金屬納米顆粒結合金屬納米柱結構的螢光增強結構及方法與流程
2024-04-14 20:37:05 2
1.本發明涉及了一種螢光增強結構，尤其是涉及了一種金屬納米顆粒結合金屬納米柱結構的配合對螢光增強結構。
背景技術：
2.螢光效應在物質檢測、生物醫學、發光器件、分子傳感器等方面有重要應用，然而現在的探測技術卻很難達到單分子水平，因為這時的螢光信號的強度和光穩定性太低。令人欣慰的是，金屬納米結構支持的表面等離激元所具有的局域場增強特性可以用來極大地增強螢光效應，從而使表面等離子體激元參與的螢光效應擁有誘人的前景。
3.早在20世紀70年代，drexhage等人就發現，金屬納米結構增強螢光現象。在早期由於大多是研究學者主要關注表面增強拉曼效應的研究，表面螢光增強沒能得到科研人員的重視。表面螢光增強再光譜傳感檢測和生物醫療方面具有重要的研究意義。
4.21世紀初，lakowicz等人系統的研究了銀納米薄膜對螢光分子的光譜調控規律，對金屬表面增強螢光現象展開了系統研究，並對其產生機理及其應用進行了綜述。
5.一般而言，影響表面增強螢光的因素有如下三種：(1)襯底金屬在外光場激勵下產生表面等離共振引起的局域場增強。(2)螢光物種量子產率和輻射速率的增加。(3)襯底金屬與螢光物種之間的能量傳遞:當外光場的入射光頻率與襯底金屬的固有頻率以及螢光物種的發射波段三者耦合匹配時，會使金屬表面形成集體振蕩模式引起局域場增強，在局域場增強的情況下，螢光物種的自由電子躍遷數目增多，螢光輻射速率加快，量子產率提高。但是如果襯底金屬與螢光物種的間距過近就會導致激發態螢光物種以非輻射的方式將能量傳遞給襯底金屬，吸收能量後的襯底金屬產生熱效應並且引起螢光物種的輻射效率降低，發生螢光猝滅現象。為了獲得良好的螢光增強效果，螢光增強與猝滅之間最佳平衡態的研究還在持續中。
6.當今技術已多數應用于衡量檢測、生物醫學成像、診斷、納米生物技術、光電子學和法醫學、食品控制和安全等重要領域相關的化學和生物物種。作為目標分析物的實時和原位分析方法，基於螢光的傳感器具有高靈敏度、高選擇性、無創測量和長距離傳輸方便的優點。然而，它們還存在螢光量子效率低、環境依賴性強和光漂白等缺點，嚴重阻礙了它們的廣泛應用。納米結構的材料類型、組成和幾何設計的變化顯著影響光降解抗性、螢光強度和螢光團的光穩定性。
技術實現要素：
7.為了解決背景技術中存在的問題，本發明所提供了一種金屬納米顆粒結合金屬納米柱結構的配合對螢光增強結構，主要是採用新的一種納米金屬結構，實現對免疫分析中的螢光蛋白的高靈敏度檢測，能夠提高檢測得到靈敏度。
8.本發明採用的技術方案是：
9.一、一種螢光增強結構：
10.包括平面的襯底、金屬納米柱和金屬納米顆粒，布置在金屬納米柱上面/周圍，使得金屬納米柱被多個金屬納米顆粒不完全包裹，如圖3-圖4所示。
11.所述的金屬納米柱以陣列布置在襯底之上，形成金屬納米柱陣列，如圖1和圖2所示。
12.所述的金屬納米柱為金納米柱，金屬納米顆粒為金納米顆粒。
13.所述的金屬納米顆粒無序地分布在金屬納米柱上面的周圍，如圖5所示。
14.所述的襯底可採用玻璃片。
15.所述的金納米顆粒的直徑尺寸為20～80nm，所述的金屬納米柱的直徑尺寸為75nm的直徑，220nm的高，金屬納米顆粒與金屬納米柱的距離範圍為6～20nm。
16.所述的金屬納米顆粒與金屬納米柱的包裹分布情況根據金納米顆粒的數量、大小和所需結合的抗原抗體濃度有關。
17.具體實施中，本發明是利用金納米顆粒和金納米柱結合的一種新結構來進行金屬螢光增強。具體是在金納米柱結構的基礎上加上金納米顆粒，形成的一種新的結構來對金屬進行更進一步的螢光增強。
18.單獨的金納米顆粒能夠起到金屬螢光增強的效果，襯底配合金納米顆粒，在有效距離、間隙及周圍也能夠起到電磁場增強，起到螢光增強的效果。
