一種植物抗鹽蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2024-01-21 10:31:15 2

專利名稱：一種植物抗鹽蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域中一個植物抗鹽相關蛋白及其編碼基因與應用，特別涉 及利用該基因增強植物抗鹽性的方法。
背景技術：
糧食問題是當今世界所面臨的極大難題之一。通過提高單產或擴大種植面積、增 加農業投入改造中低產田等途徑來增加糧食產量都會碰到需要克服逆境限制或減輕逆境 危害的問題。因此，認識植物對逆境的反應機制，提高植物的抗逆性，已成為農業生產和食 品安全進一步研究的重點，倍受世界各國政治界和學術界的關注，也是當前生命科學研究 白勺^^ ； ^^ ο土壤鹽鹼化是影響限制作物生長的兩個重要逆境因子，也是農作物減產的重要影 響因素，因此尋找新的抗鹽功能基因並闡明其功能具有重要的理論及實踐意義。除了傳統 的育種方法外，利用基因工程技術來提高作物抗鹽能力具有重要的理論和經濟意義。擬南芥是一種模式植物，廣泛用於植物遺傳學、發育生物學和分子生物學等研究 領域。擬南芥的大多數基因在其它植物中都能找到，有關擬南芥的任何發現都能應用於 其它植物研究。因此，對擬南芥抗鹽分子生物學機制的研究對特定區域提高作物的產量 具有重要的理論與經濟意義。擬南芥基因組已完全測序，根據擬南芥測序資料庫(靈 arabidopsis.org)尋找和發現新的具有自主智慧財產權的功能基因是國際植物學研究領域 的熱點之一，也是不同國家之間科技競爭的焦點。擬南芥共有約1.3億個鹼基對，2. 9萬個 基因。目前大部分基因的功能還不清楚，利用突變技術研究基因功能已成為一種有效的方 法。通過對突變體的研究，發現了一些抗鹽基因的功能，如S0S1、S0S2、S0S3、NHXU HKTl寸。根據擬南芥資料庫公布的基因組序列，發現鹽處理HIS1-3基因敲除植株表現為 耐受，這表明該表明HIS1-3基因涉及抗鹽性的調控。為此，我們研究了該基因功能，並發現 該基因具有調控植物耐鹽的作用。

發明內容
本發明的目的是發現了一種新的植物抗鹽相關蛋白及其編碼基因。本發明所提供 的植物耐鹽及降低植物鹽吸收相關蛋白的編碼基因，名為HIS1-3(AT2G18050)，來源於哥倫 比亞野生型的擬南芥，其蛋白是具有下述胺基酸殘基序列的蛋白質序列表中的SEQ ID No :2，序列表中的序列2由167個胺基酸殘基組成。HIS1-3的cDNA基因，選自下述核甘酸序列之一；(1)序列表中 SEQ ID No 1 的 DNA 序列；(2)編碼序列表中SEQ ID No 2蛋白質序列的多核苷酸；(3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列雜交的核甘酸序 列；
(4)與序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列具有90%以上同源性、且編碼相同 功能蛋白質的DNA序列。序列表中的序列1由763個鹼基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5』端第46位 至549位鹼基，編碼序列SEQ ID No :2的蛋白質。含有本發明HIS1-3的表達載體，細胞系和宿主菌均屬於本發明的保護範圍。擴增 HIS1-3中任一片段的引物對也屬於本發明的保護範圍。本發明的第二個目的是提供一種利用該基因增強植物抗鹽性的方法。本發明所提供的增強植物抗鹽性的方法，是抑制植物中的上述植物抗鹽性相關蛋 白編碼基因的表達。抑制植物中的上述植物抗鹽性相關蛋白編碼基因HIS1-3的表達可通過多種方法 實現，如植物病毒載體介導基因沉默的方法，反義核酸技術沉默基因的方法，siRNA介導的 基因沉默方法等。本發明抑制基因表達的方法並不限於上述幾種方法，只要能抑制HIS1-3 表達均可。利用任何一種植物基因敲除技術，將此基因敲除(或沉默)後，植物表現為抗鹽。