一種鹼性木聚糖酶突變體及其應用的製作方法

2024-01-27 14:18:15 1

一種鹼性木聚糖酶突變體及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明的目的是提供一種鹼性木聚糖酶突變體及其應用，通過對來源於芽孢桿菌的木聚糖酶進行蛋白質工程改造，獲得了突變體蛋白，其耐熱性、最適反應pH得到顯著提高，有利於其在造紙領域的廣泛應用。本發明的木聚糖酶突變體，其胺基酸序列為SEQ ID NO：3。本發明提供的木聚糖酶突變體XynT6最適pH值為9.0，在pH7.0-10.0範圍內能保持75％以上的酶活，且突變體在鹼性條件下的酶活性水平明顯高於野生型；木聚糖酶突變體XynT6的最適作用溫度為60℃，且在65℃條件下仍能保持80％左右的酶活，比野生型具有更強的耐熱性。本發明提供的木聚糖酶突變體XynT6，能有效提高紙漿的白度，有利於造紙企業改進紙漿漂白工藝，減少化學漂白劑的使用，減輕環境汙染，應用前景廣闊。
【專利說明】一種鹼性木聚糖酶突變體及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於功能基因改造【技術領域】，具體涉及一種鹼性木聚糖酶突變體及其應 用。 技術背景
[0002] 木聚糖酶（Xylanase)是指能專一降解半纖維素木聚糖為低聚木糖和木糖的一組 酶的總稱。它在飼料、烘焙、啤酒、造紙、紡織、醫藥及能源等領域得到了日益廣泛的應用。特 別在紙漿漂白工藝中，木聚糖酶的應用能夠降低含氯化合物的用量，促使紙漿中殘餘木質 素的降解和溶解性木質素的抽除，不但可以提高紙漿的白度和白度穩定性，改善纖維的濾 水性和造紙性能，而且可以降低後續工藝化學物質的用量，減少富含氯化物的工業廢水的 排放，對有效降低環境汙染，解決嚴重困擾造紙業的汙染問題具有極大的現實意義。
[0003] 目前，以無元素氯和全無氯漂白工藝為代表的紙漿漂白已經成為世界各國造紙業 紙漿漂白髮展的必然趨勢，木聚糖酶酶法助漂新工藝已在歐洲和北美的30餘家大型紙廠 得到應用，丹麥諾維信公司等多家酶製劑廠商，紛紛推出了專門用於紙漿漂白的木聚糖酶 和纖維素酶新產品。但目前為止，工業上用的木聚糖酶主要來自細菌和真菌，報導較多及產 酶活力較高的微生物主要是黑麴黴、木黴和青黴等真菌，它們所產的酶大多為中性偏酸的 木聚糖酶，最適反應溫度大多在50°C以下。而在造紙工業中，紙漿蒸煮和漂白工藝基本都是 在高溫和強鹼的條件下進行，使得現有的酸性或中性木聚糖酶產品受到了極大的限制。因 此，研究開發具有優良特性的鹼性木聚糖酶具有重大經濟效益和社會效益，具有更廣的應 用前景。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種鹼性木聚糖酶突變體及其應用。本發明通過對來源於芽 孢桿菌（Bacillus Sp.)的木聚糖酶進行蛋白質工程改造，獲得了突變體蛋白，其耐熱性、最 適反應pH得到顯著提高，有利於其在造紙領域的廣泛應用。
[0005] 申請人:對芽孢桿菌木聚糖酶進行突變，經過大量的篩選，發現Q65R、F80Y、E82T、 K162H、A218S、L332H這六個突變位點能引起木聚糖酶耐熱性、最適反應pH的改變，從而促 成本發明。
[0006] 本發明一方面提供了一種木聚糖酶突變體，是胺基酸序列為SEQ ID N0 :1的木聚 糖酶的第65位胺基酸由Gin變為Arg，第80位胺基酸由Phe變為Tyr，第82位胺基酸由 Glu變為Thr，第162位胺基酸由Lys變為His，第218位胺基酸由Ala變為Ser，第332位 胺基酸由Leu變為His。
[0007] 上述木聚糖酶突變體的胺基酸序列為SEQ ID NO :3,其一種編碼基因的核酸序列 為 SEQ ID N0 :4。
[0008] 本發明另一方面提供了攜帶有編碼序列為SEQ ID NO :4的木聚糖酶突變體基因的 質粒。
[0009] 將上述質粒轉入畢赤酵母中進行重組表達，獲得的木聚糖酶突變體耐熱性、最適 反應pH得到很大提高。
[0010] 本發明提供的木聚糖酶突變體XynT6最適pH值為9. 0,在PH7. 0-10. 0範圍內能保 持75%以上的酶活，且突變體在鹼性條件下的酶活性水平明顯高於野生型；木聚糖酶突變 體XynT6的最適作用溫度為60°C，且在65°C條件下仍能保持80%左右的酶活，比野生型具 有更強的耐熱性。本發明提供的木聚糖酶突變體XynT6,能有效提高紙漿的白度，有利於造 紙企業改進紙漿漂白工藝，減少化學漂白劑的使用，減輕環境汙染，應用前景廣闊。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖 1 為 SDS-PAGE 電泳圖；
