用於在動物乳腺內表達sod的重組dna的構建方法
2024-01-21 12:24:15
專利名稱：用於在動物乳腺內表達sod的重組dna的構建方法
技術領域：
本發明涉及一種用分子生物學技術構建重組DNA以在動物乳汁中獲得SOD的方法。
SOD又稱過氧化物歧化酶，是體內唯一的一種具有降解自由基作用的酶。
SOD目前被廣泛用於抗衰老，抗癌，消炎，調節免疫等，如在老年性痴呆，老年性白內障，高血壓，冠心病，動脈硬化，類風溼性關節炎，紅斑狼瘡，多種腫瘤等中都有一定預防和治療作用，並有很好的養顏、護膚、抗衰老功效。目前SOD產品主要來源於生物體細胞，從豬、牛等動物的紅細胞、心、腦等組織細胞中提取，或者利用基因克隆技術在培養細胞內表達，然後再從上清中提取，以上技術都具有工藝複雜、成本高及產量低等不足之處。
本方法的目的在於克服上述現有技術之不足，提供一種有助於快速、簡單、有效地從動物乳汁中上獲得SOD的方法。
為了實現本發明之目的，首先按本發明所述的用於在動物乳腺內表達SOD的重組DNA的構建方法，利用分子生物學的技術獲得包含有動物乳蛋白基因啟動子和/或增強子的DNA片段與SOD DNA的完整或不完整片段，通過兩者的直接或間接相連，經過一些必要的修飾後裝入適當的DNA載體，構成一個或數個重組DNA，將重組DNA適當處理並與一些化學物質混合後注入動物的乳腺導管內，通過乳腺導管進入乳腺分泌細胞。或通過其它建立生物反應器的方法導入動物生殖細胞以建立乳腺定位表達生物反應器，在乳腺分泌細胞分泌乳汁的同時，也較大量地分泌SOD，因此可在動物的乳汁中獲得SOD。
具體點說是首先通過分子生物學的方法獲得動物或植物的SOD DNA完整或不完整片段和包含有動物乳蛋白基因的啟動子和/或增強子的DNA片段，將SOD DNA完整或不完整片段連接在包含有動物乳蛋白基因啟動子和/或增強子的DNA片段的下遊，再做些必要的DNA修飾後，裝入適當的載體上，構成重組DNA。或者將包含有動物乳蛋白基因的啟動子和/或增強子的DNA片段與T7RNA聚合酶DNA相連，T7啟動子與SOD DNA完整或不完整片段相連，將以上兩個連接片段做些必要的DNA修飾，裝入適當的一個載體或一個以上的載體上，構成重組DNA。再通過常規的分子克隆的方法，大量擴增並純化此重組DNA，將此重組DNA做(或者不做)一定的酶切處理，與某些化學物質(如脂質體等)混合後，藉助注射器等一類器具吸取此混合物，通過動物乳頭管注入乳腺導管內，使此重組DNA沿乳腺管進入乳腺分泌細胞，當動物泌乳時用常規方法擠出乳汁，在乳汁中即可獲得較大量的SOD。或將重組DNA通過其它建立生物反應器的方法導入動物生殖細胞以建立乳腺定位表達的生物反應器。
實施例1取全長1Kb的人MnSODcDNA與含有啟動子的、長約800bp的牛β-caseincDNA連接，裝入pCDA3載體建成重組DNA，經克隆篩選、擴增、提取及純化後，與脂質體相互作用，用生理鹽水配製成濃度為0.1mg/ml的液體，取200ml，注入空奶期的乳牛乳腺導管內，經適當擠壓後，液體將通過乳腺導管進入乳腺分泌細胞，當乳牛產後泌乳，即可在乳汁中獲得較大量的SOD。
實施例2將含有啟動子的、長約800bp的牛β-casein cDNA與T7RNA聚合酶DNA連接，另將T7啟動子與全長1Kb的人MnSOD cDNA相連，經過必要的DNA修飾後分別裝入兩個pCDNA3的載體，經克隆篩選、擴增、提取及純化後，與脂質體相互作用，用生理鹽水配製成濃度為0.1mg/ml的液體，取200ml，注入空奶期的乳牛乳腺導管內，經適當擠壓後，液體將通過乳腺導管進入乳腺分泌細胞，當動物進入泌乳期，含有啟動子的、長約800bp的牛β-casein cDNA將誘導T7RNA聚合酶的合成，後者將通過作用於T7啟動子誘導SOD的合成，因此可從乳汁中獲得活性SOD。
使用本方法所述的用於在動物乳腺內表達SOD的重組DNA的構建方法，並配合乳腺導管內注射或其它的建立生物反應器的方法，克服了以往生產SOD所存在的的設備條件要求高、技術難度大、成本高、產量低等缺點，使SOD的生產在純天然狀態下進行，大批量生產，成本較低，因此具有一定的經濟開發價值。
