一株撕裂蠟孔菌的促生作用及其應用的製作方法

2024-04-11 03:04:05

本發明涉及一株撕裂蠟孔菌(ceriporialaceratehg2011)具有促進作物生長的作用，能用於生產生物肥料，促進烤菸生長，提高辣椒和茄子的產量品質，屬於農業微生物領域。

背景技術：

化學肥料是重要的農業生產資料，是農作物的「糧食」。現代農業栽培中，化肥用量大。但是，長期大量施用化肥帶來一系列生產和環境問題，如肥料利用率低，浪費嚴重；土壤板結，肥力下降；水體富營養化，汙染環境；農產品品質降低等。

在作物生長過程中，植物激素如iaa具有促進作物生長的作用。部分雙子葉植物尤其是生長於鈣質和鹼性土壤的果樹容易缺鐵，鐵載體的絡合作用可促進植物吸收鐵元素。土壤中的無機磷主要以難溶性形式存在，生物有效性低；磷肥施入土壤之後，與鈣、鎂、鐵、鋁結合，形成溶解性低的磷酸鹽，故磷肥利用率一般不超過20％左右。土壤全鉀一般超過1％，但有效含量較低。因此，活化土壤無機磷鉀有益於減施化肥，提高肥料利用率，保護環境和保障糧食安全。

近年來，人們發現了多種能促進植物生長的微生物菌株，它們能單獨使用，也能與其它微生物和肥料混合使用，把促生作用和提高肥效作用較好地結合起來，在農業生產中表現出良好的應用前景。因此，促生微生物的篩選和應用受到業界的普遍關注。但是，目前促生微生物的研究應用存在以下突出問題：(1)高效菌種匱乏，肥效有待進一步提高；(2)菌種適應能力差，在我國農業生產地域多樣、氣候條件複雜，促生菌種的適應能力影響其效果的發揮；(3)優良菌種數量有限，農業應用的選擇性小。此外，促生微生物菌劑一般為活菌，主要依靠其繁殖過程中所產生的代謝產物而起作用，在田間自然條件下影響其生長繁殖的因素眾多，作用效果不太穩定。所以，篩選更多的高效、穩定、適應性強的促生菌株，對於研製生產安全、高效的生物肥料具有廣泛的應用價值，是國內外同行的重要研究目標。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一株撕裂蠟孔菌hg2011新種的新用途，開拓其新的應用範圍。

一株撕裂蠟孔菌在促進作物生長方面的應用，其特徵在於，所述撕裂蠟孔菌保藏號為cgmccno.13899，分類命名為ceriporialaceratehg2011；具有c.laceratehg201118srdna序列表中的核苷酸序列；具有分泌iaa、鐵載體、溶磷和解鉀的特性。

所述撕裂蠟孔菌在促進作物生長方面的應用，用於生產發酵液和固體菌劑，促進烤菸生長，提高辣椒和茄子的產量品質。

本發明提供的菌株c.laceratehg2011，已於2017年6月2日保藏在位於北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc)，保藏號為cgmccno.13899，分類命名為撕裂蠟孔菌c.laceratehg2011。其核苷酸序列與本發明同日申請專利相同，名稱為「一株撕裂蠟孔菌及其在防治作物真菌病害中的應用」。

本發明具有如下有益效果：

1、本發明c.laceratehg2011能分泌iaa和鐵載體，溶解難溶性無機磷和含鉀礦物。

2、本發明c.laceratehg2011能定植於作物根際，具有顯著的促生作用。促進烤菸、辣椒和茄子生長，並提高辣椒和茄子產量和改善品質。

3、本發明c.laceratehg2011製備的發酵液和固體菌劑的工藝簡單，原料廣，成本低，應用範圍廣，能生產安全、高效的生物肥料。

附圖說明

圖1為本發明撕裂蠟孔菌hg2011溶磷平板檢測圖；

圖2為本發明撕裂蠟孔菌hg2011解鉀平板檢測圖；

圖3為本發明撕裂蠟孔菌hg2011的解鉀液體培養圖；

圖4為本發明撕裂蠟孔菌hg2011產鐵載體檢測圖。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本發明作進一步詳細說明。