19.二、一種螢光增強結構的製備方法：
20.將帶有螢光元素的抗體結合到金屬納米顆粒上，形成圖10所示的結構，對金屬納米柱/金屬納米柱陣列進行抗原修飾，隨後將抗原修飾的金屬納米柱/金屬納米柱陣列和抗體修飾的金屬納米顆粒進行結合，製備獲得螢光增強結構。
21.金屬納米柱/金屬納米柱陣列和金屬納米顆粒之間的連接採用螢光免疫分析中的抗體抗原特異性結合來連接，兩者之間的距離由蛋白大小來決定。
22.將帶有螢光元素的抗體結合到金屬納米顆粒上，形成圖10所示的結構，對金屬納米柱陣列進行抗原修飾，隨後將兩者結合，形成圖11所示的。
23.所述的製備方法具體為：
24.1)製備金納米柱陣列
25.在玻璃片的襯底上進行真空蒸鍍製備形成金屬納米柱結構，從而由玻璃片的襯底和金屬納米柱結構共同組成形成金納米柱底片；
26.2)修飾金納米柱底片
27.對於金納米柱底片進行抗原蛋白的修飾，將金納米柱底片置於孔板中，浸泡交聯劑dsp一段時間，之後使用緩衝液在孔板中進行清洗兩回，隨後孔板中加入goat-igg抗原浸泡一段時間，再用緩衝液pbst清洗多餘的goat-igg抗原兩回；往後再於孔板中加入牛血清蛋白bsa將金納米柱底片上多餘的交聯劑進行填充，最後使用緩衝液pbst清洗多餘的牛血清蛋白bsa兩回，獲得抗原蛋白修飾的金納米柱底片；
28.3)修飾金納米顆粒
29.將金納米顆粒超聲分散，加入活化劑edc，常溫反應，取抗體anti-goat-igg兔抗山羊抗體過g25離心柱脫鹽，加入已活化的金納米顆粒中，常溫反應一段時間，之後採用進行離心、沉澱用pbs重懸，最後加入bsa穩定劑使其穩定，獲得修飾完成的金納米顆粒；
30.4)將抗原蛋白修飾的金納米柱底片與修飾完成的金納米顆粒反應
31.用修飾完成的金納米顆粒溶液浸泡抗原蛋白修飾的金納米柱底片，使抗體抗原結合，之後再用pbst緩衝液進行衝洗兩回，製備獲得螢光增強結構。
32.本發明具有以下的有益效果和優勢：
33.本發明具有檢測的高靈敏度：原僅僅只有金屬納米柱的結構時，螢光亮度已經有所提高，現在在金納米柱上增加納米顆粒，能夠更有效的提高螢光效果
34.本發明檢測範圍廣：除了我們使用的山羊抗體抗原之外，還可以檢測多種類型的抗原抗體。
35.本發明製作簡單：主要結構就是金屬納米柱和金金屬納米顆粒的一個結合
36.本發明可應用於微流控傳感晶片上；當帶有抗原的金屬納米顆粒流過含有金納米柱底片的反應室時，能夠快速捕獲，並且能夠便於觀測。
37.總結來說，本發明方案具有高靈敏度、檢測範圍廣、製作簡單、易於觀測的特點。
附圖說明
38.圖1為金屬納米柱陣列襯底俯視圖；
39.圖2為金屬納米柱陣列襯底側視圖；
40.圖3為與金屬納米顆粒結合的金屬納米柱陣列大致俯視圖；
41.圖4為與金屬納米顆粒結合的金屬納米柱陣列大致側視圖；
42.圖5為圖4的局部放大圖；
43.圖6為對比例1的僅金屬納米柱仿真圖；
44.圖7為對比例1的加入金屬納米顆粒與金屬納米柱結合的仿真圖；
45.圖8為對比例1的最高電場與最高柱周圍電場圖；
46.圖9為對比例2的最高電場與最高柱周圍電場圖；
47.圖10為標記帶著螢光的抗體的金屬納米顆粒示意圖；
48.圖11為金屬納米顆粒(標記螢光的抗體)與金屬納米柱(含抗原)結合示意圖；
49.圖12為器件傾斜角度的金納米柱俯視圖；
50.圖13為器件傾斜角度的金納米柱側視圖；
51.圖14為和金屬納米顆粒結合的大致俯視圖；
52.圖15為和金屬納米顆粒結合的大致側視圖。
具體實施方式
53.下面結合附圖及具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
54.本發明的實施例如下：
55.實施例1
56.1)製備金納米柱陣列
57.在玻璃片上進行真空蒸鍍，且將玻璃片傾斜一定的角度，利用陰影效應在蒸鍍時形成傾斜的金屬納米柱結構。
