蘇雲金芽孢桿菌cry1Ai在抗蟲中的用途、改造的mcry1Ai基因及應用的製作方法

2023-06-09 20:29:11 1

專利名稱：蘇雲金芽孢桿菌cry1Ai在抗蟲中的用途、改造的mcry1Ai基因及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別是涉及蘇雲金芽孢桿菌crylAi的用途，以及改造 的mcrylAi基因及應用。
背景技術：
蟲害是造成農作物減產的重要原因之一，減少蟲害的損失是增加糧食與飼料作物 產量的重要途徑。據統計全球糧食與飼料作物總產量每年因蟲害造成的損失達14%，直接 給農業生產造成的經濟損失高達數千億美元。我國每年因蟲害造成的損失水稻減產10%、 小麥減產20%、棉花減產30%以上[夏啟中，張明菊，抗植物蟲害基因及其應用，鄂州大學 學報，2005，(5) :56-60.]。採用噴施化學農藥和生物殺蟲劑等防治手段固然可以減輕害 蟲對農作物的為害，但化學農藥造成環境汙染，生物殺蟲劑成本較高。長期以來，大量噴施 化學殺蟲劑，不僅會增強害蟲的抗藥性，使益蟲及其它生態區系遭受破壞，而且嚴重汙染環 境，提高生產成本，破壞生態平衡。因此，減少殺蟲劑使用量，發展現代植物保護技術，已成 為可持續發展農業中必須正視的課題之一。蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭氏 陽性細菌，是一種對害蟲毒力強且對天敵無毒性的昆蟲病原微生物，對高等動物和人無毒 性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對16個目3000多種害蟲有 活性。Bt在芽孢形成期可形成殺蟲晶體蛋白(Insecticidal CrystalProteins, ICPs)， 也稱δ-內毒素(delta-endotoxin)，它的形狀、結構和大小均與其毒力有著密切關係 [Schnepf. E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D. R., Dean. D. H. Bacillus thuringiensisand its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998,62(3) :775_806.]。自 1981 年 Schn印f 等克隆了 Bt 的第一個 ICPs 基 因，並於1985年發表了它的DNA鹼基序列及其編碼蛋白的胺基酸序列起，截止2008年6月 已發現和克隆了 412種ICPs基因。蘇雲金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白因其殺蟲效果好、安全、 高效等優點而被廣泛的應用於蟲害防治。1996年全世界第一例轉基因抗蟲植物在美國獲 準應用，它使用的基因來自Bt crylAc.在接下來的幾年裡，轉cryIAb基因的抗蟲玉米，轉 cry3Aa基因的抗蟲土豆等相距問世。在中國，自1998年開始正式推廣含有crylAc/crylA 基因的抗蟲棉以來，已經被普遍種植。在轉基因作物商業化的第一個12年(1996-2007)中， 由於能得到持續穩定的收益，農民種植轉基因作物量逐年增加。2007年，全球轉基因作物種 植面積增長率達12%，即增加1230萬hm2，達到1. 143億hm2 (2. 824億英畝)。第一個12 年，轉基因作物商業化給工業化國家和發展中國家的農民都帶來了經濟和環境效益。由於目前商品化的轉基因抗蟲作物的抗蟲基因種類比較單一，如此大面積推廣種 植存在害蟲避難所減少與害蟲抗藥性上升的風險。因此需要不斷分離高毒力的或者新的基 因組合來避免害蟲抗藥性上升的風險。因此，篩選分離克隆新的、高毒力的Bt殺蟲基因，可以豐富殺蟲基因資源，為轉基
3因作物與工程菌株提供新的基因來源，提高Bt轉基因產品的抗蟲效果，並且可以降低害蟲 對Bt毒蛋白的抗性風險，避免新的生態災難降臨，具有重要的經濟、社會和生態效益。

發明內容