培養基及其製備

pda固體培養基(液體培養基去除瓊脂)：200g馬鈴薯、20g葡萄糖、20g瓊脂、1l去離子水，ph6.50、121℃、1.5大氣壓、30min滅菌冷卻後倒平板(固體培養基)或取20ml於150ml三角瓶中(液體培養基)備用。

bonnet液體培養基：0.6gkh2po4、0.7gkno3、0.25gmgso4·7h2o、0.12gk2hpo4·3h2o、0.3gca(no3)2、1g天冬醯胺、10g葡萄糖、1.5mgmnso4·h2o、4mgznso4·7h2o、0.1mgna2moo4·2h2o、1mgh3bo3、1mg泛酸鈣、8mgfena-edta、1mg吡哆醇、1mg煙酸、20μgcuso4·5h2o、10μgcocl2·6h2o、20μgki，水1000ml，ph調至6.0。配製於發酵罐，121℃、1.5大氣壓、30min滅菌冷卻備用。

pikovskaya固體培養基(液體培養基去除瓊脂)：10g葡萄糖、5gca3(po4)2、0.5g(nh4)2so4、0.2gnacl、0.1gmgso4·7h2o、0.2gkcl、0.5g酵母粉、0.002gmnso4、0.002gfeso4·7h2o、1l去離子水，ph7.0、121℃、1.5大氣壓、30min滅菌冷卻後倒平板(固體培養基)或取20ml於150ml三角瓶中(液體培養基)備用。

cas培養基：每100ml含1ml20％蔗糖溶液、3ml10％酸水解酪素、100μl1mmol/lcacl2、2ml1mmol/lmgso4、1.8g瓊脂。滅菌(121℃、1.5大氣壓、30min)後冷卻至約60℃時緩慢加入0.1mol/l抽濾滅菌的磷酸鹽緩衝液(2.427gna2hpo4·12h2o、0.5905gnah2po4·2h2o、1000ml去離子水)和cas染液【60.5mg鉻天青s、10mlfe3+溶液(1mmol/lfecl3·6h2o，10mmol/lhcl)，72.9mg十六氨基烷基溴化銨(htdma)，去離子水定容至100ml】各5ml，混合均勻，倒平板備用。

矽酸鹽固體培養基(液體培養基去除瓊脂)：0.3g(nh4)2so4、0.2gnahso4，0.05gmgso4·7h2o，0.01gfeso4·7h2o，3g蔗糖、0.5g鉀長石粉、1000ml超純水。121℃、1.5大氣壓、30min滅菌冷卻後倒平板(固體培養基)或取20ml於150ml三角瓶中(液體培養基)備用。

實施例1：促生特性測定

1、產iaa測定

將c.laceratehg2011接種於pda固體培養基上，25℃培養5d，沿菌落邊緣，取直徑為6mm菌塊，按每100mlpda液體培養基接種10個菌塊的接種量，分別接種於不加和加色氨酸的pda液體培養基中(色氨酸濃度為1g/l)，25℃、150rpm搖床培養5d，取培養液10ml，10000r/min離心，用salkowski比色法測定上清液中的iaa濃度。測定結果表明，不加和加色氨酸時菌株均能分泌iaa，在上清液中iaa的含量分別為4.03μg/ml和19.33μg/ml。

2、溶磷能力測定

將c.laceratehg2011接種於pda固體培養基上，25℃培養5d，沿菌落邊緣，取直徑為6mm菌塊，接種於pikovskaya’s固體培養基上，25℃恆溫培養5d，觀察溶磷圈有無並拍照。圖1為本發明c.laceratehg2011溶磷平板檢測圖，菌落周圍出現明顯水解圈。同時，將菌株接種於含pikovskaya’s液體培養基的錐形瓶中，在25℃、150r/min搖床中培養5d，取培養液10ml，10000r/min離心10min，取上清液，用釩鉬黃比色法測定濾液中的磷含量為608.8μg/ml，對照(不接菌)含磷量4.58μg/ml，說明c.laceratehg2011具有解磷能力。

