包含肽的抗癌劑的製作方法

2023-06-11 02:16:56

專利名稱：：包含肽的抗癌劑的製作方法包含肽的抗癌劑
背景技術：
：本發明涉及免疫調節肽。在吞噬細胞例如嗜中性粒細胞和單核細胞中表達的曱醯肽受體家族(曱醯肽受體(FPR)和甲醯肽受體樣1(FPRL1))在宿主對抗病原體感染中起到重要的作用(1,2)。已知這些受體與百日咳毒素敏感的Gi蛋白偶聯(l,2)。FPR的激活誘導GPY亞MGoti亞基上解離，而該PY-亞基介導磷脂酶CP或磷^醇3-激酶的激活(1，2)。這些效應分子的激活誘導複雜的下遊信號傳導，從而導致趨化移動、脫顆粒和超氧化物產生等多種細胞反應。大多數完全激動劑誘導多種複雜的細胞信號傳導，這些信號傳導最終引起複雜的免疫反應。在這些免疫反應中，有很多是宿主細胞正確行使清除侵入病原體的功能所必需的，而某些反應則AiL^^應中不需要的副作用。在藥物開發領域，降低和消除候選藥物的副作用已經成為一個熱門話題。為了達到這個目標，多個研究組已經在試圖通過多種方法對特定受體開發選擇性的免^^應調節劑或選擇性的拮抗劑(3，4)。已經從內源性的物質或人工合成的物質中鑑定了多種FPR的激動劑(1，2)。所述激動劑包括細菌肽(N-曱醯-曱硫氨醯-亮氨醯-苯丙氨酸(fMLF))、HIV-^M結構域(T20和T21)以及源自宿主的激動劑鵬聯蛋白I和A&42)(5-7)。之前，本發明人已經報導過一種刺激單核細胞和嗜中性粒細胞等白細胞的合成肽配體Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(在下文中稱為"WKYMVm")(8-11)。Le等人證明了WKYMVm可結合甲醯肽受體(FPR)和曱醯肽受體樣l(FPRLl)(12)。由於WKYMVm是對絕大部分的受體有高親和力的短肽，它可以作為一種有用的物質用於研究FPR-或FPRLl-介導的信號傳導。然而，為特定受體開發選擇性的免疫調節劑或選擇性的拮抗劑的研究以及篩選分子多樣性的研究僅涉及小的化合物並且迄今為止十分有限，因此一直有鑑定新的化合物的需求。
發明內容本發明的一個實施方案提供了一種抗癌劑，所述抗癌劑包含g,列選自於SEQIDNO:4、SEQIDNO:11及其組合的肽。所述抗癌劑用於抑制起源於結腸、胰、乳房、肺、腦、前列腺、鱗狀細胞、淋巴樣細胞或白細胞的癌。本發明的另一個實施方案提供一種在需要它的患者中抑制癌細胞增殖或者增加癌細胞凋亡的方法，包含將有效量的選自於SEQIDNO:4、SEQIDNO:11及其組合的M酸序列或其類似物給予需要它的患者，以在所述患者中抑制癌細胞增殖或者增加癌細胞的凋亡。將有效量的選自於SEQIDNO:4、SEQIDNO:11及其組合的^Jj^列或其類似物給予所述需要它的患者。所述增殖被抑制或者凋亡增加的癌細胞為結腸癌細胞。所述增殖糹皮抑制或者凋亡增加的癌細胞選自於起源於胰、乳房、肺、腦、前列腺、鱗狀細胞、淋巴樣細胞或白細胞的癌細胞。本發明的另一個實施方案提供一種用於抑制癌細胞增殖或者增加癌細胞凋亡的藥物組合物，包含選自於SEQIDNO:4、SEQIDNO:11及其組合的M酸序列或其類似物，以及可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。通過以下的敘述並結合附圖本發明的其他特徵和優點將是顯而易見的，其中同樣的附圖標記在其整個附圖中指的是相同或相似的部分。被引入說明書並且作為說明書組成部分的附圖闡明了本發明的實施方案，並且與說明書一起用於解釋本發明的原理。圖1A和IB分別顯示WK麗m、本發明的肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK麗m(SEQIDNO:11)、WK麗E(SEQIDNO:16)、WK麗R(SEQIDNO:18))或fMLF對表達FPR的RBL-2H3細胞(圖1A)或表達FPRL1的RBL-2H3細胞(圖1B)中的[Ca2+]i的影響;圖2A和2B分別顯示WK麗m、本發明的肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK麗m(SEQIDNO:11)、WK麗E(SEQIDNO:16)、WK麗R(SEQIDNO:18))和fMLF置換1251標記的WK麗m與FPR或FPRL1結合；圖3A、3B和3C顯示WKYMVm、本發明的肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK麗m(SEQIDNO:11)、WKYMVE(SEQIDNO:16)、WKYMVR(SEQIDNO:18))、fMLF和wkymvm對表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞中的ERK磷酸化的影響；圖4A、4B和4C顯示WK麗m、本發明的肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)、WKYMVE(SEQIDNO:16)、WKYMVR(SEQIDNO:18))、fMLF和wkymvm對表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞中的Akt磷酸化的影響；圖5A和5B顯示WKYMVm通過升高胞內4丐刺激表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞的胞吐作用；圖6A和6B顯示WK麗m、本發明的肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)、WKYMVE(SEQIDNO:16)、WKYMVR(SEQIDNO:18))、fMLF和wkymvm對N-曱醯-甲硫氨醯-亮氨醯-苯丙氨酸(fMLF)對所述肽誘導的[Ca2+]i升高的胞吐作用的影響；圖7A和7B顯示WKYMVm通過PI3K和MEK活性刺激表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞的^^匕移動；圖8A和8B顯示WKYMVm、;^發明的肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)、WKYMVE(SEQIDNO:16)、WKYMVR(SEQIDNO:18))、fMLF和wkymvm對趨化性的影響；圖9A和9B顯示WRYMVm(SEQIDNO:4)和WKRMVm(SEQIDNO:11)減弱CT26注射小鼠的腫瘤生長；圖IOA和lOB顯示WRYMVm(SEQIDNO:4)減弱EL4注射小鼠的腫瘤生長；圖11A和11B顯示低劑量的WRYMVm(SEQIDNO:4)在CT26模型中是最有效的；和圖12A和12B顯示WRYMVm(SEQIDNO:4)與長#_新鹼的組合試驗增強了抗腫瘤作用。具體實施例方式曱醯肽受體(FPR)和甲醯肽樣1受體(FPRL1)在免M應中發揮重要功負fe。本發明提供了衍生自WKYMVm的肽。多種肽可以刺激FPR或FPRLl導致鈣的升高，但是本發明的肽例如WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK麗m(SEQIDNO:11)和第6位D-Met(6thD-Met)被取代的肽僅在表達FPRLl的細胞而不在表達FPR的細胞中引起4丐升高。使用125I-WOMVm的竟爭性測定顯示，不但多種肽可引起表達FPR的細胞中的鈣升高，而且WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)和第6位D-Met被取代的Jikii可以竟爭"51-WKYMVm與FPR的結合。不同於磷脂酶C介導的鈣升高，WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)和第6位D-Met被取代的肽可以刺激細胞外調節的蛋白激酶(ERK)和Akt在表達FPR的細胞中的激活。對於WKYMVm的功能性效果而言，該li^FPR細胞中通過Ca"和ERK途徑分別刺,顆粒和細胞的趨化性。