一種治療黑素瘤的聯合用藥物組合物及其應用
2024-04-15 09:32:05 1
1.本發明屬於醫藥生物技術領域，涉及一種治療黑素瘤的聯合用藥物組合物及其應用。
背景技術：
2.惡性黑色素瘤(malignant melanoma,mm)，簡稱惡黑，是一種由黑色素細胞惡性轉化產生的腫瘤。這是一種罕見，但非常致命的疾病。近年來，mm的發病率持續上升，佔所有皮膚癌的1％左右，佔所有皮膚癌死亡人數的90％，而且晚期黑色素瘤患者中位生存期僅6個月，5年生存率不到5％，死亡率高、侵襲性強、極易轉移，嚴重威脅人類健康。在過去幾十年中，對於早期確診的黑素瘤可通過手術切除的方式治療，而由於黑色素瘤影響因素眾多，增殖通路複雜，極易轉移，導致中晚期患者治癒困難。
3.研究報導，死亡受體5(death receptor 5，dr5)是極具潛力的抗腫瘤藥物靶點，它在多種腫瘤細胞中高表達，而在正常細胞中表達量較低或不表達，與外來配體結合後，選擇性的誘導腫瘤細胞凋亡，對機體的正常組織細胞沒有細胞毒性作用。特異性靶向dr5受體的抗體因其特異性強、安全性高並且在臨床前研究中取得了很多的成果，成為目前治療癌症最有前景的藥物之一，也有部分dr5的抗體激動劑可用於臨床試驗。但很多細胞系和原代腫瘤細胞對dr5抗體容易產生耐藥，一定程度上降低了dr5抗體誘導細胞凋亡的效果，限制了其在腫瘤治療上的應用。
4.化療藥物雷公藤甲素(triptolide，tpl)是從衛矛科植物雷公藤中分離出的活性最強的物質，是一種含有三個環氧基的環氧二萜內酯化合物，是雷公藤抗腫瘤藥效的主要成分，雷公藤甲素可通過促進黑色素瘤、腸癌、膀胱癌細胞凋亡而發揮抗腫瘤作用。研究表明，雷公藤甲素能抑制惡性黑素瘤細胞中hif-1α及vimentin、n-cadherin的表達，通過抑制emt通路抑制惡性黑色素瘤細胞的增殖及侵襲。但是雷公藤甲素屬於毒性成分，且毒性較強，對機體造成損害，這在很大程度上限制了雷公藤甲素的臨床應用。
技術實現要素：
5.針對現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種治療黑素瘤的聯合用藥物組合物及其應用。
6.為達到此發明目的，本發明採用以下技術方案：
7.第一方面，本發明提供一種治療黑素瘤的聯合用藥物組合物，所述治療黑素瘤的聯合用藥物組合物包括藥物活性成分，所述藥物活性成分包括雷公藤甲素和抗人dr5單克隆抗體。
8.本發明創造性地開發了一種新的治療黑素瘤的藥物聯用方式，即將雷公藤甲素(tpl)和抗人dr5單克隆抗體(dr5mab)聯合給藥，一方面，抗人dr5單克隆抗體可以與mm細胞表面的dr5特異性結合誘導細胞凋亡，特異性強，安全性高且對正常細胞無毒副作用；另一方面，抗人dr5單克隆抗體和tpl的聯用，tpl在增敏抗人dr5單克隆抗體的同時又能夠抑制
mm細胞的增殖和侵襲，對mm細胞有雙重抑制和殺傷作用，二者聯用改善了抗人dr5單克隆抗體的耐藥性，同時降低了tpl的毒副作用，從而更有效地促進mm細胞凋亡，增強療效。研究發現，兩者在抗黑素瘤的效果上具有顯著的協同增效作用。這為黑素瘤的治療提供了新的策略，具有重要的意義。
9.優選地，所述雷公藤甲素與抗人dr5單克隆抗體的質量比為1:(2-36)，例如1:2、1:3、1:5、1:10、1:15、1:20、1:30等，該數值範圍內的其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。
10.所述雷公藤甲素與抗人dr5單克隆抗體的質量比在1:(2-36)範圍時，其具有更優異的協同增效作用，能夠更有效地促進mm細胞凋亡，增強療效。
11.優選地，所述藥物組合物還包括藥學上可接受的輔料。
12.優選地，所述輔料包括載體。
