假單胞菌429產酯酶水解蜂蠟製備芸苔素內酯的方法
2024-04-09 02:34:05 1
專利名稱：假單胞菌429產酯酶水解蜂蠟製備芸苔素內酯的方法
技術領域：
本發明與製備芸苔素內酯的方法有關，特別與假單胞菌429產酯酶水解蜂蠟製備芸苔素內酯的方法有關。
背景技術：
芸苔素內酯是由植物內合成的一類內源性植物生長調節劑，對多種農作物生長代謝具有調節作用。目前，國內外生產芸苔素方法主要是化學合成法和天然資源提取法。
1、化學合成法(如國內雲大120；美國、日本)生產工藝時間長，反應物不易提純，對環境有汙染，並且生產成本高等不足。這是由於芸苔素內酯是一個含有多種具有生理活性化合物的體系，而其中4個活性最高，都呈立體結構，而任何一種化學合成法，就是合成與其中的一種立體結構完全相同的組分也無法辦到，更不要說4個分完成相同。因此，芸苔素內酯生產中不提倡化學合成法。
2、天然資源提取法提取法中常採用的是鹼皂法，但鹼水解蜂蠟時間長，一般在8-10；水解溫度高，95-100℃；水解率較低，70-75％；產品純度較低，90％；生產成本較高，蜂蠟水解成本1800元/噸。
發明內容
本發明的目的是為了克服以上不足，提供一種水解溫度低，水解時間少、能耗少，對設備腐蝕小，產品收率高，純度高，質量好，工藝操作易控制，對環境無汙染的假單胞菌429產酯酶水解蜂蠟製備芸苔素內酯的方法。
本發明這樣來實現的本發明假單胞菌429產酯酶水解蜂蠟製備芸苔素內酯的方法包括如下步驟1)，製取活性液體酯酶；按重量百分比配料油脂 0.6～0.8％ 氫氧化鈉 0.1～0.3％酵母膏0.4～0.6％ 磷酸二氫鉀0.1～0.3％消泡劑0.010～0.018％ 假單胞菌429餘量，
將油脂、氫氧化鈉、酵母膏、磷酸二氫鉀、假單胞菌429在溫度至少為28℃的條件下，按至少60r/min的速度攪拌後發酵至少22小時，使其pH為7.1～7.6，加入消泡劑，通氣便製得酯酶活力為900～1400U/L的發酵液，在發酵液中加入絮凝劑離心除去菌體，獲得粗酶液，濃縮粗酶液，製得4500～600U/L的活性液體酯酶；2)，製取蜂蠟的分散乳化液在蜂蠟中加入乳化劑，使其乳化，獲得蜂蠟的分散乳化液；3)，酯酶對蜂蠟中酯鍵的定向水解將活性液體酯酶加入到蜂蠟乳化液中，調pH7.1～7.3，攪拌，升溫到35～50℃，定向水解至少3小時，水解接近終點時加入適量萃取劑，使蜂蠟水解；4)，用樹脂將水解後的蜂蠟分離，便製得芸苔素內酯產品。
上述的1、1)步驟在製取活性液體酯酶時按重量百分比配料油脂0.7％氫氧化鈉0.2％ 酵母膏 0.5％磷酸二氫鉀 0.2％消泡劑 0.014％假單胞菌429餘量，在溫度為28℃條件下，按60r/min的速度攪拌發酵22小時，使其pH為7.5，選用中空纖維超過濾系統濃縮粗酶液，在1、3)步驟時將活性液體酯酶加入到蜂蠟乳化液中，調pH為7.2，升溫至40～45℃，定向水解3小時。
上述的1、2)步驟時，加入的乳化劑為非離子型乳化劑。
假單胞菌429(Pseudomons SP 429)產酯酶活性最高，專一水解蜂蠟的活性最強，500罐(裝200L較高酶發酵液)連續發酵觀察20個批次，發酵液中酯酶活力能保持在900～1400U/L這一水平。假單胞菌429產酯酶是一種胞外菌，在發酵液中加入絮凝劑再離心除去菌體，便獲粗酶液。選用DC-30型中空纖維柱超過濾系統濃縮粗酶液，在濾掉無機鹽及部分水分子物質的同時，可使粗酶液濃縮五倍左右，得到4500～600U/L的高活性液體酯酶。採用中空纖維超過濾濃縮技術解決了生物酶在工業化濃縮中易失活、回收率低的難題，該技術使液體酯酶的回收率比膜式長管蒸發器濃縮技術提高20個百分點。蜂蠟是由高級一元醇和高級酯肪酸形成的酯，油溶性極強而非水溶性，要實現假單胞菌429產生的酯酶，蜂蠟的乳化是關鍵。採用高活性乳化劑可使蜂蠟以直徑為0.5微米左右的微粒均勻分散在水中，獲得蜂蠟的高分散乳化劑。在酯酶對蜂蠟中酯鍵的定向水解中當水解接近終點時，加入適量的萃取劑(有機溶劑，如乙醇、甲醇、溶劑油等)，打破酯酶催化的平衡點，可使蜂酯水解率達90％以上，「酯法」水解比「皂化法」(舊工藝用NaOH)水解，水解率70～75％)溫度低、能耗少，對設備的腐蝕性小，水解率高(高15～20個百分點)。蜂蠟酶解液經萃取物濃縮後，經高效液相色譜檢測表明蜂蠟中除含有芸苔素外，還含有多種芸苔素類似物。這些類似物混雜在產品中，對農作物的生長效應沒有疊加作用。粗混合物活性很低，即使加大施用濃度也不會提高生物活性，而分離純化的芸苔素內酯在極低濃度下也表現出極高生物活性，因此，芸苔素內酯的分離純化及純度是保障芸苔素內酯產品質量的又一關鍵問題。本發明採用強吸附型樹脂柱分離純化技術取代二次矽膠柱分離純化，獲得99％的高純度芸苔內酯產品。