3、解鉀能力測定

將c.laceratehg2011接種於pda固體培養基上，25℃暗培養5d，沿菌落邊緣，取直徑為6mm菌塊，接種於矽酸鹽培養基上，25℃恆溫培養5d，觀察有無透明水解圈以判定其是否具有解鉀能力。圖2為本發明c.laceratehg2011解鉀平板檢測圖，在矽酸鹽培養基上，c.laceratehg2011菌落周圍出現明顯的水解圈。同時，將菌株接種於矽酸鹽液體培養基中，25℃、150r/min搖床培養5d，發現c.laceratehg2011菌絲能將液體培養基中的鉀長石包裹並分解，使溶液澄澈(如圖3所示)。同時，取濾液10ml，6000r/min離心10min，用火焰光度計法測上清液中的可溶性鉀，其含量為13.14μg/ml，對照(不接菌)4.58μg/ml，說明c.laceratehg2011具有解鉀能力。

4、產鐵載體能力測定

將c.laceratehg2011接種於pda固體培養基上，25℃暗培養5d，沿菌落邊緣，取直徑為6mm菌塊，接種於cas培養基上，培養72h。由圖4可見，c.laceratehg2011菌落周圍出現無色水解圈及藍色暈圈，說明菌株c.laceratehg2011具有產鐵載體的能力。

5.促進烤菸生長，提高菸葉產量

將c.laceratehg2011接種於pda固體培養基上，25℃暗培養5d，沿菌落邊緣，取直徑為6mm菌塊，接種於發酵罐中的bonnet液體培養基，製備出c.laceratehg2011發酵液【接種量：10個菌塊/l；發酵溫度：(27±1)℃；攪拌速率：150r/min；通氣量：10ml/(l·min)；發酵時間：120h】。

2015年4月20日至8月20日，在四川省涼山州某地烤菸移栽成活後第7天和第30天，每株澆灌100mlc.laceratehg2011發酵液，烤菸植株生物量比單施化肥增加18.03％，菸葉增產12.35％。

6、促進辣椒生長、提高產量和改善品質實例

取蛭石(2～3mm)、穀殼、玉米粉(磨細過100目篩)和自來水(質量比＝12：25：3：60)混勻，裝入5l食用菌栽培袋，滅菌(121℃、1.5大氣壓、30min)冷卻，加c.laceratehg2011發酵液(蛭石、穀殼、玉米粉和自來水混合物：發酵液＝100：10，質量比)，混勻封口，25℃暗培養30d製備出c.laceratehg2011固體菌劑。

2016年3月20日至6月20日，在重慶市某地辣椒移栽時，將50gc.laceratehg2011固體菌劑基施於辣椒苗根系周圍，辣椒植株生物量比單施化肥增加21.01％，增產15.23％，果實維生素提高46.87％。辣椒收穫後，在根系周圍仍有c.laceratehg2011菌絲存在。

7、促進茄子生長、提高產量和改善品質實例

2016年3月10日至7月28日，在重慶市某地茄子移栽時，將50gc.laceratehg2011固體菌劑基施於茄子苗根系周圍，茄子植株生物量比單施化肥增加27.37％，產量提高17.23％，果實維生素c提高87.96％。茄子收穫後，在根系周圍仍可發現c.laceratehg2011菌絲。

最後需要說明的是，以上實施例僅用於說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，但本領域的技術人員應當理解，對本發明所述菌株在促進作物生長，提高產量和改善品質方面進行作物種類替換，由本菌株生產出的微生物菌劑或生物肥料，以及在該菌株基礎上進行的任何擴展或修改等，應視為不脫離本發明技術方案的宗旨和範圍，均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。