13.優選地，所述輔料還包括賦形劑、填充劑、粘合劑、潤溼劑、崩解劑、助溶劑、滲透壓調節劑、ph調節劑、抗氧劑、抑菌劑或緩衝劑中的任意一種或至少兩種的組合。
14.在本發明中，所述聯合用藥物組合物為單一的複方製劑或兩種單獨的製劑的組合。
15.上述雷公藤甲素與抗人dr5單克隆抗體可以以單一的複方製劑對病患進行施用或者以兩種單獨的製劑對病患進行同時、交替或順序施用。
16.在本發明中，所述聯合用藥物組合物為兩種單獨的製劑的組合時，兩種單獨的製劑同時施用或依次施用。
17.在本發明中，所述製劑為藥劑學上可接受的任意一種劑型。
18.第二方面，本發明提供根據第一方面所述的治療黑素瘤的聯合用藥物組合物在製備預防、緩解或治療黑素瘤的藥物中的應用。
19.第三方面，本發明提供根據第一方面所述的治療黑素瘤的聯合用藥物組合物在製備黑素瘤細胞增殖抑制劑中的應用。
20.根據本發明的研究結果，所述聯合用藥物組合物具有顯著地抑制黑素瘤細胞增殖的作用，因此，該結果表明所述聯合用藥物組合物可以作為一種以非診斷和/或治療為目的的黑素瘤細胞增殖抑制劑，用於科研領域，例如研究更多的黑素瘤細胞生長、凋亡、克隆形成和代謝機制或行為，篩選治療黑素瘤的藥物等等。
21.相對於現有技術，本發明具有以下有益效果：
22.本發明創造性地開發了一種新的治療黑素瘤的藥物聯用方式，即將雷公藤甲素(tpl)和抗人dr5單克隆抗體聯合給藥，一方面，抗人dr5單克隆抗體可以與mm細胞表面的dr5特異性結合誘導細胞凋亡，特異性強，安全性高且對正常細胞無毒副作用；另一方面，抗人dr5單克隆抗體和tpl的聯用，tpl在增敏抗人dr5單克隆抗體的同時又能夠抑制mm細胞的增殖和侵襲，對mm細胞有雙重抑制和殺傷作用，二者聯用改善了抗人dr5單克隆抗體的耐藥性，同時降低了tpl的毒副作用，從而更有效地促進mm細胞凋亡，增強療效。研究發現，兩者在抗黑素瘤的效果上具有顯著的協同增效作用。這為黑素瘤的治療提供了新的策略，具有重要的意義。
具體實施方式
23.下面通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案。本領域技術人員應該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發明，不應視為對本發明的具體限制。
24.下述內容涉及的a375黑色素瘤細胞進行復甦和傳代的操作為：
25.(1)從-80℃冰箱中取出凍存的a375黑色素瘤細胞立即放入37℃水浴鍋中快速解凍，搖晃直至完全融化。在無菌操作臺快速打開凍存管，移取細胞至加有5ml新鮮培養基的15ml離心管中，1000rpm，離心5min，移去上層培養液，加入新鮮培養基(含10％胎牛血清，1％青黴素+鏈黴素)緩慢吹打數下，然後將重懸好的細胞移至培養瓶中，放入co2培養箱(37℃，5％co2)中培養，隔一日更換培養液。
26.(2)待a375細胞生長至80％-90％匯合度時，棄上清，用pbs緩衝液清洗細胞表面3次，加入1ml胰蛋白酶，消化2分鐘，在倒置顯微鏡下觀察，發現細胞收縮變圓並開始脫離壁面時，加入6ml ripm1640完全培養基，吹打混勻形成細胞懸液，按1:3比例進行傳代培養。
27.下述涉及的dr5mab為購自biotechne公司的型號為eqd0217032的產品。
28.下述涉及的雷公藤甲素為購自成都埃法生物科技有限公司公司的型號為38748-32-2的產品。
29.實施例1
30.tpl和dr5mab對黑素瘤細胞的細胞毒試驗：
31.操作方法：取對數生長期a375細胞接種於96孔培養板，細胞密度為1
×