本發明提供一種蘇雲金芽孢桿菌crylAi在抗蟲中的用途，其對小菜蛾、玉米 螟、棉鈴蟲、粉紋夜蛾、甜菜夜蛾、二化螟等害蟲具有高毒力；同時通過對蘇雲金芽孢桿菌 crylAi改造，得到蘇雲金芽孢桿菌晶體殺蟲蛋白mcrylAi基因序列，以應用於轉化微生物 和植物，使之表現出對相關害蟲的毒性，並克服、延緩害蟲對工程菌和轉基因植物的抗藥性產生。蘇雲金芽孢桿菌crylAi基因在抗鱗翅目害蟲中的應用。所述應用是將蘇雲金芽孢桿菌crylAi基因表達的晶體蛋白用於殺滅鱗翅目害 蟲。所述應用是將上述基因轉入到微生物或植物，使之表達對鱗翅目害蟲的毒性蛋 白。一種改造的mcrylAi基因，其具有如SEQ NO. 3所述的核苷酸序列。改造的mcrylAi基因在抗鱗翅目害蟲中的應用。所述應用是將上述基因轉入到微生物或植物，使之表達對鱗翅目害蟲的毒性蛋 白。本發明發現菌株BTS6(保藏號CGMCC 3459)對鱗翅目害蟲具有高毒力，從中克隆 得到一個基因，經測序(其核苷酸序列為SEQ NO. 1)發現，與公開的crylAi基因相似性為 100%。經實驗證明，該基因蛋白(其胺基酸序列為SEQ NO. 2)對鱗翅目害蟲具有高毒力， 從而可將其轉化植物或微生物，使之表達蛋白殺滅鱗翅目害蟲。根據CrylAi蛋白的殺蟲活性區胺基酸序列設計合成了可以用於轉基因植物開發 的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ N03所示，該改造基因mcrylAi用於轉化玉米，CrylAi蛋 白的含量最高可佔總可溶蛋白的0. 23 %。保藏信息
分類命名蘇雲金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis保藏號CGMCC3459保藏日期2009年11月23日保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號


圖 1，cryl 類 PCR-RFLP 鑑定圖譜1，引物k3un2/k5un2擴增酶切條帶；2，引物k3un3/k5un3擴增酶切條帶；M，IOObp ladder圖2，cryIAx陽性克隆PCR鑑定1,3. 6kb PCR 產物；2，陰性對照；Μ, λ /Eco 1301圖3，CrylAx在大腸桿菌中的表達1，空白對照不可溶組分；2，表達菌株不可溶組分；3，空白對照可溶組分；4表達菌株可溶組分圖4植物表達載體pUlAi的構建圖5植物表達載體pUlAi的酶切鑑定M =Lamda DNA/Ecol301I 1 :pUlAi/Sac I+BamH I，2:pT8A/Sac I+BamH I 3 p3300-Ubi/Sac I+BamH I圖6抗性植株PCR檢測M :DM2000P :pUlAi CK 陰性對照 1 15 部分轉基因植株圖7PCR陽性植株中cryIAi蛋白佔可溶性蛋白比例圖8T0代轉基因植株的玉米螟生物活性測定A，B 未轉基因植株 C 轉基因植株
具體實施例方式實施例ICrylAi基因、蛋白功能1-1菌株BTS6殺蟲活性測定將菌株接種到LB固體培養基上，培養72小時，至芽孢與晶體釋放。將芽孢與晶體 用滅菌水洗下來，懸浮起來，稀釋到1億芽孢每毫升的濃度用於殺蟲活性測定。以小菜蛾、 玉米螟、棉鈴蟲、甜菜夜蛾為例，測定對鱗翅目害蟲的殺蟲活性。結果顯示該濃度的芽孢晶 體混合物對小菜蛾、棉鈴蟲、甜菜夜蛾、玉米螟具有高活性。四種試蟲的死亡率都為100%。1-2BTS6 菌株的 PCR-RFLP 鑑定1.利用兩對 cryl 類鑑定引物 k3un2/k5un2，k3un3/k5un3 (Kuo, W. S. and Chak, K. F. Identification of novel cry-type genes from Bacillus thuringiensis strains on the basis ofrestriction fragment length polymorphism of the PCR-amplified DNA. Applied andEnvironmental Microbiology, 1996,62 :1369-1377.)，對 BTS6 菌株大質 粒進行PCR-RFLP分析得到酶切圖譜如圖1。綜合泳道1，2的酶切條帶和已知基因的酶切圖譜可以 大體確定BTS6菌株中含有crylA，crylE, crylK類基因，對鑑定PCR產物建立T-A克隆庫， 進行測序。得到其中cryIA類片斷與cryIAi相似性100%。1-3設計一對cryl類基因通用引物擴增從crylAi全長基因根據cryl類基因保守區設計了一對通用引物(CrylAi5/CrylAi3)，序列如下
