苷：113.5g/l，對苯二酚：3.85g/l。
58.分離流動相：平衡液：純淨水；
59.再生液：80％(體積分數)乙醇溶液。
60.進樣，以0.5bv/h流速進樣1l體積，當uv基線升高時開始收集α-熊果苷流出液，進樣結束用平衡液洗至uv基線下降，停止收集α-熊果苷。用5倍柱體積的再生液洗柱，再用5倍柱體積的平衡液洗柱，即可再次進樣分離。
61.檢測結果：α-熊果苷：109g，收率：96％，雜質對苯二酚未檢出。
62.純度：99.7％。
63.上述的對實施例的描述是為便於該技術領域的普通技術人員能理解和使用發明。熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，並把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經過創造性的勞動。因此，本發明不限於上述實施例，本領域技術人員根據本發明的揭示，不脫離本發明範疇所做出的改進和修改都應該在本發明的保護範圍之內。