然而，WKGMVm、WKRMVm和第6位D-Met被取代的肽等肽刺激FPR細胞僅誘導趨化移動而不誘導脫顆粒。綜上可知，本文首次證明了FPR作為一種重要的化學引誘物受體，可以被不同的肽g己體以Si體特異的方式差異性地調節。根據一個實施方案，本發明的舦包括選自於SEQIDN0:1至SEQIDNO:24的M酸序列或SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的^L衍生的物質。所述SEQIDNO:1至SEQIDNO:24如下Trp-Lys-Gly-Met-Val-D-Met-NH2(WKGMVm;SEQIDNO:1)，Trp"Lys-Tyr-Met-Gly-D-Met-NH2(WKYMGm;SEQIDNO:2》Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Gly-NH2(WKYMVG;SEQIDNO:3)，Trp-Arg-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(WRYMVm;SEQIDNO:4)，Trp-Glu-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(WEYMVm;SEQIDNO:5),Trp-His-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(WHYMVm;SEQIDNO:6〉,Trp-Asp-Tyr-Met-Va!-D-Met-NH2(WDYMVm;SEQIDNO:7)，Tn>Lys-His-Met-Val-D-Met-NH2(WKHMVm;SEQIDNO:8),Trp-Lys~Glu-Met-Val-D-(WKEMVm;SEQIDNO:9)，Trp-Lys-Trp-Met-Va-D-Met-NH2(WKWMVm;SEQIDNO:10)，Trp-Lys-ArgMet-\^l-D"Met-NH2(WKRMVm;SEQIDNO:")，Trp-Lys-Asp-Met-Val-D畫MeWMH2(WKDMVm;SEQIDNO:12)，Trp-Lys畫Phe-Met-Va卜D-Met-NH2(WKFMVm;SEQIDNO:13)，Trp-Lys-Tyr-Met-Tyr-D-Met-NH2(WKYMYm;SEQIDNO:14),Trp-Lys-Tyr-Met-(Phe/Trp)-D-Met-NH2(WKYM(F/W)m;SEQIDNO:15),Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Glu-NH2Tn>Lys-Tyr-Met-Val-Val-NH2Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Arg-NH2Trp-Lys-Tyr-Met-yal-Trp-NH2Trp-Lys-Tyr-Met-Va,2(WKYMV;SEQIDNO:20)，Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(KYMVm;SEQIDNO:21)，Lys-Tyr-Met-Val-NH2(KYMV;SEQIDNO:22)，Tyr-Met-Va!-D-Met-NH2(YMVm;SEQIDNO:23)，和Met-Val-D-Met-NH2(MVm;SEQIDNO:24)。SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽以分離的和基本純化的形式存在。所述肽包含的胺基酸殘基的一個羧基上可任選地帶有一個-冊2!^l代。本發明的肽具有至少一種以下的性質(a)通過人單核細胞或嗜中性粒細胞誘導超氧化物產生；(b)通itAJf周血單核細胞或嗜中'l^^立細胞誘導胞內鈣升高；(c)結合甲醯肽受體或甲醯肽受體樣1;(d)在體外誘導人單核細胞或嗜中性粒細胞的趨化移動；(e)誘導表達曱醯肽受體的細胞或表達甲醯肽受體樣1的細胞脫顆粒；(f)通過甲醯肽受體的激活或甲醯肽受體樣1的激活刺激胞外信號調節的蛋白激酶磷酸化；和(g)通過甲醯肽受體的激活或甲醯肽受體樣1的激活刺激Akt磷酸化。根據另一個實施方案，本發明提供一種藥物組合物，它包含M酸序列選自於SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽；或者由M酸序列選自於SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽衍生的物質。包含所述肽或所述物質作為活性成分的組合物可以包含多於一類的選自於鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、水、甘油和乙醇的藥物稀釋劑，但所述稀釋劑不限於這些。根據服藥目的和具體疾病可以以不同的方式給予所述組合物。應理解，實際給予的活性成分的量應該根據多種相關因素確定，包括需要治療的病症，患者症狀的嚴重程度，同時Jl用的其他藥物(例如化學治療劑)，所述(WKYMVE;SEQIDNO:16》，(WKYMW;SEQIDNO:17),(WKYMVR;SEQIDNO:18)，(WKYMVW;SEQIDNO:19)，患者個體的年齡、性別、體重，飲食，服藥時間，選擇的給藥途徑以及所述組合物的比例。所述組合物可以單個日劑量或者分為l-3次的日劑量給予，然而給藥的劑量和給藥途徑可才艮據疾病的類型和嚴重程度進行調節。包含本發明的肽或物質的組合物可以通過口月l或腸胃外途徑給藥。腸胃外服藥意思是通過口服之外的途徑給予藥物，包括直腸給藥、靜脈內給藥、J^M內給藥和肌內給藥、動脈內給藥、經皮給藥、鼻內給藥、pM、眼部給藥以及皮下給藥。可以將包含所述肽或物質的藥物製劑製備成口服劑型、注射液或局部用製劑等任何形式。所述製劑可以被優選製備成口服和注射給藥(真溶液、懸液或乳劑)的形式，並且最優選是口服形式例如片劑、膠嚢、軟膠嚢、液體藥劑、丸劑、顆粒劑等等。在製備所述製劑過程中，可以在無任何賦形劑的情況下將所述肽填充進軟膠嚢中，或者將所述肽與載體混合或用載體稀釋後形成適當的製劑。合適的載體的實例為澱粉、水、鹽水、#氏(Ringer's)溶液、葡萄糖等。WRYMVm(SEQIDNO:4)或WKRMVm(SEQIDNO:11)的泰^^序列的肽可以大大降低小鼠胂瘤模型(CT26、EL4)的腫瘤生長。另夕卜，低劑量的WRYMVm降低腫瘤的效果最好，而較高劑量卻沒有效果。當WRYMVm用於與抗癌藥物M新鹼組合治療癌症的時候，顯示了抑制腫瘤大小和提高存活率的協同效應。根據本發明的另一個實施方案，提供了一種與治療白細胞數量變化或激活狀態改變相伴隨或由其引起的病症的方法。所述方法包含給予需要這種治療的宿主有效治療量的#^酸序列選自於SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽，或者由M酸序列選自於SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽f斤生的物質。所述病症可以是細菌、支原體、酵母菌、真菌、病毒的感染或炎症。根據本發明的另一個實施方案，提供了一種增加白細胞數量或提高白細胞激活狀態的方法。所述方法包含給予需要更大量白細胞或更高白細胞激活狀態的宿主有效治療量的M酸序列選自於SEQIDN0:1至SEQIDNO:24的肽，或者由M酸序列選自於SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽f汙生的物質。根據本發明的另一個實施方案，提供了一種在需要這種治療的患者中誘導白細胞胞外釣升高的方法。所述方法包含給予所述患者lL^酸序列選自於SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽，所使用的量有效於治療性地或預防性地達到這種"i秀導效果或脫敏效果。