一種同時檢測醋醅中四種功能微生物的多重pcr技術的製作方法
2024-04-08 15:03:05
專利名稱：一種同時檢測醋醅中四種功能微生物的多重pcr技術的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域，具體涉及一種用於檢測醋醅微生物群落中功能微生物的多重PCR技術。
背景技術：
我國食醋的生產歷史悠久，但眾多的食醋生產廠家的發酵過程都以傳統的經驗為主，工藝可控性較差，並且產品品質存在批次差異，尤其是風味差異較大。這主要是由於釀造過程中微生物複雜多樣，對醋醅發酵過程中的微生物作用機制不清楚。中國食醋的釀造工藝是多菌種混合發酵工藝，通過多種微生物的代謝作用產生風味飽滿、酸味柔和的食醋。食醋的生產中有兩個主要的發酵階段酒精發酵和醋酸發酵。在酒精發酵階段，澱粉質原料如糯米、高粱等經過黴菌和酵母菌的一系列代謝，最終生成酒精；而在醋酸發酵階段是包括醋酸菌、乳酸菌以及芽孢桿菌在內的眾多細菌起主要的作用，該階段是決定食醋風味和品質的關鍵步驟。前期研究結果表明醋酸菌、乳酸菌以及芽孢桿菌是醋酸發酵過程的功能微生物，並且其豐度之和在整個細菌群落中佔到90%以上，但是對於功能微生物在發酵過程中的動態變化情況還不清楚，快速闡明發酵過程中醋酸菌、乳酸菌以及芽孢桿菌等功能微生物的動態變化對於控制食醋發酵過程以及提高產品的風味具有重要的生產意義。有鑑於此，探索和引入新的技術方法和手段以全面地了解傳統釀造系統中的微生物種類，進而闡明釀造過程中微生物的作用機制，已成為重新認識和改造傳統產業的迫切需求。多重PCR (multiplex PCR)又稱多重引物PCR或複合PCR，是PCR技術的一種，是指在同一反應體系中加入兩對或兩對以上引物，同時擴增多個目的基因或DNA序列。多重PCR可以擴增一個物種的一個 片段也可以同時擴增多個物種的不同片段。
發明內容
本發明的目的在於解決上述現有食醋固態釀造分析技術的不足，提供了一種多重PCR技術用於同時檢測食醋釀造過程中多種功能微生物，該方法簡便高效，在同一 PCR條件下能對多種微生物進行同時檢測。本發明的目的通過以下方案實現1、醋醅微生物群落中功能微生物的確定利用分子生態技術一DGGE解析醋醅中微生物群落的結構，並結合與食醋自身品質相關的理化參數確定食醋釀造過程中的功能微生物為一種醋酸菌，一種芽孢桿菌和兩種乳酸菌。2、醋醅群落中功能微生物的純培養採用微生物純培養技術從醋醅中獲得釀醋功能性微生物菌株。3、多重PCR技術的建立針對醋醅群落中的4種功能性微生物設計特異性引物，以純菌基因組DNA為模板，對四重PCR的反應體系和反應程序進行優化，最終實現在同一 PCR條件下對醋醅微生物群落中的4種功能微生物同時進行檢測。該方法簡便、經濟、高效，在同一 PCR反應管內能對多種微生物同時檢測，是研究複雜微生物群落有效的技術手段之一。具體實施路線如下1、醋醅微生物群落總基因組DNA的提取稱正常發酵過程的醋醅2-5g，採用液氮研磨、溶菌酶和蛋白酶酶解、氯仿-異戊醇抽提、乙醇洗滌、RNaseA消化等步驟提取總基因組DNA。2、合成細菌16S rDNA V3區引物Pl，P2，並以醋醅群落微生物總DNA為模板進行PCR擴增，得到細菌16S rDNA V3區的擴增片段，所述的引物P1、P2的序列為P1 :5』 -ATTACC GCG GCT GCT GG-3， ；P2 :5， -[CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGGGGG G]CC TAC GGG AGG CAG CAG-3』。3、利用變性凝膠梯度電泳(DGGE)對細菌16S rDNA V3區擴增片段進行分析，其電泳條件為8%聚丙烯醯胺凝膠，30% 50%變性梯度(100%變性劑濃度為7M尿素，40%甲醯胺)，上樣量為200 ng，緩衝液為lxTAE，60°C，200V電壓電泳3. 5-4 h, SYBRGreen I染色45min04、優勢微生物的序列測定選擇DGGE凝膠上10_20個最顯著的條帶，割膠回收進行序列分析，在NCBI中進行BLAST比對，初步確定優勢微生物的種屬。5、功能微生物的篩選以醋醅為篩選對象，採用3種不同的培養基(肉湯，GYC,MRS)對不同功能微生物進行分離，選擇生長較快、菌落形態不同、且GYC平板上有透明圈的60-80個菌落，純化後保存。所述的培養基組成為
肉湯培養基(g/100 mL):葡萄糖2. 5，蛋白腖1，牛肉膏1，酵母粉O. 5，氯化鈉O. 3，瓊脂
2.0，pH 7. 0-7. 2用前加入5 mL無水乙醇；
MRS培養基(g/100 m L):胰蛋白腖1，牛肉膏1，酵母粉0.5，磷酸氫二鉀O. 2，乙酸鈉
O.5，檸檬酸三銨O. 2，葡萄糖2，七水硫酸鎂O. 058，一水硫酸錳O. 019，吐溫80 O.1mL,pH 6. 2-6. 5，固體培養基加入瓊脂1. 5-2. 0，用前加入5 mL無水乙醇；