本發明的HIS1-3基因或其反義核酸在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始 核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導型啟動子。為了便於對轉基因植物細胞或植物 進行鑑定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(GUS基因、螢光 素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素，卡那黴素等)。被轉化的植物宿主既 可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如水稻、小麥、油菜、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草 坪草或苜宿等。攜帶有本發明HIS1-3基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物 病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或 組織，並將轉化的植物經組織培育成植株。本發明的植物抗鹽相關蛋白及其編碼基可為農作物抗鹽育種提供基因與技術的 支持。下面結合實施例對本發明的技術方案作進一步的說明。


圖1-A-1-D為hisl-3、野生型植株豎立培養，直接點種於含有或不含有鹽(NaCl) 的培養基上在正常光照條件下豎直培養20天的比較照片，I-EU-F為統計的量化指標 (I-AMS ； I-B 50mM NaCl ； I-C 75mM NaCl ； I-D IOOmM NaCl ； 1-E 根長；I-F 鮮重)。圖2-A-2-D為his 1-3、野生型植株在IOOmM NaCl條件處理一周，在正常培養條件 下回復一周後表型對比照片0-A、2-B處理前野生型和hisl-3植株；2-C、2-D回復後野生 型和hisl-3植株)。圖3-A-3-D為hisl_3、野生型植株在用75mM NaCl處理後，植株內鈉、鉀含量以及 鈉鉀比的比較(3-A地下部分鈉含量的比較；3-B地上部分鈉含量的比較；3-C地下部分鉀 含量的比較；3-D地上部分鉀含量的比較；3-E地下部分鈉-鉀比的比較)。圖4為hisl-3、野生型植株鹽脅迫條件下相關基因的表達水平。具體實施例方式下述實施例中的實驗方法如無特別說明，均為常規方法。實施例1、HIS1-3及其編碼基因的獲得以野生型哥倫比亞生態型擬南芥的幼苗約50_100mg為材料，用Trizol提取其總 RNA，用紫外分光光度計檢測 RNA 濃度。按 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas公司)試劑盒說明書，以提取的總RNA為模板，合成cDNA第一條鏈。以提 取出來的第一條鏈cDNA為模板，進行如下PCR反應20μ 1反應體系，內含IOXPCR緩衝 液 2μ 1，dNTPs (IOmM)混合物 0. 4 μ 1，引物 1 禾口弓|物 2 各 2μ 1，Tag 酶(5U/μ 1) 0. 2 μ 1， 其餘加雙蒸水至 20 μ 1。其中，引物 1 5，-ACCACCACTCATCCTCCATACTTT-3 『；引物 2 5' -TCTCGCCTTCTTCACTTTCCTCT-3『。在 Life Express 基因擴增儀上擴增先 94°C預變性 3min，再 94°C 30sec,54°C 30sec,72°C 60sec，共計 30 個循環，最後 72°C延伸 lOmin，將獲得 的PCR產物在1 % (m/v)瓊脂糖凝膠進行電泳。將PCR得到的cDNA片段連接於pGEM_T載 體，得到含有目的片段的載體PT-HIS1-3，進行測序鑑定，結果表明PCR得到的cDNA片段具 有序列表中序列SEQ ID No 1的DNA序列，為HIS1-3的cDNA基因，由763個鹼基組成，其 編碼序列為自5』端第46位鹼基到第549位鹼基，編碼具有序列表中序列SEQ ID No 2的 胺基酸殘基序列的蛋白質。實施例2、培育抗鹽性增強的擬南芥1、HIS1-3基因被敲除的純合突變體hisl-3的獲得