根椐本發明的另一個實施方案，提供了一種在需要這種治療的患者中誘導人單核細胞或嗜中性粒細胞產生超氧化物的方法。所述方法包含給予所述患者^J^酸序列選自於SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽，或者由胺基酸序列選自於SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽衍生的物質，所使用的量有效於治療性地或預防性地達到這種誘導效果或脫敏效果。根據本發明的另一個實施方案，提供了一種在需要這種治療的患者中誘導人外周血單核細胞趨化移動的方法。所述方法包含給予所述患者M酸序列選自於SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽，或者由^J^酸序列選自於SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽衍生的物質，所使用的量有效於治療性地或預防性地達到這種誘導效果或脫敏效果。根據本發明的另一個實施方案，提供了一種在需要這種治療的患者中誘導表達曱醯肽受體或曱醯肽受體樣l的細胞脫顆粒的方法。所述方法包含給予所述患者#^酸序列選自於SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽，或者由M酸序列選自於SEQIDNO:l至SEQIDNO:24的肽衍生的物質，所使用的量有效於治療性地或預防性地達到這種誘導效果或脫敏效果。根據本發明的另一個實施方案，提供了一種在需要這種治療的患者的表達甲醯肽受體的細胞或表達曱醯肽受體樣1的細胞中用WKYMVm分別竟爭肽與甲醯肽受體或曱醯肽受體樣1的結合的方法。所述方法包含給予所述患者M酸序列選自於SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽，或者由M酸序列選自於SEQIDNO:l至SEQIDNO:24的肽衍生的物質，所使用的量有效於治療性地或預防性地達到這種資導效果或脫敏效果。根據本發明的另一個實施方案，提供了一種在需要這種治療的患者中刺激表達曱醯肽受體或曱醯肽受體樣1的細胞胞外信號調節的蛋白激酶的方法。所述方法包含給予所述患者M酸序列選自於SEQIDNO:1至SEQIDN0:24的肽，或者由^J^酸序列選自於SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽衍生的物質，所使用的量有效於治療性地或預防性地達到這種誘導效果或脫敏效果。根據本發明的另一個實施方案，提供了一種在需要這種治療的患者中刺激表達曱醯肽受體或甲醯肽受體樣1的細胞的Akt的方法。所述方法包含給予所述患者M酸序列選自於SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽，或者由胺基酸序列選自於SEQIDNO:l至SEQIDNO:24的肽衍生的物質，所使用的量有效於治療性地或預防性地達到這種誘導效杲或脫敏效果。在上述實施方案中，所述被治療的宿主或患者可以具有以下疾病引起的障礙感染特別是巨細胞病毒感染、類風溼性關節炎、萊姆關節炎、痛風、膿毒病症候群、高熱症、潰瘍性結腸炎、小腸結腸炎、骨質疏鬆症、牙周病、腎小球腎炎、慢性非傳染肺部炎症、結節病、吸菸肺、肉芽腫形成、肝纖維化、肺纖維化、移植排斥移植物抗宿主疾病、慢性髓細胞樣白血病、急性髓細胞樣白血病、腫瘤性疾病、哮喘支氣管炎、I型胰島素依賴型糖尿病、動脈硬化、動脈粥樣硬化、銀屑病、慢性B淋巴細胞白血病、常見變異型免疫缺陷病、彌散性血管內凝血、全身性硬化症、腦脊髓炎、肺炎症、高IgE症候群、癌症轉移、癌生長、過繼免疫治療、獲得性呼吸窘迫症候群、敗血病、再灌注症候群、手術後炎症、器官移植或脫髮。本發明提供了一種分離的核苷酸，所述核苷酸編碼包含SEQIDN0:1至SEQIDNO:24的M酸序列的肽。本發明提供了一種包含分離的核苷酸載體,所述核苷酸編碼包含SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的絲酸序列的肽。本發明提供了一種包含選自於SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的胺基酸序列的多肽。通過參考下面的實施例更詳細地解釋本發明。然而，這些實施例無*何都不能被解釋為對本發明範圍的限制。實施例中使用的材料以及方法材料9-芴曱氧絲(Fmoc)絲酸來自Millipore(Bedford,MA)。Rapidamide樹脂購自Dupont(Boston,MA)。外周血單核細胞(PBMC)分離培養基(Histopaque-1077)、細胞色素c和fMLF購自Sigma(St.Louis,M0)。Fura-2戊乙醯氧曱基酯(fura-2/AM)購自MolecularProbes(Eugene,OR)。RPMI1640來自LifeTechnologies(GrandIsland,NY)。透析的胎牛血清和添加的牛血清購自HycloneLaboratoriesInc.(Logen，UT)。PTX、GF109203X和PD98059購自Calbiochem(SanDiego,CA)。LY294002購自BI0M0Lresearchlaboratories,Inc.(PolymouthMeeting,PA)。通過上文描述的固相法(8，9)合成所述肽。簡而言之，在rapidamide支持樹脂上合成肽並且依照標準的9-芴曱氧皿/叔丁基方法將肽組裝於酸敏感的交聯劑上。通過前述的M酸分析(8)確認所述肽的組合物。使用如上述的添加了20%的FBS和200g/ml的G418的DMEM培養RBL-2H3細胞、表達FPR的RBL-2H3細胞以及表達FPRL1的RBL-2H3細胞(13)。RPMI1640來自InvitrogenCorp.(Carlsbad,CA)。透析的胎牛血清和添加的牛血清來自HycloneLaboratoriesInc.(Logen,UT)。CpG寡脫氧核苷酸(0DN)(具有完整的硫代磷酸骨架的5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-30由GenotechInc.(Daejon，Korea)合成。斧;#*腐藉務在37X:和5%C02溼潤空氣中將CT26、EL4保持在添加了20%(體積/體積)的熱失活胎牛血清的RPMA1640培養基中。對於動物實驗，細M冷凍保藏物重新生長之後it4亍2-5次傳代。用0.25%的4^蛋白酶和0.03%的EDTA^J且織培養瓶上分離對數生長期的CT26細胞。用PBS洗滌並懸浮CT26和EL4，隨即進行注射。絲,發無特異病原體的雄性Balb/c小鼠和C57/BL6小鼠購自HyoChangBioscience(Taegu，Korea)。所有小鼠在韓國UniversityofUlsan的ImmunomodulationResearchCenter的動物設施中在無特異病原體的^f^下飼養並且在6-8周齡的時候使用。在第0天分別將CT26和EL4皮下注射Balb/c小鼠和C57/BL6小鼠。從第6天開始每4天全身給予WRYMVm(SEQIDN0:4)和CpG0DNGiJt注射；200jul),而對照組被給予PBS或100jug/小鼠的CpG0M。在每次注射肽或CpG0DN的同一天提前8小時經腹腔注射給予M新鹼。在接種後每2天^^)數字變化測徑器測定肺瘤塊。腫瘤體積被計算為[長x寬x高xtt/6]。死亡日期記錄為小鼠由於胂瘤而自然死亡的日期或者在頻死狀態處死小鼠的日期，或者是當測到的腫瘤寬達到20mm(在該寬度下腫瘤不再會消退)的日期。結a示為10隻小鼠/組的平均SE。在圖9-12中，本表示與載體(PBS)處理的對照得到的值相比p<0.01，"表示與載體(PBS)處理的對照得到的值相比p<0.05。實施例l:嗜中性粒細胞的分離外周血白細胞濃縮物由UlsanRedCrossBlood(Ulsan，Korea)饋贈。依照上述的葡，沉降、紅細胞的低滲裂解和淋巴細胞分離介質梯度的標準方法(9)分離人嗜中性粒細胞。