GYC培養基(g/100 mL):葡萄糖1，無水乙醇3，酵母粉1，碳酸鈣1.5。6、功能微生物的確定對上述獲得的純培養微生物進行酶切酶切分型，將分型結果不同的菌株進行16S rDNA測序，測序結果與DGGE獲得的優勢微生物進行比較，選擇4株優勢微生物用於多重PCR技術。7、針對上述4株功能微生物菌株設計特異性引物，其中功能微生物菌株包括一株芽孢桿菌、一株醋酸菌和兩株乳酸菌，所述的功能微生物的特異性引物序列為下表所示。
權利要求
1.一種用於醋醅中四種功能微生物檢測的多重PCR技術，其特徵在於多重PCR技術按照以下步驟進行(O醋醅微生物群落總基因組DNA的提取稱正常發酵過程的醋醅2-5g，採用液氮研磨、溶菌酶和蛋白酶酶解、氯仿-異戊醇抽提、乙醇洗滌、RNaseA消化步驟等提取總基因組 DNA ；(2)合成細菌16SrDNA V3區引物Pl，P2，並以醋醅群落微生物總DNA為模板進行PCR 擴增，得到細菌16S rDNA V3區的擴增片段；(3)利用變性凝膠梯度電泳(DGGE)對細菌16SrDNA V3區擴增片段進行分析，其電泳條件為8%聚丙烯醯胺凝膠，100%變性劑濃度為7M尿素、40%甲醯胺，採用30°/Γ50%變性梯度，上樣量為200 ng，緩衝液為1XTAE，60°C，200V電壓電泳3. 5-4 h，SYBRGreen I染色， 每15 min染色一次,共染3次；(4)優勢微生物的序列測定選擇DGGE凝膠上10-20個最顯著的條帶，割膠回收進行序列分析，在NCBI中進行BLAST比對，初步確定優勢微生物的種屬；(5)功能微生物的篩選以正常發酵的醋醅為篩選對象，採用肉湯、GYC、MRS3種不同的培養基對不同功能微生物進行分離，選擇生長較快、菌落形態不同、且GYC平板上有透明圈的60-80個菌落，純化後保存；(6)功能微生物的確定對上述獲得的純培養微生物進行酶切分型，將分型結果不同的菌株進行16S rDNA測序，測序結果與DGGE獲得的優勢微生物進行比較，選擇4株優勢微生物用於多重PCR技術；(7)針對上述4株功能微生物菌株設計特異性引物，其中功能微生物菌株包括一株芽孢桿菌、一株醋酸菌和兩株乳酸菌；(8)對4株功能微生物的多重PCR條件進行組合優化包括反應體系的確定，反應條件的優化，最終使得4種微生物在同一 PCR條件下同時被檢測出來；(9)利用上述確定的多重PCR條件，對發酵過程中醋醅樣品中的功能微生物進行快速檢測。
2.根據權利要求1中所述的一種用於醋醅微生物群落中功能微生物檢測的多重PCR技術，其特徵在於，所述步驟(2)中的引物序列如下所示Pl :5，-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3』P2 :5，-[CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G]CC TAC GGG AGG CAG CAG-3，。
3.根據權利要求1中所述的一種用於醋醅微生物群落中功能微生物檢測的多重PCR技術，其特徵在於，所述步驟(5)中培養基如下所述肉湯培養基(g/100 mL)葡萄糖2. 5，蛋白腖1，牛肉膏1，酵母粉O. 5，氯化鈉O. 3，瓊脂2. O,pH 7. 0-7. 2，用前加 Λ 5 mL無水乙醇；MRS 培養基(g/100 mL)胰蛋白腖1，牛肉膏1，酵母粉0.5，磷酸氫二鉀O. 2，乙酸鈉O. 5，檸檬酸三銨0.2， 葡萄糖2，七水硫酸鎂O. 058，一水硫酸錳O. 019，吐溫80 O. lmL，瓊脂1. 5-2. 0，pH,6.2-6. 5，用前加入5 mL無水乙醇；GYC 培養基(g/1OO mL) 葡萄糖1，無水こ醇3，酵母粉1，碳酸鈣1. 5，瓊脂1. 5-2. O。
4.根據權利要求1中所述的ー種用於醋醅微生物群落中功能微生物檢測的多重PCR技術，其特徵在於，步驟(7)中所述的特異性引物，其序列是如下表所示。
5.根據權利要求1中所述的ー種用於醋醅微生物群落中功能微生物檢測的多重PCR技術，其特徵在於，步驟(8)中所述的多重PCR的最優反應體系釆用50 u L體系，具體如下IXEx PCR buffer (含 dNTP) 10 u L ；Mg2+ (25 mM)4 虯；Ex Taq 酶(5 U/u L) 0.5 虯；正向引物 2 UL;反向引物 2 u L template DNAlO ng;ddH20 至 50 U し
6.根據權利要求1中所述的ー種用於醋醅微生物群落中功能微生物檢測的多重PCR技術，其特徵在於，步驟(8)中所述的多重PCR的最優反應條件如下預變性94°C 5 min ;變性94°C 30s，退火64-51°C 45s，延伸72°C lmin，共26個循環，其中退火溫度每個循環降低·0.50C ;變性 94°C 30s，退火 51°C 45s，延伸 72°C lmin，共 15 個循環；終延伸 72°C IOmin0
全文摘要
本發明公開了一種用於檢測醋醅中四種功能微生物的多重PCR技術，屬於生物工程技術領域。該方法簡便、經濟、高效，在同一PCR反應管內能對多種微生物同時檢測，是研究複雜微生物群落有效的技術手段之一。
文檔編號C12Q1/04GK103045725SQ20121042571
公開日2013年4月17日 申請日期2012年10月31日 優先權日2012年10月31日
發明者許正宏, 史勁松, 陸震鳴, 陶京蘭, 錢建瑛 申請人:江南大學