104個細胞/孔，每孔100μl。96孔板放置於37℃、5％co2培養箱中培養12h後，棄去原培養基，然後分別加入含有系列濃度梯度(10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml,60ng/ml,80ng/ml,100ng/ml,200ng/ml)的tpl，或(10ng/ml,100ng/ml,500ng/ml,1000ng/ml,5000ng/ml,10000ng/ml)的dr5mab，空白對照組加入不含藥的培養基(control)。每個實驗組設置6個復孔。培養48h後將含藥培養液吸出，加10μl cck-8溶液。置於37℃培養箱中繼續孵育3h，後迅速用酶標儀測定450nm處的吸光度值(od)。得到的數據用graphpad軟體進行處理並計算ic50值。
32.計算結果為，tpl和dr5mab的ic50值分別為67.68ng/ml和616ng/ml。
33.實施例2
34.tpl和dr5mab對抗黑素瘤細胞的協同比例的考察：
35.操作方法為：配製雷公藤甲素和dr5mab的母液濃度分別為70ng/ml和620ng/ml(溶劑均為rpmi細胞培養液)，設置系列比例分別為80％:20％，60％:40％，40％:60％和20％:80％的混合液，採用梯度濃度一定比例的雷公藤甲素和dr5mab處理a375黑色素瘤細胞，計算對細胞的抑制率。
36.取對數生長期的a375細胞接種於96孔培養板，細胞密度為1
×
104個細胞/孔，每孔100μl。96孔板放置於37℃、5％co2培養箱中培養12h，然後棄去原培養基，加入上述含有tpl和dr5mab組合的藥物溶液，培養48h後加10μlcck-8溶液。置於37℃培養箱中繼續孵育3h，後迅速用酶標儀測定450nm處的吸光度值(od)，並計算藥物聯合作用指數cdi。
37.計算公式為cdi＝od(a+b)/od(a)
×
od(b)。
38.cdi＞1表示兩藥具有拮抗作用，cdi＝1表示兩藥具有疊加作用，cdi＜1表示兩藥具有協同作用，cdi＜0.7表示兩藥具有顯著協同作用。
39.結果表明，上述比例下cdi值依次分別為0.410、0.202、0.232、0.215，說明上述混
合比例下雷公藤甲素和dr5mab在抗黑素瘤效果上均具有顯著的協同作用。
40.實施例3
41.tpl和dr5mab聯合用藥對抗黑素瘤細胞的細胞毒性實驗：
42.操作方法為：取雷公藤甲素和dr5mab的母液，設置比例為60％:40％的混合液，設置2
×
、1
×
、1/2
×
、1/4
×
、1/6
×
、1/8
×
、1/10
×
系列協同濃度，處理a375黑色素瘤細胞，計算對細胞的抑制率。方法同(1)，得到的數據用graphpad軟體進行處理並計算ic50值。
43.結果表明，二者聯用後tpl和dr5mab對a375細胞的ic50值分別為29.39ng/ml、78.68ng/ml，明顯低於tpl和dr5mab單獨使用時的ic50值。這說明二者聯用可以顯著降低各自的使用量，因此改善了抗人dr5單克隆抗體的耐藥性，同時降低了tpl的毒副作用，從而更有效地促進mm細胞凋亡，增強療效。
44.申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的一種治療黑素瘤的聯合用藥物組合物及其應用，但本發明並不局限於上述實施例，即不意味著本發明必須依賴上述實施例才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明產品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍和公開範圍之內。
45.以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明並不限於上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本發明的保護範圍。
46.另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。