新城疫病毒高黏膜免疫水平弱毒疫苗株ndv/lx及反向遺傳構建系統的製作方法

2024-02-26 21:36:15 1

專利名稱：新城疫病毒高黏膜免疫水平弱毒疫苗株ndv/lx及反向遺傳構建系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學技術和免疫學技術，篩選一株能同時在消化道和呼吸道產生高水平黏膜免疫的基因I型新城疫病毒弱毒株NDV/LX，用於製造疫苗。
背景技術：
新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)是嚴重危害世界養禽業的重要傳染性病原體之一，可以感染多種禽類，常導致養禽業產生巨大的經濟損失 [Alexander, D. J. 2001.GordonMemorial Lecture.Newcastle disease. Br Poult Sci 42:5-22.]。該病毒屬於副粘病毒科、副粘病毒亞科、禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)的成員[Mayo, M.A. 2002. Virus taxonomy-Houston 2002. Arch Virol 147:1071—1076·]。 新城疫病毒有囊膜，基因組為單股、負鏈、不分節段的RNA病毒，基因組結構模式為 3' -NP-P-M-F-HN-L-5'，依次編碼6種結構蛋白核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質蛋白 (M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)即核蛋白(NP)，P，M， F, HN和L蛋白。根據對雞的毒力，NDV毒株可以為強毒(Velogenic)、中等毒力(mesogenic) 和弱毒(Lentogen)。已開展廣泛的試驗來闡明病毒致病性的分子決定因素[Huang Ζ, KrishnamurthyS，Panda A,Samal SK. Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis andfunctions as an alpha interferon antagonist. Journal of virology 2003 Aug ；77 (16) :8676-85.]。大部分研究是關於F和HN蛋白對致病性的作用，研究結果一致認為F蛋白裂解位點處的胺基酸序列是病毒毒力的主要決定因素[Seal BS. Nucleotide and predicted amino acid sequence analysisof the fusion protein and hemagglutinin-neuraminidase protein genes among Newcastle diseasevirus isolates. Phylogenetic relationships among the Paramyxovirinae based on attachmentglycoprotein sequences. Funct Integr Genomics 20040ct ；4 (4) :246-57.]。 NDV毒力差異的分子基礎主要決定於FO蛋白的蛋白酶裂解位點的胺基酸序列，強毒的裂解位點有聚鹼性胺基酸序列，其模式基序為112GR/K-R-Q-K/R-R-F117 ；弱毒的裂解位點則缺少聚鹼性胺基酸序列，其模式基序為112-E/G-R/K-Q-E/G-R-L117。自1擬6年發現新城疫(ND)以來，ND已發生了四次大的流行，而且每一次流行都有不同基因型的毒株出現，尤其是90年代之後出現了新的基因VII型NDV，給我國的養禽業造成了巨大的經濟損失。在控制疫病的過程中，使用疫苗是最有效最經濟的方法，新城疫的疫苗已使用了幾十年，由於ND疫苗的廣泛使用，此病已基本上得到了較好的控制，但是臨床上非典型ND的發生十分普遍，ND仍然成為威脅養禽業的主要疾病之一，也就是說，常規的疫苗對於NDV強毒的攻擊並不能提供理想的保護。從近十年來的ND流行特點來看，臨床上所分離到的NDV毒株大多數屬於基因VII型[Liu, X. F.，H. Q. Wan，Χ. X. Ni，Y. Τ. Wu, and W. B. Liu. Pathotypical and genotypical characterization of strain of Newcastledisease isolatedfrom outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001. ArchivesofVirology, 2003,148 (7) : 1387-1403.]，而常規的 ND 疫苗株的基因型主要為I和II型(如V4、La Sota等)，因此，在遺傳距離上當前NDV分離株與常規ND疫苗株相差較遠。在我國，ND已成為地方流行性疾病，很難撲滅和根除，對商業雞群進行疫苗免疫是防控新城疫最重要的措施之一。ND疫苗有活疫苗和滅活疫苗之分，活疫苗使用方便，價格便宜，並能產生堅強的免疫力。ND活疫苗不僅能刺激產生體液免疫和細胞免疫，而且能誘導產生呼吸道和消化道黏膜免疫[Senne, D. A.，D. J. King, and D. R. Kapczynski. 2004. Control ofNewcastle disease by vaccination. Dev Biol (Basel) 119 :165-170.]。因為呼吸道和消化道黏膜是NDV感染宿主的門戶，所以堅強的黏膜免疫在免疫保護中起著十分重要的作用[Erf, G. F. 2004. Cell-mediated immunity in poultry. Poultry science 83 :580-590.]。大多數商業化NDV弱毒疫苗都能誘導產生針對NDV的特異抗體，但是血清中產生的NDV特異抗體並不足以保護動物抵抗NDV強毒的侵襲感染[Reynolds，D. L.， and A. D. Maraqa. 