然後立即使用所述分離的人嗜中性粒細胞。實施例2:M人嗜中性粒細胞中超氧化物形成的影響測定了肽WKYMVm、SEQIDNO:1-24的#wkymvm對人嗜中性粒細胞中超氧化物形成的活性。如上所述，使用微量滴定96-:UlELISA讀數器(Bio-Tekinstruments，EL312e，Winooski，VT)(14)，通過測定細胞色素c的還原而定量超氧陰離子的形成。將所iiA嗜中性粒細胞(每個96-孔板的孔中lxl06細胞/100jal的RPMI1640培養基)與50jiM的細胞色素c在37。C預孵育1分鐘，然後與指定濃度的肽孵育。每1分鐘測量一次550nm的光吸收值，共測量5分鐘，超氧化物形成被測量為在ilL5^^中期間內光吸收的變化值。通過至少4次獨立實驗，選擇在每個位置具有活性胺基酸的肽。這些結果顯示於表l中。以多種濃度的肽WKYMVm刺激嗜中性粒細胞導致以濃度依賴的方式形成超氧化物，表明100nM的所述肽活性最大(數據未顯示)。雖然WRYMVm(SEQIDNO:4)、WEYMVm(SEQIDNO:5)、WKFMVm(SEQIDNO:13)和KYMVm(SEQIDN0:21)等某些肽刺激了細胞中超氧化物形成，但是多種肽的100nM的濃度對超氧化物形成活性僅有較弱的活性。表I:M人嗜中性粒細胞中超氧化物形成的影響1tableseeoriginaldocumentpage12通過監測細胞色素c的還原測定超氧化物形成。處理的肽濃度為100nM。還測定了濃度為iojiM的^t超氧化物形成的影響。結果顯示於表n中。在10HM的濃度下，除wkymvmO卜的所有肽所刺激的超氧化物形成強度與WK麗m的一樣。在所述肽之中，WK爾m(SEQIDN0:10)、WKFMVm(SEQIDNO:13)和WKYMVW(SEQIDNO:19)顯示了比WKYMVm更強的活性。表n:toj"人嗜中性粒細胞中超氧化物形成的影響'SEQ1DNO序列b02-(rtmo，/1C)S細胞)SEQIDNO序列02'(nmol/10s細胞)WKYMVnvNH239.0±3.5813WKFMVm-NH260.2±5.571WKGMVm-NH237.6±4.5714WKYMYm-NH242.9±3.342WKYMGm媽27.3±2.6115WKYM(F/W)m-NHi!45.6±7.763WKYMVG-NH227.3±1.4016WKYMVE-NH233.6±6.434WRYMVm-NH238.2±6,5417WKTMW-NH236.3±2.295WEYMVm-NH235.3±2.8818WKYMVR-NH244.8±3.656WHYMVm-NH220.7±7.851956.8±4-307WDYMVm-NH237.3±5.6620WKYMV-NH225.6±2.208W圓Vm媽39.3±4.1021KYMVm-NH249.2±5.829WKEMVm洲239.2±4.7122KYMV-NH235.4±2.1310WKWMVm-NH2胡.0±12.1023YMVm-NHz41,8±3.4611WKRMVm-NW241.7±8.32MVm-NH242.4±2.4712WKDMVm-NHi37.3±2.780通過監測細胞色素c的還原測定超氧化物形成。處理的肽濃度為10|iM。實施例3:所述Jlbt表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞中[Ca2+]i升高的效應測定了肽WKYMVm、SEQIDNO:1-24的肽和wkymvoi對表達FPR的RBL-2H3細胞中[Ca21i升高的活性。用10jiM的每種肽刺'g達FPR的RBL-2H3細胞並測定[Ca2+]i。使用fura-2/AM通過Grynkiewicz的螢光光度法(15)確定[Ca"]i的水平。簡言之，在新配製的無血清RPMI1640培養基中將制名"得到的細胞與3pM的fura-2/AM在37匸持續攪拌孵育50分鐘。在無Ca"的洛克(Locke，s)溶液(154mMNaCl、5.6mMKC1、1.2mMMgCl2、5mMHEPES、pH7.3、10mM葡萄糖和0.2mMEGTA)中以2x106個細胞作為一份用於每次測定。測定了在340nm和380nm的雙激發波長以及500nm的發射波長下的螢光變化，並且將校準的螢光率轉換成[Ca21"監測所述升高的[Ca2+]i的峰值水平。結果顯示於表m和圖ia中。數據4^三次獨立的實驗。表IE.肽對表達FPR的RBL-2H3細胞中胞內鈣升高的影響atableseeoriginaldocumentpage14a通過負載有fura-2的細胞監測胞內鈣的升高。在表達FPR的RBL-2H3細胞中，肽WKYMVm以濃JL依賴的方式誘導[Ca2+]i升高，在300nM附近顯示最大活性(數據未顯示)。WKYMVm對FPR細胞中[Ca2+]i升高活性的EC5。是47nM(表m)。在本發明的肽中，WHYMVm、WK麗m(SEQIDNO:10)和WKFMVm(SEQIDNO:13)與肽WKYMVm相比顯示了與FPR的更強親和力，而其他的肽都不如WKYMVm的活性強(表m)。特別地，直至用20jaM濃度的WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKYMGm(SEQIDNO:2)和第6位D-Met被取代的肽進行處理，都對表達FPR的RBL-2H3細胞中的[Ca2+]i升高沒有影響(表HI和圖1A)。N末端或C末端截短的^bjiFPR細胞中也沒有使[Ca21i升高的活性(表m)。這些結果表明Ty和D-Me是FPR激活[Ca2+]i升高的關鍵。測定了肽MYMVm、SEQIDNO:1-24的肽和wkymvm對表達FPRL1的RBL-2H3細胞中[Ca勺i升高的影響。用10|nM的每種似'J、^達FPRL1的RBL-2H3細胞並測定[Ca'+]i。使用與上述的相同的方法測定[Ca^i的水平。監測所述升高[Ca'+]i的峰值水平。結果顯示於表IV和圖IB中。數據代表三次獨立的實驗。在表達FPRL1的RBL-2H3細胞中，濃度為10nM的WXYMVm顯示最大活性(數據未顯示)。WKYMVm對FPRL1細胞中[Ca2+]i升高活性的ECm)是0.6nM(表IV)。與FPR細胞不同，所有肽對於FPRL1細胞中[Ca2+]i升高都是有活性的(表IV)。某些肽例如WR麗m(SEQIDNO:4)、WK麗m(SEQIDNO:10)、WK歴m(SEQIDNO:13)、WKYMYm(SEQIDNO:14)和WKYM(F/W)m(SEQIDNO:15)顯示了與FPRLl的較高的親和性(表IV)。在FPR細胞中不能影響[Ca";h升高的WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKYMGm(SEQIDNO:2)和第6位D-Met被取代的肽在FPRLl細胞中也顯示了升高[Ca21i的活性，並且與FPRLl的親和性稍低(表IV和圖IB)。N末端或C末端截短的肽在FPRLl細胞中也刺激[Ca21i升高(表IV)。這些結M明Ty一和D-Me^對於FPRLl激活產生的[Ca2+]i升高比對於FPR激活產生的[Ca2+]i升高的重要性低。表IV.肽對表達FPRLl的RBL-2H3細胞中胞內鈣升高的影響aSEQ舊NO序列EC50(nM)SEQIDNO序列EC50WKYMVm-NH20.60±0.09013WKFMVm-NH20.23±0.0421.WKGMVn>NHii21_32±2.10414WKYMSrm-NH20_29±0.0612W,Gm-NH218.11±1.30815WKYM(RW)n>NH20-12土0,.CM53WKYMVG-NH25945.8±176.10016WKYMVE-NH2502.B7±64.9654WRYMVm-NH20.12±0.01017WKYMW-NH21259.15±95.7505WEYMVm-NH25.23±0.19618WKYMVR-NHa177.52±26.0356WHYMVm-NH20.72±0.07519WKYMVW-NH2194.48±19.2107W薩Vm媽14.28±1.22520WK/MV-NH2917.85±45.6108WKHMVm媽1.94±0,26821KYMVm-NH23.01±0.232928.30".35422.