[0012] 其中：M為蛋白分子量Marker，泳道1為轉空載體對照菌，泳道2為畢赤酵母XynT6 發酵粗酶液；
[0013] 圖2為木聚糖酶突變體XynT6的發酵曲線；
[0014] 圖3為木聚糖酶突變體XynT6與野生型XynAl的最適作用pH比較圖；
[0015] 圖4為木聚糖酶突變體XynT6與野生型XynAl的最適作用溫度比較圖。

【具體實施方式】
[0016] 本發明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法，例如 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook,2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻 提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，本領域的技術人員可以在本發明所記載 的技術方案的基礎上，採用本領域其它常規的方法、實驗方案和試劑，而不限於本發明具體 實施例的限定。
[0017] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細描述。
[0018] 實施例1木聚糖酶基因的擴增
[0019] 根據公共基因資料庫中的基因序列，優化了合成基因的密碼子並人工合成鹼性木 聚糖酶基因XynAl (序列為SEQ ID N0 :2)，其編碼的胺基酸序列為SEQ ID N0 :1。
[0020] 採用PCR反應克隆鹼性木聚糖酶基因XYNA1片段，引物和反應條件如下：
[0021] 引物 1(F) :GCGCGAAITCGCTATTACTTCTAACGAGAT
[0022] 引物 2 (R) : TAAAGCGGCCGCTTATCTAAITTCCAAGTAAT
[0023] 反應條件為：94°C變性30s，56°C復性30s，72°C延伸lmin，30個循環後，72°C保溫 10min。瓊脂糖電泳結果顯示，XynAl基因為大小984bp的片段。
[0024] 實施例2木聚糖酶突變體的構建及篩選
[0025] 為了提高來源於芽孢桿菌的木聚糖酶XynAl的耐熱性及最適反應pH,通過定向進 化技術對該酶進行了大量突變的篩選。
[0026] 以XynAl基因為模板，以引物1、2用GeneMorph II隨機突變PCR試劑盒 (Stratagene)進行PCR擴增，膠回收PCR產物，EcoRI、Notl進行酶切處理後與經同樣酶切 後的pET21a載體連接，轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，塗布於LB+Amp平板，37°C倒置培養， 待轉化子出現後，用牙籤逐個挑至96孔板，每個孔中加入150ul含有0. ImM IPTG的LB+Amp 培養基，37°C 220rpm培養6h左右，離心棄上清，菌體用pH 8. 0的緩衝液重懸，反覆凍融破 壁，獲得含有木聚糖酶的大腸桿菌細胞裂解液。
[0027] 分別取出30 ill裂解液至兩塊新的96孔板，其中一塊於60°C處理lOmin後，稀 釋到pH 9. 0的緩衝液中，另一塊不處理稀釋到pH 8. 0的緩衝液中，分別加入相同pH值的 30 yl底物，於37°C反應30min後，DNS法測定生成的還原糖，不同的突變子經過高溫處理後 保持的活性不同，在不同pH值下保持的活性不同。結果發現有些突變對木聚糖酶的活性沒 有影響，有些突變甚至使其活性降低了，對依然保持高活性的突變子進行DNA測序，最終， 申請人:獲得了能提高木聚糖酶耐熱性、最適反應pH的突變組合Q65R、F80Y、E82T、K162H、 A218S、L332H。
[0028] 含Q65R、F80Y、E82T、K162H、A218S和L332H六點突變的木聚糖酶突變體，其氨基 酸序列為SEQ ID NO :3,其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :4。
[0029] 將木聚糖酶突變體基因命名為XynT6,用引物1、2進行PCR擴增，引物兩端引入 EcoR I、Not I位點。PCR反應條件為：94°C變性5min ;然後94°C變性30s，56°C復性30s， 72°C延伸lmin，30個循環後，72°C保溫10min。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，XynT6基因為大 小984bp的片段。