權利要求
1.一種用分子生物學技術構建重組DNA以在動物乳汁中獲得SOD的方法，其特徵是將包含有動物乳蛋白基因啟動子和/或增強子的DNA片段與SOD DNA的完整或不完整片段直接或間接相連，經過一些必要的修飾後裝入適當的DNA載體，構成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導管內注射或其它建立生物反應器的方法，在乳汁中獲得活性SOD。
2.根據權利要求1所述的一種用分子生物學技術構建重組DNA以在動物乳汁中獲得SOD的方法，其特徵是將包含有動物乳蛋白基因啟動子和/或增強子的DNA片段與SODDNA的完整或不完整片段直接相連，經過一些必要的修飾後裝入適當的DNA載體，構成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導管內注射或其它建立生物反應器的方法，在乳汁中獲得活性SOD。
3.根據權利要求1所述的一種用分子生物學技術構建重組DNA以在動物乳汁中獲得SOD的方法，其特徵是將包含有動物乳蛋白基因啟動子和/或增強子的DNA片段與SODDNA的完整或不完整片段通過T7RNA聚合酶與T7啟動子偶連繫統間接相連，經過一些必要的修飾後裝入適當的DNA載體，構成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導管內注射或其它建立生物反應器的方法，在乳汁中獲得活性SOD。
4.根據權利要求1或2或3所述的用分子生物學技術構建重組DNA以在動物乳汁中獲得SOD的方法，其特徵是將包含有牛β-casein DNA啟動子和/或增強子的DNA片段與SOD DNA的完整或不完整片段間接或直接相連，經過一些必要的修飾後裝入適當的DNA載體，構成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導管內注射或其它建立生物反應器的方法，在乳汁中獲得活性SOD。
5.根據權利要求1或2或3所述的用分子生物學技術構建重組DNA以在動物乳汁中獲得SOD的方法，其特徵是將包含有牛α-S1-casein DNA啟動子和/或增強子的DNA片段與SODDNA的完整或不完整片段間接或直接相連，經過一些必要的修飾後裝入適當的DNA載體，構成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導管內注射或其它建立生物反應器的方法，在乳汁中獲得活性SOD。
6.根據權利要求1或2或3所述的用分子生物學技術構建重組DNA以在動物乳汁中獲得SOD的方法，其特徵是將包含有牛lactoglobulin DNA啟動子和/或增強子的DNA片段與SODDNA的完整或不完整片段間接或直接相連，經過一些必要的修飾後裝入適當的DNA載體，構成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導管內注射或其它建立生物反應器的方法，在乳汁中獲得活性SOD。
全文摘要
本發明涉及一種用分子生物學技術在乳汁中獲得SOD的方法,克服了用現有技術提取或人工生產SOD之技術難度大、成本高、產量低等不足,將包含有動物乳蛋白基因啟動子和/或增強子的DNA片段與SOD DNA的完整或不完整片段直接或通過T7RNA聚合酶與T7啟動子偶連繫統等方法間接相連,經過一些必要的修飾後裝入適當的DNA載體,構成重組DNA,經過克隆篩選、擴增、純化之後,與脂質體等物質混合,然後直接注入動物的乳腺導管內,讓重組DNA進入乳腺分泌細胞,或用常規的建立生物反應器的方法建立乳腺定位表達生物反應器,在分泌細胞分泌乳汁時,重組DNA得以表達,用常規的方法擠得乳汁,可從乳汁中獲重組DNA的表達產物一SOD,本方法具有方法簡單、成本低、SOD活性高、產量高等優點。
文檔編號C12N9/02GK1247898SQ98113340
公開日2000年3月22日 申請日期1998年9月14日 優先權日1998年9月14日
發明者黃偉民 申請人:黃偉民