CryIAi 5-ATGGATAACAATCCGAACATCAATGCry1Ai 3-CTATTCCTCCATAAGGAGTAATTCC通過PCR擴增的方法，以BTS6的基因組為模版，克隆cryIAi基因全長，見圖2，連 接PEB表達載體得到陽性克隆。獲得的重組表達載體質粒命名為PEBS6。用pfuDNA聚合酶，用如下體系進行PCR擴增。。 超純水補至50 μ L，混勻離心，加石蠟油30 μ L。擴增循環94°C變性1分鐘，54 °C退火1分鐘，72°C延伸4分鐘，25個循環，最後 72°C延伸10分鐘。l-4crylAi全長基因序列分析對陽性克隆進行測序，得到基因全長序列。連接方案載體0.1-0.2yg目的片段 DNA0.5-1. Oyg5XLigation Buffer2μ LT4DNALigase1 μ L用超純水補足體積到10 μ L，充分混勻，16°C連接4h或4°C連接過夜。轉化方案1、挑取單菌落於5ml LB震蕩培養過夜；2、按接種量接種於LB液體培養基中，37°C，230rpm培養2-2.5hr，(0D600 = 0. 5-0.6)；，3、4°C, 4，OOOrpm 離心 IOmin ；4、棄上清，加入預冷的0. IM CaC1250ml懸浮細胞，置於冰上30min以上；5、4°C，4, OOOrpm 離心 lOmin，回收細胞；6、用2_4ml冰預冷的0. IM CaC12重懸細胞，分裝成200 μ 1/0. 5mL離心管中，於
4°C保存(可保存一周)。7、取200 μ 1感受態細胞與5 μ L連接產物充分混勻，冰浴30min。8、42°C 熱激 1. 5min，冰浴 3min。9、加入 800 μ 1 LB 培養基 37°C培養 45min。10、取200 μ 1塗板，加入相應的抗生素，及IPTG，X_gal，37°C培養。基因全長3. 6kb，見SEQ NO. 1，翻譯蛋白共1187個胺基酸見SEQ NO. 2。通過利用 在線分析工具(http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast. cgi)比對，使用蛋白保守結構域 資料庫比對(Conserved Domain Database)分析，該蛋白胺基酸序列SEQ N0. 2的36至608 位胺基酸是該蛋白的殺蟲活性區域。該基因序列與已報導的crylAi基因序列完全一致。
Distilled water
30% Degassed Acrylamide
1.5MTris(pH8.8)
1.0MTris(pH6.8)
10%SDS
10%APS
TEMED
分離膠8% (ml)
4.6
2.7 2.5
0.1 0.1 0.006
堆積膠5% (ml)
2.7
0.67
0.5 0.04 0.04 0.004上樣上樣10-15 μ 1，電泳:130-150V 恆壓。染色與脫色電泳後取出凝膠，用蒸餾水衝洗後，放入染色液中，60rpm振蕩染色 Ihr左右，脫色液中脫色2hr左右，脫色至凝膠背景透明，清水中漂洗至蛋白帶清晰。cryIAi 基因可以表達約134kD的蛋白(見圖3)。1-6殺蟲活性測定以小菜蛾、玉米螟、棉鈴蟲為例測定蛋白對鱗翅目的殺蟲活性，見由表1、表2、表 3，結果可知CrylAi蛋白對鱗翅目害蟲有高毒力。敏感小菜蛾的生物活性測定結果如表1，各濃度重複4次，每重複接蟲15頭。表1，CrylAi對敏感小菜蛾的生物活性測定 敏感小菜蛾的生物活性測定結果顯示CrylAi對敏感小菜蛾有高毒力。對敏感亞洲玉米螟的生物活性測定見表2，各濃度重複3次，每重複接蟲24頭表2，CrylAi敏感亞洲玉米螟的生物活性測定
7 對敏感亞洲玉米螟的生物活性測定結果顯示CrylAi敏感亞洲玉米螟有高毒力。對敏感棉鈴蟲的生物活性測定見表3，各濃度重複3次，每重複接蟲15頭。活蟲按 發育等級分類。表3CrylAi敏感棉鈴蟲的生物活性測定結果 對敏感棉鈴蟲的生物活性測定結果顯示，CryIAi敏感棉鈴蟲的生物活性表現為高效抑制發育。實施例2CrylAi蛋白在轉基因植物中的應用2-1 改造基因 mCrylAi根據CrylAi蛋白的殺蟲活性區胺基酸序列設計合成了可以用於轉基因植物開發 的DNA序列。去除了多聚腺苷酸化信號26個，GC含量提高了 11.5%。該序列具有GC含量 為48%的特徵；含有利於植物表達的序列，命名為mCrylAi具體見SEQ NO. 3。在基因上遊 添加了 Ω序列和Kozak序列，在基因3』端添加了內質網定位信號。該改造基因mCrylAi合成序列由組成型Ubiquitin啟動子驅動，導入到水稻中，對 二化螟有較好的抗蟲活性。序列中下劃線為Ω序列，加粗的為Kozak序列，邊框為KEDL內質網定位信號，上 遊添加了 BamH I、HindIII、XbaI、XmaI、SmaI、NcoI，下遊添加了 SacI、EcoRI 酶切位點，便 於載體構建。