[0030] 實施例3畢赤酵母工程菌株的構建
[0031] 將上述克隆得到的木聚糖酶突變體基因XynT6片段，通過EcoR I和Not I位點與 表達載體PPIC9K相連接，構建表達載體pPIC9K-XynT6。
[0032] 將表達質粒pPIC9K_XynT6用Sal I進行線性化，表達質粒線性化片段通過電穿孔 法轉化畢赤酵母GS115,在MD平板上篩選得到畢赤酵母重組菌株GS115/pPIC9K-XynT6,然 後在含不同濃度遺傳黴素的YH)平板上篩選多拷貝的轉化子。
[0033] 將一個轉化子命名為畢赤酵母XynT6(Pichia pastoris XynT6)，轉接於BMGY培 養基中，30°C、250rpm振蕩培養Id ;再轉入BMM培養基中，30°C、250rpm振蕩培養；每天添加 0. 5%的甲醇，誘導表達4d ;離心去除菌體，得到含木聚糖酶XynT6的發酵上清液；將其進行 SDS-PAGE電泳檢測分析，結果如圖1所示：發酵上清液中重組木聚糖酶突變體XynT6的分 子量大小約為36kDa，與預期一致。
[0034] 通過上述同樣的酶切連接方法將野生型木聚糖酶基因XynAl克隆到畢赤酵母 GS115宿主中，構建得到重組表達野生型木聚糖酶的畢赤酵母工程菌，命名為畢赤酵母 XynAl (Pichia pastoris XynAl)。搖瓶水平發酵畢赤酵母 XynAl, 30°C、250rpm 振蕩培養； 每天添加0. 5%的甲醇，誘導表達4d ;離心去除菌體，得到含重組野生型木聚糖酶XynAl的 發酵上清液。
[0035] (1)木聚糖酶活單位的定義
[0036] 在50°C、pH值為8. 0的條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的木聚糖溶液中釋放 1 y mol還原糖所需要的酶量即為一個酶活力單位U。
[0037] (2)酶活測定方法
[0038] 取2ml濃度為1 %的木聚糖底物（pH8. 0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液配製），加入 到比色管中，50°C平衡10min，再加入2ml經pH8. 0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液適當稀釋並 經50°C平衡好的鹼性木聚糖酶酶液，混勻於50°C精確保溫反應30min。反應結束後，加入 5ml DNS試劑，混勻以終止反應。然後沸水浴煮沸5min，用自來水冷卻至室溫，加水定容至 25ml，混勻後，以標準空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光值Ae。
[0039] 酶活計算公式：

【權利要求】
1. 一種木聚糖酶突變體，其特徵在於，所述的突變體是胺基酸序列為SEQ ID NO :1的 木聚糖酶的第65位胺基酸由Gin變為Arg，第80位胺基酸由Phe變為Tyr，第82位胺基酸 由Glu變為Thr，第162位胺基酸由Lys變為His，第218位胺基酸由Ala變為Ser，第332 位胺基酸由Leu變為His。
2. 如權利要求1所述的木聚糖酶突變體，其特徵在於，所述的突變體的胺基酸序列為 SEQ ID NO :3。
3. -種基因，其特徵在於，所述的基因編碼權利要求1所述的木聚糖酶突變體。
4. 如權利要求3所述的基因，其特徵在於，所述基因的核酸序列為SEQ ID NO :4。
5. -種重組質粒，其特徵在於，所述的重組質粒攜帶有權利要求3所述的基因。
6. 權利要求1所述的木聚糖酶突變體在造紙領域中的應用。
7. 如權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述的應用是用於提高紙漿的白度。
【文檔編號】C12N15/81GK104450650SQ201410720240
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月1日 優先權日:2014年12月1日
【發明者】徐曉東, 李冬冬, 肖志壯, 王海 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司, 濰坊康地恩生物科技有限公司