58.金屬納米柱結構的第一層是鈦，以方便連結玻璃和金屬，第二層為銀，第三層為金，模擬金納米柱。
59.具體地是先在玻璃片布設一薄層鈦，然後在鈦上布置柱體的銀，銀之外包裹上金，
從而最後形成金屬納米柱，平均大小約為高度220nm，寬度為75nm。
60.金屬納米柱和金屬納米柱共同形成金納米柱底片，如圖12和圖13所示。
61.2)修飾金納米柱底片
62.對於金納米柱底片進行抗原蛋白的修飾，形成圖11所示的。
63.首先使用一塊3cm*3cm的金納米柱底片於孔板中，浸泡交聯劑(dsp)2～2.5h。之後使用緩衝液(吐溫-20配pbs製成的pbst)在孔板中進行清洗兩回。
64.隨後孔板中加入1ug/ml濃度的goat-igg抗原浸泡2h，再用緩衝液(pbst)清洗多餘的抗原兩回。
65.往後於孔板中加入牛血清蛋白(bsa)將金納米柱底片上多餘的交聯劑進行填充，最後使用緩衝液(pbst)清洗多餘的bsa，也是清洗兩回。獲得抗原蛋白修飾的金納米柱底片。
66.3)修飾金納米顆粒
67.選用大約平均直徑未80nm的金納米顆粒，將金納米顆粒超聲分散15min。
68.加入3ul(20mg/ml)的活化劑edc，室溫反應15分鐘。取250ul的抗體anti-goat-igg(兔抗山羊抗體)過g25離心柱脫鹽，加入已活化的金納米顆粒中，常溫反應30min。之後採用轉速12000rpm進行離心10min，沉澱用pbs重懸。最後加入bsa穩定劑使其穩定。形成圖10所示的結構。
69.4)將抗原蛋白修飾的金納米柱底片與修飾完成的金納米顆粒反應
70.用修飾完成的金納米顆粒溶液100ul浸泡金納米柱底片1h，使抗體抗原結合，之後再用pbst緩衝液進行衝洗兩回，製備結果如圖14和圖15所示。最後即可觀測螢光現象。
71.帶有金屬納米柱的襯底是增強螢光免疫分析有效的納米襯底，在此基礎上，增加球形金納米顆粒形成的新結構從comsol仿真上證明有使金屬納米柱平均電場增強的效果。通過實驗研究發現，實際中這個結構更傾向於金屬納米顆粒無序的分布在金屬納米柱周圍。
72.以下對比例中將一顆金屬納米顆粒與一根金屬納米柱於仿真軟體中設計為軸對稱結構設置不同的柱徑，球徑，柱與球的距離，對此進行仿真。
73.對比例1
74.當沒有球形顆粒時，如圖6，布置75nm的金屬納米柱，周圍產生的電場約為50v/m，最大電場如圖達到54.9v/m。
75.隨後對其加入球形納米金顆粒進行仿真，例圖7，因實驗所用抗原抗體樣品的大小最小約為6nm，因此設定球與柱的距離為6-21nm，數據跳躍間距為3nm。
76.表1.75nm的金屬納米柱，結合無球和有球的對比
[0077][0078]
對比例2
[0079]
設置50nm的金屬納米柱，沒有球形顆粒時，周圍產生的電場約為48v/m,最大電場達到51.2v/m。情況如表2。
[0080]
表2.50nm的金屬納米柱，結合無球和有球的對比
[0081][0082]
根據上表的數據，可以得出，加入球形顆粒之後，整體的電場最大值大於單獨的金納米棒而柱周圍的電場強度也有增加，雖然並非非常明顯，但是這些仿真足以初步說明金納米顆粒與金屬納米柱結合能夠更進一步的提高電場的強度，如此概念的提出，說明兩種納米金屬結構的互相作用能夠提升表面等離子效應，增大部分場強。
[0083]
由此，還能夠明顯觀察到，在球柱距離相同的對照組中，時當球形金屬納米顆粒的直徑與金屬圓柱的直徑相當時，可獲得最高的電場值，柱周圍的電場也是最大的。比如表1中，球直徑為70nm，球柱距離為6nm時，可以獲得最高的電場190v/m，且柱周圍的電場強度達到61v/m，如圖8。再比如表2中，球直徑為50nm，球柱距離為6nm時，可以獲得最高電場160v/m,且柱周圍的電場強大達到58v，如圖9。