丨III!
合成序列與原有核苷酸序列有84%的相似性。以下是比對結果。 Query :mCrylAi 序列如 SEQ NO. 3 Sbjct 原有cryIAi序列
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Sbjct 241 gaacagttaattaaccaaagaatagaagaattcgctaggaaccaagccatttctagatta 300 Query 415 gaaggactaagcaatctgtatcagatctacgctgagtccttccgggagtgggaagccgat 474 Sbjct 301 gaaggactaagcaatctttatcaaatttacgcagaatcttttagagagtgggaagcagat 360
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Sbjct 961 ataacagcttctcctgtagggttttcaggaccagaattcgcattccctttatttgggaat 1020 Query 1135 gcggggaatgcagctccacccgtgcttgtctcactcactggcttggggatcttccgcaca 1194
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Query 1195 ctctcttcacctctctatcgcagaatcatacttggttcaggcccaaacaaccaggaactg1254
III I III I 丨丨丨 Il ΜΙΕΙΙΕΙΜΙΜΙΜΠΙ! Il ΜΙΜΙΜΙ
Sbjct 1081 ttatcttcacctttatatagaagaattatacttggttcaggcccaaataatcaggaactg1140
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Sbjct 1141 tttgtccttgatggaacggagttttcttttgcctccctaacgaccaacttgccttccact 1200 Query 1315 atctaccggcagaggggtacagtcgattcgctagatgtcatcccgccacaagacaacagc 1374
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Sbjct 1201 atatatagacaaaggggtacagtcgattcactagatgtaataccgccacaggataatagt 1260 Query 1375 gtaccgcctcgtgcgggattcagccaccgattgagccatgtcaccatgctgagccaagca 1434
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Sbjct 1261 gtaccacctcgtgcgggatttagccatcgattgagtcatgttacaatgctgagccaagca 1320 Query 1435 gctggagcagtctacaccttgagagcacccacgttctcttggcaacatcgcagtgccgag 1494
Sbjct 1321 gctggagcagtttacaccttgagagctccaacgttttcttggcagcatcgcagtgctgaa 1380 Query 1495 ttcaataacataatcgcgtcggatagcatcactcagatccctgcagtgaagggcaacttt 1554
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Sbjct 1381 tttaataatataattgcatcggatagtattactcaaatccctgcagtgaagggaaacttt 1440 Query 1555 cttttcaatggctctgtcatctcaggaccaggcttcactggtggggacttagttcggctc 1614
Sbjct 1441 ctttttaatggttctgtaatttcaggaccaggatttactggtggggacttagttagatta 15000179