2000. Protective immunityagainst Newcastle disease the role of antibodies specific to Newcastle disease virus polypeptides. Avian Dis 44: 138-144.])。研究表明以呼吸道和腸道分泌性IgA抗體為代表的黏膜免疫在保護免疫雞群抵抗 ND 的感染中起到重要作用[Barbour，Ε. K.，Μ. Kallas，and Μ. Τ. Farran. 2001. Immune response to Newcastle disease virus in broilers :a useful model for the assessment ofdetoxification of ervil seeds. Rev Sci Tech 20 :785-790.]。黏膜中分泌性IgA抗體的產生與疫苗株病毒在黏膜上皮細胞中的複製密切相關。但是不同的疫苗病毒在腸道和呼吸道中刺激黏膜產生免疫應答的能力有很大的差異。例如常用的疫苗株La Sota是嗜呼吸道型病毒能刺激產生較高水平的呼吸道黏膜免疫，但刺激產生腸道黏膜免疫的能力很差。相反常用疫苗株QV4是嗜腸道病毒，具有較強誘導黏膜免疫的能力，但是誘導呼吸道黏膜免疫的能力差[Brown，C. C.，D. J. King, and B. S. Seal. 1999. Comparison of pathology-based techniques for detection ofviscerotropic velogenic Newcastle disease virus in chickens. J Comp Pathol 120:383-389·]。而從美國火雞腸道中分離的VG/GA毒株，能在呼吸道和消化道中很好的複製，同時誘導產生堅強的呼吸道和消化道黏膜免疫應答，因此它具有比單誘導腸道黏膜免疫的疫苗株QV4和單誘導呼吸道黏膜免疫的疫苗株 La Sota 更大的優越性[Perozo，F.，P. Villegas, R. Dolz, C. L. Afonso, and L.B.Purvis. 2008. The VG/GA strain of Newcastle disease virus :mucosal immunity, protection against lethal challenge and molecular analysis. Avian Pathol 37 237-245.]。NDV/LX株是我們從健康雞群中分離到的一株NDV弱毒。初步研究表明，NDV/LX具有良好的免疫原性，能在呼吸道和消化道很好的複製，誘導產生高滴度的特異抗體和黏膜免疫應答。NDV/LX病毒的ICPI值為0. 12，MDT為1 IOh,按照OIE標準測得HA效價10. 51og2。 攻毒用毒株為基因VII型強毒分離株JS-5-05-GO分離自發病鴨群，其F和HN基因序列號分別為EU044798、EU044816，其ICPI和MDT分別是1. 91和46小時，HA效價平均為81og
發明內容
本發明的第一個目的在於發明一種新城疫病毒高黏膜免疫水平弱毒疫苗株NDV/ LX及反向遺傳構建系統，從而解決當前所用疫苗株不能同時在消化道和呼吸道產生黏膜免疫的問題。本發明基因I型弱毒疫苗株NDV/LX，於2010年5月19日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC NO :3843.本發明中NDV/LX株是我們從健康家禽群中分離到一批NDV弱毒。將這些毒株分別以IO6EID50免疫SPF雞，在免疫後1、4、7、11、15、21天，每組撲殺3隻雞，獲取雞氣管和小腸衝洗物以及膽汁。試驗的對照組分別為常用疫苗株La Sota、QV4免疫組和PBS免疫空白對照組。經過黏膜抗體水平比較，獲得具有良好的免疫原性的NDV/LX株，能在呼吸道和消化道很好的複製，誘導產生高滴度的特異抗體和黏膜免疫應答。本發明的第二個目的在於測定基因I型弱毒疫苗株NDV/LX全基因組序列，其全基因組序列如SEQ ID NO. 37所示。NDV/LX毒株既能在腸道上皮細胞又能在呼吸道上皮細胞中複製的原因仍然是未知的。據報導L蛋白、F蛋白或HN蛋白等結構蛋白的變化是組織嗜性和毒力的主要決定因素。HN和F蛋白可能決定病毒的獨特吸附和融合，這將使嗜腸道的病毒能優先進入小腸細胞；而L蛋白的變異將允許嗜腸道毒株在小腸高水平複製，卻抑制呼吸道型毒株在小腸的複製。對該毒株進行全基因組測序和反向遺傳構建，分析該毒株既能在腸道上皮細胞又能在呼吸道上皮細胞中複製的分子機制，通過反向遺傳構建全長克隆使對其基因組修飾成為可能。本發明的第三個目的在於構建基因I型弱毒疫苗株NDV/LX的全長克隆。本發明的構建方法如下1)基因I型新城疫病毒株NDV/LX株的篩選，對從健康家禽腸道分離到一批新城疫病毒弱毒株進行生物學特性和免疫原性分析，測定血清中抗新城疫病毒的效價以及消化道和呼吸道黏膜免疫水平。2) NDV/LX株基因組序列測定，新城疫病毒NDV/LX株由揚州大學農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室構建、保存。設計7對引物擴增基因組序列，引物如下
權利要求
1.一種新城疫病毒弱毒疫苗株NDV/LX，它的保藏號為CGMCC NO :3843。
2.權利要求所述新城疫病毒弱毒疫苗株NDV/LX的全基因組序列，如SEQID NO. 37所
全文摘要
本發明涉及分子生物學技術和免疫學技術，公開了一株新城疫病毒弱毒株NDV/LX及它的全基因組序列。所述新城疫病毒弱毒疫苗株NDV/LX的保藏號為CGMCC NO3843；全基因組序列如SEQIDNO.37所示。研究表明，NDV/LX具有良好的免疫原性，能在呼吸道和消化道很好的複製，誘導產生高滴度的特異抗體和黏膜免疫應答。以常用疫苗株LaSota和QV4為對照，系統研究了NDV/LX株感染SPF雞後在呼吸道和腸道的分布、全身體液免疫和局部黏膜免疫以及免疫雞對流行強毒的保護效力。
文檔編號C12N15/45GK102559607SQ20121000068
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月4日 優先權日2012年1月4日
發明者劉慧謀, 劉文博, 劉曉文, 劉秀梵, 王曉泉, 胡順林 申請人:揚州大學