>3000010WKWMVm-NH20.16±0.02723YMVm-NH217.15±0.88911WKRMVm-NH22.06±0.25624MVm-NH2>3000O12WKDMVm-NHz8.73±1,210wkymvm-NHa無活性通過負載有fura-2的細胞監測胞內鈣的升高。實施例4:W["I]WK麗m與FPR或FPRLl的結合的影響在發現某些肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK麗m(SEQIDNO:11)和D-Met6取代的肽)不能誘導胞內鉤升高之後，檢測了所述肽是否能結合FPR。監測所述肽替換125I-標記的WKYMVm與FPR或FPRLl結合。在存在或不存在增加量的未標記的WKYMVm或SEQIDNO:1-24的肽的情況下，將表達FPR的RBL-2H3細胞與[125I]WKYMVm孵育。使用以前報導的方法的改進(16)進行配體結合分析。所ii^文射性;^f匕的WK麗mC標記的)購自NENLifesciences(Boston,MA)。簡言之，將表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞以每孔1x105個細胞接種於24-孑Ul中並且過夜培養。用封閉緩衝液(RPMI中33mMHEPES、pH7.5、0.1%BSA)將所述細胞封閉2小時^，在存在或不存在50nM的未標記的肽的務降下將單濃度的1251-標記的WK麗m加入到結合緩衝液(含有0.1%BSA的PBS)的細胞中，並且在41C持續攪拌孵育3小時。然後用水中預冷的結合緩衝液洗滌所述樣品5次，在每個孔中加入200jil的裂解緩沖液(20mMTris、pH7.5、1%曲通X-IOO)。在室溫下裂解20分鐘後收集裂解液。用Y射線計數器測定結合的1251-標記的WKYMVm的放射性。配體結合分析的結果顯示於圖2A和2B中(2A:表達FPR的RBL-2H3細胞，2B:表達FPRL1的RBL-2H3細胞)。如圖2A和2B所示，不但未標記的WKYMVm而且還有WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:ll)和WK麗m的D-Me^取代肽都以濃度依賴的方式抑制[mi]WKYMVm的結合。這些結^明，雖然WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)或WKYMVm的D-Met6取代肽可以結合FPR,但是所有這些肽都不能誘導表達FPR的RBL細胞中細胞內鈣的升高。實施例5:肽對表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞中ERK磷酸化的影響i)用肽刺激細胞將培養的RBL-2H3細胞分成2xl(^個細胞的等份，並且用指定濃度的WKYMVm和本發明的肽刺激所述細胞指定長的時間。用1|LiM的WKYMVm刺激表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞達不同時間(圖3A)。在用ljaM的WKYMVm處理前，將兩種細胞與栽體或100ng/ml的PTX(24小時)、50juM的LY294002(15分鐘)、5的GFX(15^^鍾)、10|iMBAPTA/AM(60分鐘)或50jiMPD98059(60分鐘)預孵育(圖3B)。用10nM的本發明的肽分別刺激表達FPR或FPRL1的RBLH3細胞2分鐘或5分鐘(圖3C)。在刺激後用無血清RPMI洗滌細胞並iL^裂解緩衝液(20mMH印es、pH7.2、10%甘油、150niMNaCl、1。/。曲拉通X-100、50mMNaF、1mMNa3V04、10|ag/ml亮肽素、10jig/ml抑肽酶和1mM苯甲磺醯氟)中裂解。通過離心(12，000xg，15分鐘，4'C)將不溶於洗滌劑的物質沉澱，取可溶的上清液部分於-80。C保存或者立即使用。使用Bradford蛋白測定試劑確定所述裂解物中的蛋白濃度。ii)電泳和免疫印跡分析#^#樣品(30g蛋白)進行10%SDS-PAGE並且用M酸-ERK抗體通過免疫印跡分析確定磷酸化的ERK。通過添加濃縮的樣品緩衝液製備用於電泳的蛋白樣品。然後使用Laemmli描述的緩沖系統(17)通過10%SDS-聚丙烯自皿分離所述樣品的組分。在電泳之後，用抗ERK2抗體進行蛋白印跡分析以確定這些實驗中使用了相同量的樣品。將所述蛋白印跡到硝酸纖維素膜上。然後通過與含有5%的脫脂奶粉的TBS(Tris緩衝的鹽水、0.05%土溫20)孵育封閉所述硝酸纖維素膜。隨後將所述膜與抗磷酸-ERK抗體、抗磷酸-Akt抗體或抗Akt抗體孵育並用TBS洗滌。對於PKC易位測定，使用一種PCK同工酶特異的抗體進行孵育。所^與1:5000稀釋的偶聯辣根itlU匕物酶的山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG抗體孵育後，使用增強化學發光險測系統顯影抗原-抗體複合物。iii)結果評估了所述肽經由FPR或RPRL1對細胞信號傳導的對表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞影響，結果顯示於圖3A至3C中。圖3A至3C的結果>(^3次獨立的實驗。因為某些肽可以結合FPR而不能刺激PLC介導的鈣升高，因4測了它們對獨立於某些GPCR下遊中的PLC的其他信號傳導(ERK和Akt)的影響。用1jiMWKYMVm刺激表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞誘導了ERK短暫的激活，並JL^肽處理後2分鐘或5分鐘分別出現了最大活性(圖3A)。當在WKYMVm刺激前用數種抑制劑預處理表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞的時候，WKYMV邁誘導的ERK激活對PTX和PD98059是敏感的，這表明所述事件是PTX-敏感的G蛋白和MEK依賴的(圖3B)。PI3K抑制劑(LY294002)、PKC抑制劑(GF109203X或Ro-31-8220)或者鉤螯合劑(BAPTA/AM)的預處理不會影響WKYMVm誘導的ERK激活(圖3B)。這說明該事件不絲於PI3K、Ca'+和PKC激活。因》M艮明顯WKYMVm似乎可以通過獨立的信號傳導途徑裔導[Ca2+]i升高和ERK激活。用抗磷酸-ERK抗體通過蛋白印跡分析檢測本發明的肽對ERK激活的影響。與細胞內鉤升高活性不同，所述肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK麗m(SEQIDNO:11)、WK麗R(SEQIDNO:18)和WK麗E(SEQIDNO:16))刺激表達FPR的RBL-2H3細胞中ERK的磷酸化(圖3C)。由於已經清楚所述肽不影響PLC介導的[Ca^升高活性，所以這是非常有意義的結果。用WKYMVm和本發明的肽剌激表達FPRL1的RBL-2H3細胞時，大多數肽也引起FPRL1細胞中ERK的磷酸化(圖3C)。這個結果與前面的結果即所有肽都能刺激表達FPRL1的細胞中細胞內鈣升高是一致的(圖IB)。實施例6:Jlbt表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞中Akt磷酸化的影響已知化學引誘受體的激活可通過PI3K誘導Akt的激活(19)。依照與實施例5中的相同的方法，進行所述肽對細胞的刺激、電泳和免疫印跡分析。用1HM的WKYMVm刺激表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞達不同時間(圖4A)。