本發明製取芸苔素內酯的方法比皂化法水解溫度低，能耗少，水解時間短，對設備腐蝕小，產品收率高，純度高，質量好，工藝操作易控制，對環境無汙染、生產成本也顯著降低(噸蜂蠟水解成本由原來1800元降到1300元，降低20％，每噸蜂蠟製品的產值提高2.64萬元，經濟效益增加20％以上，特別是酶解法提取芸苔素內酯後的「蠟渣」，有利於後續加工，生產三十烷醇、二十八烷醇及低烷醇等化工原料及醫藥中間體產品，提高原料的綜合利用。採用本方法製備的天然芸苔素內酯產品經測試和在二十多個省市不同的農作應用試驗表明產品具有多種獨特的調節植物生長的生理活性功能，生物活性強，便用量低，增產效效明顯，改善作物品質，無毒副作用，安全性高。本發明方法生產的產品是目前國內唯一獲得的綠色生資認證的植物生長調節素。本發明方法對發展高效、優質、無公害農業和綠色食品工業具有重大意義，具有廣闊的發展和應用前景。
具體實施例方式本實施例方法步驟如下1)，製取活性液體酯酶；採用平板培養技術，從土壤中分離到3種產酯酶活性的菌株，選取高酯活性最高，專一水解蜂蠟的假單胞菌429。
按重量百分比配料油脂 0.7％氫氧化鈉 0.2％酵母膏0.5％磷酸二氫鉀0.2％消泡劑0.014％ 假單胞菌429 餘量，消泡劑採用甘油聚醚。
將油脂(可採用動物油脂也可採用植物油脂，如植物油、花生油)、氫氧化鈉、酵母膏、磷酸二氫鉀、假單胞菌429在溫度為28℃的條件下，按60r/min的速度攪拌後發酵22小時，使其pH為7.5，加入消泡劑，通氣便製得酯酶活力為900～1400U/L的發酵液，在發酵液中加入絮凝劑(可採用高分子化合物，如聚丙烯醯銨)離心除去菌體，獲得粗酶液，選用DC-30型中空纖維超過濾系統濃縮粗酶液，製得4500～600U/L的高活性液體酯酶；2)，製取蜂蠟的分散乳化液在蜂蠟中加入乳化劑平平加，使其乳化，獲得蜂蠟的分散乳化液；3)，酯酶對蜂蠟中酯鍵的定向水解將活性液體酯酶加入到蜂蠟乳化液中，調pH7.2，攪拌，升溫到40℃～45℃，定向水解3小時，水解接近終點時加入適量萃取劑(如乙醇)，使蜂蠟水解，4)，用CD-180樹脂將水解後的蜂蠟分離，使製得芸苔素內酯產品。
權利要求
1.假單胞菌429產酯酶水解蜂蠟製備芸苔素內酯的方法，其特徵在於包括如下步驟1)，製取活性液體酯酶；按重量百分比配料油 脂0.6～0.8％ 氫氧化鈉 0.1～0.3％酵母膏0.4～0.6％ 磷酸二氫鉀 0.1～0.3％消泡劑0.010～0.018％ 假單胞菌429餘量，將油脂、氫氧化鈉、酵母膏、磷酸二氫鉀、假單胞菌429在溫度至少為28℃的條件下，按至少60r/min的速度攪拌後發酵至少22小時，使其pH為7.1～7.6，加入消泡劑，通氣便製得酯酶活力為900～1400U/L的發酵液，在發酵液中加入絮凝劑離心除去菌體，獲得粗酶液，濃縮粗酶液，製得4500～600U/L的活性液體酯酶；2)，製取蜂蠟的分散乳化液在蜂蠟中加入乳化劑，使其乳化，獲得蜂蠟的分散乳化液；3)，酯酶對蜂蠟中酯鍵的定向水解將活性液體酯酶加入到蜂蠟乳化液中，調pH7.1～7.3，攪拌，升溫到35～50℃，定向水解至少3小時，水解接近終點時加入適量萃取劑，使蜂蠟水解；4)，用樹脂將水解後的蜂蠟分離，便製得芸苔素內酯產品。
2.如權利要求1所述的假單胞菌429產酯酶水解蜂蠟製備芸苔素內酯的方法，其特徵在於1、1)步驟在製取活性液體酯酶時按重量百分比配料油 脂 0.7％氫氧化鈉0.2％ 酵母膏 0.5％磷酸二氫鉀 0.2％消泡劑 0.014％假單胞菌 429餘量，在溫度為28℃條件下，按60r/min的速度攪拌發酵22小時，使其pH為7.5，選用中空纖維超過濾系統濃縮粗酶液；在1、3)步驟時將活性液體酯酶加入到蜂蠟乳化液中，調pH為7.2，升溫至40～45℃，定向水解3小時。
3.如權利要求1或2所述的假單胞菌429酯酶水解蜂蠟製備芸苔素內酯的方法，其特徵在於1、2)步驟時，加入的乳化劑為非離子型乳化劑。
全文摘要
本發明提供了一種假單胞菌429產酯酶水解蜂蠟製備芸苔素內酯的方法。該方法是用假單胞菌429產酯酶定向水解蜂蠟的分散乳化液，用樹脂將水解後的蜂蠟分離，從而製得芸苔素內酯。水解溫度低，水解時間少、能耗少，對設備腐蝕小，產品收率高，純度高，質量好，工藝操作易控制，對環境無汙染。
文檔編號C12P19/44GK1560269SQ20041002195
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月2日 優先權日2004年3月2日
發明者何其明, 楊錫良 申請人:何其明