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M 0181 0182
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Query 1615 aattcgagtggcaacaacattcagaaccgggggtacattgaggttcccattcacttcccg 1674
Sbjct 1501 aatagtagtggaaataacattcagaatagagggtatattgaagttccaattcacttccca 1560 Query 1675 tcgacctctaccaggtatcgagttcgtgtacggtatgcctctgtgaccccgattcacctc 1734
Sbjct 1561 tcgacatctaccagatatcgagttcgtgtacggtatgcttctgtaaccccgattcacctc 1620 Query 1735 aacgtcaattggggcaactcgtccattttctccaacacagtaccagccacagccacgtca 1794
Sbjct 1621 aacgttaattggggtaattcatccattttttccaatacagtaccagctacagctacgtca 1680 Query 1795 ctcgacaacctgcaatcgagcgacttcggctacttcgagagtgccaatgccttcacgtct 1854
Sbjct 1681 ttagataatctacaatcaagtgattttggttattttgaaagtgccaatgcttttacatct 1740 Query 1855 tccttaggtaacatcgtaggtgtcaggaacttcagtgggactgcaggcgtgatcatagac 1914
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Sbjct 1741 tcattaggtaatatagtaggtgttagaaattttagtgggactgcaggagtgataatagac 1800 Query 1915 cgcttcgagtttattccggttactgcaacactcgaggctgagtacaatctggaaagagcg 1974
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Sbjct 1801 agatttgaatttattccagttactgcaacactcgaggctgaatataatctggaaagagcg 1860 Query 1975 cagaaggcggtgaatgcgctgtttacgtcaacaaatcagctggggctgaaaacaaatgtg 2034
Sbjct 1861 cagaaggcggtgaatgcgctgtttacgtctacaaaccaactagggctaaaaacaaatgta 1920 Query 2035 acgga 2039
Illll
Sbjct 1921 acgga 1925 2-2植物表達載體構建
用BamH I和Sac I雙酶切中間載體p3300_Ubi，將回收的載體片段分別與用同樣 兩個限制性內切酶消化的cryIAi片段相連，構建流程見圖4，酶切鑑定(圖5)證明植物表 達載體PUlAi構建成功，該載體含有由組成型啟動子Ubiquitin驅動的cryIAi基因，篩選 標記為bar基因。2-3玉米遺傳轉化2-3-1玉米的控制授粉
12
(1)玉米抽雄後，用大口袋套住雄穗，下面用別針別住，收集花粉；(2)雌穗花絲未抽出前，用小口袋將其套住，並用大頭針別好；(3)在授粉的前一天，當花絲伸出約2cm長時，用剪刀剪去花絲的頂部，促進其伸 長；(4)第二天，當花絲伸長後，依下列組合進行授粉(前為母本，後為父本)齊31 X 綜31 ；(5)授粉後系上小牌，寫上授粉的品種和日期，10 12天後收穫；2-3-2幼胚的剝離和培養(1)將新收穫的玉米雌穗去掉苞葉、花絲，花絲一定要去乾淨，可用酒精燈將未除 淨的花絲燒去；用小刀去掉雌穗的頭尾部分；
Tween20
(2)將雌穗浸在70%乙醇中滅菌30sec；
(3)將雌穗取出，浸在2.5%的次氯酸納中滅菌10 15min，可以在溶液中加幾滴
(4)用滅菌水清洗3次，用濾紙擦去殘留的水珠，置於無菌的環境中備用；