在用1/iM的WKYMVm處理前，將兩種細胞與載體或100ng/ml的PTX(24小時)、50jaM的LY29麵(15分鐘)、5pM的GFX(15分鐘)、10pMBAPTA/AM(60分鐘)或50pMPD98059(60分鐘)預醉育(圖4B)。用10pM的WKYMVm和本發明的肽分別刺激表達FPR和FPRL1的RBL2H3細胞2分鐘或5分鐘(圖4C)。4W^樣品(30jag蛋白)進行10%SDS-PAGE並且用抗磷酸-Akt抗體通過免疫印跡分析確定磷酸化的Akt。用抗Akt抗體進行蛋白印跡分析以確定這些實驗中使用了相同量的樣品。結果顯示於圖4A至4C中。圖4A至4C的結果代表3次獨立的實驗。WKYMVm刺'激在表達FPR和FPRL1的RBL-2H3細胞中顯示了以時間依賴的方式誘導的Akt磷酸化(圖4A)。WKYMVm誘導的Akt磷酸化對PTX和LY294002敏感而對GFX和BAPTA/AM不敏感，表明是PTXj感的G蛋白和MEK依賴的(圖4B)。不僅WK麗m而且本發明的肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK麗m(SEQIDNO:11)、WK麗E(SEQIDN0:16)和WK麗R(SEQIDN0:18))對表達FPR的RBL-2H3細胞的刺激引起了Akt的磷酸化(圖4C)。WKYMVm和本發明的肽也刺激表達FPRL1的RBL-2H3細胞中Akt的磷酸化(圖4C)。這些結果與所述lb葉兩種類型的細胞中ERK的磷酸化是一致的(圖3C)。由於WKYMVm誘導的ERK和Akt激活是由PI3K激活介導的，看起來(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK麗m(SEQIDNO:11)、WK麗E(SEQIDNO:16)和M麗R(SEQIDNO:18))似乎可以成功誘導位於FPR下遊的PI3K^h導的信號傳導。實施例7:肽對胞吐作用的影響顆粒分泌^J巴大細胞的最重要的功能之一(20)。如上所述，通過測定P-己糖胺酶分泌檢測了WKYMVm對顆粒分泌的影響(18)。簡言之，在24孔組織培養板中過夜培養表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞(2xlo7孔)。用Tyrode緩衝液(137mMNaCl、12mMNaHC03、5.6mM葡萄糖、2.7mMKC1、lmMCaCl2、0.5mMMgCi2、0.4mMM2P0"0.lg/100mlBSA和25mMHEPES,pH7.4)洗滌所述細胞兩次並且用每種肽刺激所述細胞。用多種濃度WKYMVm處理表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞(圖5A)。在不存在或存在10nMBAPTA/AM時將1mM的WKYMVm用於刺激兩個細胞系(圖5B)。在刺激後20分鐘通過將所述培養板置於水上終止所述反應。通過將50ji1的上層清液或細胞裂解液與25p1含5mM對硝基苯-N-乙醯-P-D-葡萄糖醯胺(p-nitrophenyl-N-acety卜P-D-glucosamide)的0.1M;f檬酸鈉緩衝液(pH3.8)在37X:孵育2小時確定分泌到培養基中的p-己糖胺酶。在孵育結束時加入50p1的0.4MNa2C03。監測405nm的吸光度。結果顯示於圖5A和5B中。數據是三個重複進行三次的實驗的一個代表的平均值土S.E.。數值(平均值±S.E.)#^示為細胞中存在的總p-己糖胺酶的百分數。用多種濃度的WKYMVm刺激表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞引起以濃度^S的方式釋放P-己糖胺酶(圖5A)。用100nM或10nM的!1激表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞分別顯示最大活性(圖5A)。現已報導了細胞內鈣升高對於RBL-2H3等肥大細胞中的顆粒分泌是至關重要的(18，20)。也已經證明在所述肽刺激前的BAPTA/AM處理對胞內釣的螯合幾乎完全抑制了WKYMVm誘導的顆粒分泌(圖5B)。肽誘導而不能被它們中的某些肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)、D-Me取代肽)誘導)，檢測了這些肽對RBL細胞中顆粒分泌的影響。用10pM的每種肽處理表達FPR(圖6A)或FPRL1的RBL-2H3細胞(圖6B)。如上文所述地測定肽誘導的p-己糖胺酶的分泌。數據是三個各進行三次的實驗的一個4化的平均值±S.E.。當用肽(WK麗m、WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK薩m(SEQIDNO:11)、WK麗E(SEQIDNO:16)、WK麗R(SEQIDNO:18))刺激FPR細胞的時候，除WKGMVm-:lM義肽、WK麗m-^l代肽和D-Met6-取代肽"卜的一些取代肽使得出現了顆粒的分泌(圖6A)。WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK麗m(SEQIDNO:11)、D-Me取代肽不影響表達FPR的RBL-2H3細胞的顆粒分泌(圖6A)。這些結果與前文的結果即WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK麗m(SEQIDNO:11)、D-Met6取代肽不能誘導細胞內鈣釋放完全一致(圖1A)。與表達FPR的RBL-2H3細胞不同，除fMLF和wkymvm之夕卜的所有肽(WK麗m、WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)、WKYMVE(SEQIDNO:16)、WK麗R(SEQIDNO:18))刺激表達FPRLl的RBL-2H3細胞的顆粒分泌(圖6B)。這也與前文的結果即所述肽刺激表達FPRLl的RBL-2H3細胞中細胞內鈣的升高完全一致(圖IB)。實施例8:^細胞^^匕性的影響使用多孔小室測定法(改良的Boyden小室測定法)(NeuroprobeInc.,Gaithersburg，MD)進行趨化性測定(18)。簡言之，將聚碳酸酯濾器(孔徑為8pm)用50ng/ml的大鼠I型^f、(CollaborativeBiomedicals)的HEPES緩衝的RPMI1640培養基預包被。將幹的包被好的濾器安置於包含不同濃度肽的96孔小室上。以無血清RPMI中1x1(f細胞/ml的濃度將表達FPR或FPRLl的RBL-2H3細胞懸浮於RPMI中，並且將25p1的懸浮'脅到96孑L趨化性小室的上層孔中。在37t:孵育4小時後，將未移行的細胞刮除，將移行通過所述濾器的細胞脫水、固定並用蘇^J晴(Sigma,St.Louis,MO)染色。然後隨M擇該孔的5個高倍視野(HPF)(400x)計數染色的細胞。圖7A顯示所i^^化性測定的結果。用1WKYMVm對載體、50jiM的LY294002(15分鐘)和50jiM的PD98059(60分鐘)預處理的細胞進行趨化性測定，結果顯示於圖7B中。通過在高倍視野(400x)中計數確定移行細胞的數目。數據表示為三個獨立實^r各進行三次的平均值±SE。現已報導了WKYMVm可以誘導吞謹細胞例如單核細胞和嗜中性粒細胞的趨化移動(11)。Le等證明了WKYMVm誘導的細胞趨化性是通過與FPR和FPRLl的結合(12)。與預期一致，WKYMVm在表達FPR或FPRLl的RBL-2H3細胞中顯示了鐘形濃度依賴的趨化移動的活性(圖7A)。所述WKYMVm誘導的細M化對LY294002和PD98059是敏感的(圖7B)。這些結果i兌明WKYMVmi秀導的細胞趨化是PI3K依賴的和MEK依賴的。WKYMVm通過PI3K活性和MEK活性刺激表達FPR或FPRLl的RBL-2H3細胞的趨化移動。本發明的肽對表達FPR或FPRLl的RBL-2H3細胞的細胞趨化的影響被測定。每種肽都以多種濃度用於測定表達FPR或FPRLl的RBL-2H3細胞的趨化分析。