從美國擬南芥種質資源中心獲得了 T-DNA插入突變體種子(SAIL_799_A07 ； http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject ？ type = germplasm&id = 1006546836)。為鑑定HIS1-3基因被敲除的純合突變體，播種SAIL_799_A07種子並提取單 株植株DNA，以此為模板，用3對引物對其進行PCR擴增。其中，引物ILBl :5』 -GCCTTTTCAG AAATGGATAAATAGCCTTGCTTCC-3，引物 2 :HIS 1-3-LP 5，-GACCGAAAGGAGGAGCTAATG-3，，引物 3 :HISl-3-RP 5，-AAGATGATAACGAGGCAGCAG-3，。根據PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果，獲 得HIS1-3基因被敲除的純合突變體hisl-3。從表型來看，該突變體與野生型(WT)植株在 正常生長條件下沒有顯著差異(圖1-A)，用該基因的cDNA序列構建35S強動子的過表達載 體並轉化突變體，該轉基因植株形態上恢復了野生型表型，在鹽脅迫條件下也恢復了野生 型植株症狀，證實了該基因確實控制抗鹽性狀。2、hisl-3與野生型植株的抗鹽性比較將野生型(WT)與hisl-3同時播種於直徑為90mm的培養皿中，培養基分別為加鈉 和不加鈉的固體培養基，豎立培養或者水平培養置於22°C恆溫光照(光周期為16小時光 照，8小時黑暗)培養。培養20天後，可以觀察到在正常培養基上生長的WT和hisl-3在 表型、鮮重、根長方面均無顯著差異。在植株直接點種或者移栽後在含有鈉的培養基上培 養，hisl-3都表現出明顯的鹽耐受的性狀。在75mM，IOOmM NaCl脅迫下，hisl-3的鮮重和 根長明顯比WT高。上述結果表明，hisl-3較WT對鹽脅迫明顯耐受。3、hisl-3與野生型植株的鈉積累比較對鹽處理的WT和hisl-3植株體內的鈉-鉀含量進行測定，發現hisl-3植株體 內鈉積累明顯低於WT，而鉀含量無顯著差異；同時野生型的Na+/K+明顯高於hisl-3，表明 hisl-3植株較WT不易積累Na+，對Na+有一定的耐受性。
4、鹽處理條件下hisl-3與野生型植株相關基因表達比較對鹽處理的WT和hisl-3植株體內的相關基因表達水平進行檢測，發現hisl-3植 株體內SOS家族基因及NHXl基因明顯高於WT，而HKTl基因表達沒有明顯差異，表明hisl-3 植株對鹽離子響應可能與SOS家族基因的激活有關。
權利要求
1.編碼有序列表SEQID No :1DNA序列或SEQ ID No :2的胺基酸序列的植物蛋白在調 控植物耐鹽性的應用。
2.一種增強植物抗鹽性的調控方法其特徵在於通過抑制植物體內編碼有序列表 SEQID No 1的DNA序列或SEQ ID No 2的胺基酸序列的植物蛋白編碼基因的表達。
3.根據權利要求2所述的一種增強植物抗鹽性的調控方法，其特徵在於抑制所述植 物蛋白編碼基因表達的方法包括植物病毒載體介導基因沉默的方法，或者反義核酸技術沉 默基因的方法，或者siRNA介導的基因沉默方法。
全文摘要
本發明公開了一種編碼有序列表SEQ ID No1 DNA序列或SEQ ID No2的胺基酸序列的植物蛋白在調控植物耐鹽性的應用。本發明利用該抗鹽蛋白的編碼基因增強植物抗鹽性，如抑制植物中上述植物耐鹽性相關蛋白的編碼基因的表達，為耐鹽性農作物育種提供基因與技術支持。
文檔編號C07K14/415GK102051364SQ201010583400
公開日2011年5月11日 申請日期2010年12月10日 優先權日2010年12月10日
發明者呂申超, 曹樹青, 江力, 袁懷波 申請人:合肥工業大學