(5)將一隻槍式鑷子從頂部插入雌穗，用左手持住鑷子，右手用裝有#21刀片的手 術刀切去籽粒的上半部分；(6)換上#10刀片，將刀尖插入籽粒下部的果皮與胚乳之間，將胚乳挑出；(7)用刀尖將粘在胚乳頂部或頂部果皮內的幼胚轉移到誘導培養基上，操作要小 心，不要損傷幼胚。放置時注意胚軸(較平的一面)向下，盾片向上，每皿約放置20 30 個；(8) 27 28°C暗培養3 4周，使之開始脫分化，形成愈傷組織；此後，選擇生長迅 速、質地鬆脆、顏色鮮亮的愈傷組織繼代培養，每2 3周繼代一次，選擇生長良好的愈傷準 備基因槍轉化；(9)在射擊前4hr，將切成小塊的愈傷轉移到含0.4M甘露醇的高滲培養基上；(10)射擊後，使愈傷在高滲培養基上繼續培養過夜，然後轉移到誘導培養基上，恢
復培養一周。2-3-3用基因槍進行玉米轉化
幹)；
(1)打開超淨臺，用70%乙醇擦拭超淨臺內部和基因槍的表面及內部；
(2)打開紫外燈，滅菌30min；
(3)按前述步驟準備微彈；
(4)易裂片、微彈載體、阻攔網滅菌(置於70%乙醇中l.Omin，放在濾紙上自然風
(5)打開氣瓶，調節壓力至2，OOOpsi；
(6)按前述方法安裝微彈載體和微彈；
(7)將易裂片、阻攔網和微彈載體安裝進固定裝置中；射擊參數為Gap distance :20mm ；微彈載體飛行距離(Macroprojectile flight distance) :10mm;微彈飛 ^fS&m (Particle flightdistance) :7cm ;J￡力:1, 350psi ；^2SiS :25inches Hg.；
(8)把培養皿放在託盤上，使愈傷都集中在託盤中間的圓圈內，將託盤插入倒數第 二檔；
(9)打開基因槍的電源；(10)打開真空泵；(11)關閉基因槍的門，按下「抽真空」鍵(Vac)，當真空表讀數達到25incheS Hg.時，使鍵置於「保持(Hold) 」檔；(12)按下「射擊(Fire)，，健直到射擊結束；(13)按下「放氣」健，使真空表讀數歸零；(14)打開基因槍門，取出培養皿，蓋好蓋子並用封口膜封好；(15)重複上述步驟，直至完成轉化。2-3-4轉化愈傷組織的篩選和植株的再生(1)將轉化後的愈傷組織置於黑暗中，28°C培養過夜，然後轉移到N6誘導培養基 上培養5 7天；(2)將愈傷轉移到篩選培養基上(含PPT20mg/L)，兩周繼代一次，選擇色澤正常、 分化良好的愈傷，棄去衰老死亡的愈傷。每皿的培養物不宜過多，愈傷塊應儘量小些，並使 愈傷緊貼培養基；(3)繼代3 4次後，將愈傷移至N6分化培養基上，在光周期為亮/暗=16/8， 28°C條件下培養，每兩周繼代一次；(4)將發生綠芽的愈傷組織切分；(5)當小植株長到1 2cm高時，轉移進三角瓶中(含MS生根培養基)繼續培養；(6)3 4葉期且根系較發達時，將小苗移入小花盆中，移入溫室培養；二周後移入 大花盆，直至開花結實。2-4轉基因植株的PCR檢測2-4-1轉基因植株基因組DNA的提取-SDS法1)稱取0. 2g的葉片放入1. 5ml離心管，用液氮充分研磨成粉末。2)加入 500μ1 SDS-BufferdOOmM Tris, 50mM EDTA, 500mM NaCl，pH 8.0)，混勻。 3)再加入20 μ 1 20% SDS，輕輕混勻後置於65°C水浴10分鐘。4)加入250 μ 1 5Μ KAC,混勻，冰上放置30分鐘。5)4°C離心，12000rpm, 10 分鐘。6)取上清，移入新的離心管中，加入等體積的異丙醇中，冰浴5分鐘。7)4°C離心，12000rpm, 10 分鐘。8)棄上清，70%乙醇洗滌兩次，真空乾燥DNA後，加入40 μ 1無菌雙蒸水溶 解，-20°C保存備用。PCR檢測
反應體系40 μ 1
10XPCR buffer4μ 1
dNTPs(2. 5mM)3. 2μ 1
引物對(10 μ Μ)各 1· 6μ 1
模板1 μ 1
Taq 聚合酶(5U/y 1)0. 4μ 1