通過在高倍視野(400x)中計數確定移行細胞的數目。數據表示為2個獨立實驗各進行三次的平均值±SE。在表達FPR的RBL-2H3細胞中，不僅WKYMVm而且還有所述取代肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK麗m(SEQIDNO:11)、WK麗E(SEQIDNO:16)和WK麗R(SEQIDNO:18))誘導了細絲化(圖8A)。誘導趨化所需的所述取代肽的濃度高於所需的WKYMVm的濃度(圖8B)。在參與取代肽誘導的趨化信號傳導途徑上，PI-3激酶和MEK介導的信號傳導的參與情況被測試。當將表達FPR的RBL細胞用LY294002或PD98059預處理的時候，WKYMVm和所述取代肽誘導的RBL細胞移動幾乎完全被抑制(圖7B，數據未顯示)。在表達FPRL1的RBL-2H3細胞中，WKYMVm和所述肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)、WK麗E(SEQIDNO:16)和WKYMVR(SEQIDNO:18))也誘導了濃度絲的細胞趨化(圖8B)。在本發明中首次證明了不同配體對FPR調節會導致不同的細胞信號傳導和機能。為了證明FPR的配體特異性調節，製備了在表l中列出的多種肽，有效的FPR配體。在所述肽中，WKGMVm-(SEQIDNO:1)、WKRMVm-(SEQIDNO:11)和D-Me取代肽與FPR結合僅誘導PI-3激#導的Akt激活和MEK介導的ERK激活，從而產生所述細胞的趨化移動。這些肽不影響細胞內釣升高。由於肽WKYMVm不僅刺激ERK激活而且刺激細胞內鈣升高從而導致趨化和脫顆粒，這說明FPR可以被不同配體進行不同的調節。最近的幾項報導已經證明某些GPCR可以被不同配體調節(21，22)。在GPCR的配體特異性調節的過程中，已經表明不同配體可誘導受體的不同構象變化並且誘導所述受體與某些效應分子或G蛋白選擇性偶聯。在表m和圖1A中，已經證明WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:ll)和D~Met6取代肽不能刺激表達FPR的RBL-2H3細胞中PLC介導的細胞內鈣升高。然而，這些肽能夠刺激表達FPR的RBL-2H3細胞中ERK和Akt的磷酸化(圖3C)。在WKYMVm和本發明的肽介導的細胞信號傳導中，通過PLC-p激活的PI水解可誘導細胞內鈣升高，而MEK和PI3激酶的激活分別介導了ERK和Akt的磷酸化。由於已經清楚這些結果，顯然肽配體與FPR的結合似乎可誘導FPR的構象變化，並且所述構象變化似乎可提供受體與G蛋白介導的PLC-P或G蛋白介導的PI-3激酶的偶聯。由於不能誘導細胞內鈣升高的某些本發明的肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)和D-Me1;6取代肽)可以通過PI-3激SI^賴的途徑刺激ERK磷酸化，因此所述肽似乎可與FPR結合併且誘導PI-3激酶和MEK介導的信號傳導的激活所需要的構象變化，從而產生RBL-2H3細胞的趨化移動。現已報導了甲醯肽受體家族的兩個不同受體FPR和FPRL1在先M^A應中發揮重要的功能(l，2)。迄今為止，已經報導了包括甲醯肽脂氧素A4在內的多種不同的配體源可與FPR或FPRL1結合(l)。Le等報導了WKYMVm可以與FPR和FPRL1結合(12)。在本發明中，發明人證明用其他M酸取代Ty一或D-Me消除了FPR的PLC介導的細胞內鈣升高活性，而不消除FPRL1的PLC^^導的細胞內鉤升高活性(圖1)。這個結a明Ty和D-Me^對於通過FPR的PLC激活是至關重要的，而對於通過FPRL1的PLC激活不是至關重要的。M個結果可以推論出FPR和FPRL1的配體結合位點是不同的。包括FPR在內的GPCR通過與異源三聚體的G蛋白結合可誘導胞內信號傳導，並且許多研究組已經試圖揭示參與G蛋白偶聯的受體的關鍵性4J^酸戎基(23,24)。對於FPR，Miettinen等構建了35種突變FPR並且檢測了突變對FPR的G蛋白偶聯和細胞信號傳導的影響。才艮據所^JL獻，S63、D71、R123和C124/C126對於G蛋白與FPR偶^bl重要的(24)。在所述突變體中，不能介導鈣運動的R123A突變體可以誘導通過fMLF的ERK磷酸化(24)。也定非活性形式的所述受體的1鍵網絡(24)。在所述推斷中，配體與受體^:引起所述氫鍵網絡的改變，並且某些^J^酸^例如DRY基序中的精氨酸4皮暴露而能與G蛋白相互作用(24)。已經發現WKGMVm等某些肽能夠謙導ERK磷酸化而不能誘導鉤運動。確定WKYMVm或WKGMVm(SEQIDNO:l)與FPR的結合是否誘導所述受體的不同構象變化將是重要的；即雖然WKYMVm可以誘導FPR的構象變化包括所述DRY基序的氬鍵合的改變，但是WKGMVm(SEQIDNO:l)僅引起所述受體的不同的構象變化而不影響DRY氬鍵合。對於FPRL1的情況，它雖然也包含DRY基序(FPRL1中的DRC)，但它在G蛋白偶聯中的功能還沒有被檢測到。在這些結果中，不僅WKYMVm而JL^有WKGMVm(SEQIDN0:1)可誘導表達FPRL1的RBL細胞中的釣運動(圖IB)。這些結果表明WKYMVm或WKGMVm(SEQIDNO:1)不影響FPR或FPRL1中DRY基序的氬鍵合。其他的結合口袋(bindingpocket)將參與所述肽的結合，並且作為下一步工作鑑定參與WKYMVm或WKGMVm(SEQIDNO:l)與FPR不同結合模式的g將是重要的。迄今為止，尚無報導說某些天然配體可以不同地調節FPR。在免疫系統中對脫顆粒或趨化移動進行不同的調節將是更精細調節所需要的。按照這種觀點，本發明中對差異性調節FPR的配體的鑑定是重要的。實施例9:WRYMVm在注射CT26的小鼠中抑制腫瘤生長為了評估免疫調節肽Trp-Arg-Tyr-Met-Val-D-Met-C0NH2(WRYMVm;(SEQIDN0:4))的抗腫瘤效果，在Balb/c小鼠才莫型中測試了CT26結腸癌。A^接種腫瘤細胞後的第6天開始每兩天測定腫瘤塊的大小。如圖9A和9B所示，給予2jig/小鼠的WRYMVm在第22天時成功地抑制了腫瘤塊的生長(PBS對照的50%)。給予100pg/小鼠的CpG寡，氧核苷酸(ODN)被測試用於比較，但是所述CpGODN處理組對腫瘤生長沒有顯示出任何的效果。這個結M明免疫調節肽WRYMVm對於CT26腫瘤的抑制有顯著效果。實施例10:WRYMVm在注射EL4的小鼠中抑制腫瘤生長為了確認WRYMVm的抗腫瘤效果，測試了另外一種腫瘤模型EL4淋巴細胞。將EL4(2x105細胞/小鼠)經皮下注射至C57/BL6小鼠以形成EL4的腫瘤塊。如圖10A和10B所示，WRYMVm能夠抑制EL4的腫瘤塊。這個結果與用CT26的實驗一致。總之，WRYMVm在小鼠模型中很明顯具有抑制腫瘤生長的效果。實施例ll:低劑量的WRYMVm在CT26模型中最有效為了揭示WRYMVm的有效腫瘤抑制劑量，將0.1jag/小鼠、0.25pg/小鼠和llig/小鼠的WR麗m給予CT26/Balb/c模型。如圖11A和11B所示，0.1lig/小鼠的處理組顯示了最高的腫瘤抑制效力。值得注意的是，lnig/小鼠的劑量對腫瘤的抑制效杲有所降低。這個結果強烈M明WRYMVm是通過十分敏感的機制實現抗腫瘤功能的，而所述機制在高濃度時是不敏感的。在白細胞的趨化移動中很容易出現類似的現象。考慮到WRYMVm的靶受體FPRL1與趨化移動事件相關的事實，可得出結論WRYMVm誘導的抗腫瘤效應可能源自於白細胞浸潤事件。因此，十分有必要揭示所述WRYMVm誘導的抗腫瘤效應和所述白細胞浸潤事件之間的直接關係。實施例12:WRYMVm與長春新鹼增強抗腫瘤效果的組合"^為了增強WRYMVm的抗腫瘤效果，進行了一項與抗癌藥物長^^新鹼的組合試驗。長春新鹼可破壞^#管穩態並且可導致細胞死亡。通過使用^新鹼可以為免疫系統提供腫瘤特異性抗原。