超純水補至40 μ 1PCR反應條件94°C 預變性 5min 72°C延伸 IOmin16 °C Imin 終止反應檢測引物JclAiF GTTTCTGTTGAGCGAGTTTGTTCCJclAiR CACAGCATAGTCGGTGTAGTTGCC經過抗性篩選得到15株抗性植株，提取抗性植株基因組，以其做模板，進行PCR檢 測，共得到6株PCR陽性植株(圖6)。提取PCR陽性植株可溶性蛋白，1號植株CrylAi蛋 白的含量最高可佔總可溶蛋白的0. 23 %。(圖7是改造mCry IAi表達蛋白在可溶性蛋白中 所佔比例圖)PCR陽性植株的生物活性測定將PCR陽性植株移栽，當植株生長到6 8葉時，將玉米螟初孵幼蟲接於心葉中， 以未轉化植株作為陰性對照，接蟲2周後調查食葉級別見表4。結果顯示，人工接蟲玉米螟 後，轉基因植株單株間的抗蟲性表現有一定差異轉基因植株對玉米螟表現為抗性，沒有或 只有很小的玉米螟危害的蟲孔(圖8，未轉化植株被玉米螟咬食嚴重，葉片蟲孔大且蟲孔數 目多，已影響到植株的正常生長。 附錄SEQUENCE LISTING中國農業科學院植物保護研究所蘇雲金芽孢桿菌crylAi在抗蟲中的用途、改造的mcrylAi基因及應用P09478/ZWB3PatentIn version 3. 313546DNA
tcaaaattaattagaagtttggttccttattgtgcaccactgtgcgcatcgaggatttagggaaatctagaaagcggagatataaagaggcaaacggatagaagcgtattttagaaggtcggagatttcacaaaacaaccgttcgtgtctggagagggctaactgtgtagactcaagaaggaaagcaattgatggacgaaccagctggctgagatcggaggaatag21181PRTcrylAi全長基因編碼的胺基酸序列21METAspAsnAsnProAsnIIeAsnGluCysIleProTyrAsnCysLeuSerAsnProGlu21 ValGluValLeuGlyGlyGluArgIIeGluThrGlyTyrThrProIIeAspIIeSerLeu41 SerLeuThrGlnPheLeuLeuSerGluPheValProGlyAlaGlyPheValLeuGlyLeu61 ValAspIIeIIeTrpGlyIlePheGlyProSerGlnTrpAspAlaPheLeuValGlnlIe81 GluGlnLeulleAsnGlnArglleGluGlupheAlaArgAsnGlnAlaIleSerArgLeu101 GluGlyLeuSerAsnLeuTyrGlnlleTyrAlaGluSerPheArgGluTrpGluAlaAsp121 ProThrAsnProAlaLeuArgGluGluMETArglleGlnPheAsnAspMETAsnSerAla141 LeuThrThrAlalleProLeuPheAlaValGlnAsnTyrGlnValProLeuLeuSerVal161 TyrValGlnAlaAlaAsnLeuHisLeuSerValLeuArgAspValSerValPheGlyGln181 ArgTrpGlyPheAspAlaAlaThrIIeAsnSerArgTyrAsnAspLeuThrArgLeuIIe201 GlyAsnTyrThrAspTyrAlaValArgTrpTyrAsnThrGlyLeuGluArgValTrpGly
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蘇雲金芽孢桿菌cry1Ai基因在抗鱗翅目害蟲中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，是將蘇雲金芽孢桿菌cryIAi基因表達的晶體蛋白用於 殺滅鱗翅目害蟲。
3.根據權利要求1所述應用，是將上述基因轉入到微生物或植物，使之表達對鱗翅目 害蟲的毒性蛋白。
4.一種改造的mcryIAi基因，其具有如SEQ NO. 3所述的核苷酸序列。
5.權利要求4所述的改造的mcryIAi基因在抗鱗翅目害蟲中的應用。
6.根據權利要求5所述應用，是將上述基因轉入到微生物或植物，使之表達對鱗翅目 害蟲的毒性蛋白。
全文摘要
本發明涉及「蘇雲金芽孢桿菌cry1Ai在抗蟲中的用途、改造的mcry1Ai基因及應用」，屬於生物技術領域。蘇雲金芽孢桿菌cry1Ai對鱗翅目害蟲具有高毒力，根據Cry1Ai蛋白的殺蟲活性區胺基酸序列設計合成了的改造基因mcry1Ai序列，更有利於植物表達，表達量最高可佔總可溶蛋白的0.23％。
文檔編號C12N15/32GK101926365SQ200910241558
公開日2010年12月29日 申請日期2009年11月26日 優先權日2009年11月26日
發明者何康來, 宋福平, 張 傑, 束長龍, 粱革梅, 黃大昉 申請人:中國農業科學院植物保護研究所