因此，在注射所述肽之前8小時對每隻小鼠腹腔注射2jLig的長春新鹼。僅^4新鹼的處理組顯示出與WRYMVm處理組類似的肺瘤生長抑制才莫式(圖12A)。如預期一致，WRYMVm和M新鹼的組合處理顯示了最有效的抗腫瘤活性。所i^ia合試驗顯示比僅WRYMVm處理組或僅長春新鹼處理組提高15%。存活率也出現了相似的結果(圖12B)。雖然所述組合試驗與單處理組相比沒有出現顯著提高，但是三個組合試驗組、WRYMVm處理組和長春新鹼處理組仍然具有抑制腫瘤生長的能力，而PBS對照和CpGODN不能阻止死亡。綜合以上結果可以得出結論調節免疫功能的合成肽WRYMVm具有抗肺瘤活性。所述WR麗m能夠明顯地抑制腫瘤生長。另夕卜，WRYMV邁在與長^^f鹼的組合試驗中的功能更強，表明WRYMVm可以與其他試劑一塊用於癌治療。再者，本發明首次發明了一種短肽衍生的抗癌效應，它可調節免疫細胞。參考文獻1.Le，Y.，Li'B.,Gong,W.，Shen,W.,Hu'丄，Duntop,N.M.,Oppenheim,丄丄'andWang,丄M.(2000)ImmunolRev,177,185-194.2.Le，Y.,Oppenheim，丄丄，andWang,丄M.(2001)CytokineGrowthFactorRev.12,91-1O丄3.White,丄R.，Lee，丄M.,Young,P.R.,Hertzberg,R.P.,Jurewicz，A.丄，Chaikin,M.A.,WWdowson,K.'Foley,丄丄，Martin.,D.,Grlswold，D.E.'andSarau,H.M.(1998)丄Biol.Chem.273,10095-10098.4.Zagorski，丄，andWahl,S.M.(1997)丄Immunol.159，1059-1062.5.Prossnitz,E.R"andY&rR.D.(1997)Pharmacol,Ther.74,73-102.6.Su,S-B.,Gong,W.H.,Gao,丄L,Sherr,W.P.,Grimm,M-C.，Deng,X.,Murphy,P.M.,Oppenhe，m，丄丄，andWang,丄M.(1999)Blood93'3885-3892.7.Walther,A.，R'舊hemann，K.,andGerke，V.(2000)Wlol.Cell.5，8.Baek,S.H.，Seo，丄Chae,C.B.,Suh,P.G.，aridRyu，S.H.(1996)丄Biol.Chem.271,8170-8175.9.Seo'丄K.,Choi,S.Y.，Kim，Y"B$ek,S.H.,Kim'K.T.,Chae,C,B.,Lambeth,丄D.，Suh,P.G.,andRyu，S.H.(1997)丄Immunol.158,1895-1901.10.Bae,Y.S.，Ju,S.A.,Kim,丄Y.，Seo，丄K.,Baek，S.H,，Kwak,丄Y.，Kim,B.S.,Suh，P.G.,andRyu，S.H,(1999)丄Leukoc.Biol.65,241-248.11.Bae,Y.S.,Kim，Y.,Kim，Y.'Kim,丄H,，Suh，P.G.，andRyu，S.H.(1999)丄Leukoc.Biol.66，915"922.12丄e'Y"Gong，W.，Li,B.，Dunlop，N.M.,Shen，W"Su,S.B.,Ye,R.D.,andWang,丄M.(1999)丄Immunol,163，6777-6784.13.He,R.,Tan,L.,Browning,D.D.'Wang,丄M.，andYe,R.D.(2000)丄Immunol.165，4598-4605.14.Bae,Y.S.,Bae,H.,Kim,Y.,Lee,T.G,,Suh'P.G"鄰dRyu,S.H.(2001》Blood97,2854"2862.15.Grynkiewicz，G.，Poenie，M.，andTsien,R.Y.(1986)丄Biol.Chem.260，3440-3450.化.Hu,丄Y.,Le,Y.,Gong，W.,Dunlop，N,M.,Gao，丄L"Murphy,P.M.,andWang，丄M.(2001)丄Leukoc.Biol.70,155~1561.17.King,丄，andLaemmlf,U.K.(1971)丄Mol.Biol.62，化Haribatrti,B.，Zhelev，D.V.，Pridgen,B,C.,Richardson,R.M.rAli,H.，andSnyderman，R.(1999)丄Biol,Chem.274，37087^37092.19.Franke,T,F.,Yang,S.l.，Chan,T.O.,Datta,K.，Kazlauskas,A.,Morrison,D-K.,Kaplan,D.R"andTsichlis,P.N.(1995)Cell.81,727-736.20.Jin,X.,Sh印herd，R.K.,Duling,B.R.,andLinden,丄(1997)丄Clin.Invest.100,2849-2857.21-Thomas,G.，Qian,H.,Chang,C.S.，andKamik，S.(2000)丄Biol.Chfem.275,2893-2900.22.Palanche，T.'llien,B.，Zoffmann,S.,Re汰，M.P.,Bucher，B.，Edelstein，S,丄，'andGalzi，J.L(2001)丄Biol.Chem.276，34853-34861.23.Prossnitz^E.R"Quehenberger,O.,Cochrane,C.G.,andYe,R.D.(1993)Biochem.丄294，581-587.24.Miettinen，H.M，，Grip節什og,丄M.,Mason,M.M.,andJesaitis,A.丄(1999)JBiol.Ch柳.274,27934>27942.權利要求1.一種抗癌劑，所述抗癌劑包含具有選自於SEQIDNO4、SEQIDNO11及其組合的胺基酸序列的肽。2.權利要求2的抗癌劑，所述抗癌劑用於抑制結腸癌。3.權利要^2的抗癌劑，所述抗癌劑用於抑制起源於胰、乳房、肺、腦、前列腺、鱗狀細胞或淋巴樣細胞的癌。4.一種在需要它的患者中抑制癌細胞增殖或者增加癌細胞凋亡的方法，所述方法包括給予需要它的患者有效量的選自於SEQIDNO:4、SEQIDN0:11及其組合的胺基酸序列或其類似物，以在所述患者中抑制癌細胞增殖或者增加癌細胞的凋亡。5.權利要求4的方法，其中給予所述需要它的患者有效量的選自於SEQIDNO:4、SEQIDNO:11及其組合的胺基酸序列。6.權利要求4的方法，其中給予所述需要它的患者有效量的選自於SEQIDNO:4、SEQIDNO:11及其組合的胺基酸序列的類似物。7.權利要求4的方法，其中所述增殖被抑制或凋亡被增加的癌細胞是結腸癌細胞。8.權利要求4的方法，其中所述增殖被抑制或者凋亡被增加的癌細胞選自起源於胰、乳房、肺、腦、前列腺、鱗狀細胞或淋巴樣細胞的癌細胞。9.一種用於抑制癌細胞增殖或者增加癌細胞凋亡的藥物組合物，所述藥物組合物包含選自於SEQIDN0:4、SEQIDNO:11及其組合的胺基酸序列或其類似物，以及可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。10.權利要求9的藥物組合物，所述藥物組合物用於抑制結腸癌。11.權利要求9的藥物組合物，所述藥物組合物用於抑制起源於胰、乳房、肺、腦、前列腺、鱗狀細胞或淋巴樣細胞的癌。全文摘要根據本發明的實施方案的抗癌劑提供了具有選自於SEQIDNO4、SEQIDNO11及其組合的胺基酸序列的肽。所述抗癌劑用於抑制起源於結腸、胰、乳房、肺、腦、前列腺、鱗狀細胞或淋巴樣細胞的癌。文檔編號A61K38/08GK101370510SQ200680052746公開日2009年2月18日申請日期2006年12月26日優先權日2005年12月23日發明者宋芝英,徐判吉,柳成浩,裴外植申請人:Posco公司;學校法人浦項工科大學校