快速檢測鑑定李斯特菌的pcr-rflp方法及檢測用試劑盒的製作方法

2023-05-30 21:10:01

專利名稱：快速檢測鑑定李斯特菌的pcr-rflp方法及檢測用試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種快速檢測鑑定李斯特菌的PCR-RFLP方法及檢測用試劑盒。
背景技術：
目前國際上公認的李斯特菌共有6種單核細胞增生李斯特菌(lis teria mwocj^ow/ ^，簡稱單增李斯特菌)、綿羊李斯特菌(listeria ivanovii)、英諾克李斯特菌(Listeria innocua)lif {Listeria welshimeri)lif {Listeria grayi)和西爾李斯特菌(listeria seeligcri).其中單增李斯特菌是一種人畜共患的病原菌，可引起嚴重的傳染病，如敗血症、腦炎、腦膜炎。該菌廣泛存在於自然界中，肉類、蛋類、禽類、海產品、乳製品、蔬菜等都已被證實是單增李斯特菌的感染源，食品中存在的單增李斯特菌對人類的安全具有威脅，該菌在4 ！的環境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原之一，2000年被WHO食品安全工作計劃列為檢測的食源性致病菌之一； 綿羊李斯特菌主要危害動物，特別是反芻獸，常表現為敗血症和流產，對人危害較少；近期有國內外報導，英諾克李斯特菌存在於食品中，當其發生由非溶血性變為溶血性的變異時， 對人類具有一定的潛在致病性；其餘3種李斯特菌對人和動物的危害相對較小。英諾克李斯特菌、威爾李斯特菌、格氏李斯特菌等李斯特菌雖不是常規致病菌，但由於其常與致病的李斯特菌共同存在於食品中，因此也被作為致病李斯特菌的指示菌。在食品中，雖然不同李斯特菌的危害嚴重性不同，但任何一種李斯特菌的存在，均被認為是衛生狀況不良的指示。 目前，人們對這幾種李斯特菌的分布狀況不甚明了，為了能調查清楚不同李斯特菌的分布環境，首先需要發展適宜的檢測鑑定幾種李斯特菌的方法。掌握食品被李斯特菌汙染狀況是獲得安全食品的重要一步，也是防止食物中毒， 保障人民健康的最有效的一步。按傳統的生化鑑定方法檢測鑑定李斯特菌時，有時會造成漏檢，國內外已有多次非典型菌株缺少典型特徵的報導；同時通過傳統生化鑑定方法不易於做6種李斯特菌的種間區分。鑑於此，通過分子生物學方法鑑定李斯特菌得到了廣泛的發展，然而目前這些方法主要是做李斯特菌屬的鑑定。PCR-RFLP (PCR-restriction fragment length polymorphism)方法常被用來做鑑定物種的方法。，該方法將PCR技術、RFLP分析與電泳方法聯合應用，先將待測的靶DNA片段進行複製擴增，然後應用DNA限制性內切酶對擴增產物進行酶切，最後經電泳分析靶DNA片段是否被切割而分型。該方法操作簡單，結果容易判定。

發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的在於提供了一種檢測和鑑別單增李斯特菌、英諾克李斯特菌、綿羊李斯特菌、威爾李斯特菌和格氏李斯特菌的PCR-RFLP方法及檢測用試劑盒。本發明的李斯特菌檢測和鑑定方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優點。為達到上述的目的，本發明採用如下技術方案，一種快速檢測鑑定李斯特菌的PCR-RFLP方法，包括如下步驟1)基因組DNA模板的制
備；
2)PCR擴增反應通過李斯特菌iap基因特異引物對，進行PCR擴增反應；
3)PCR產物檢測凝膠電泳檢測PCR產物；
4)限制性內切酶消化反應用DdeI內切酶對PCR產物進行酶切；
5)酶切產物檢測凝膠電泳檢測酶切產物，並與酶切標準圖譜比對。所述的步驟5)中比對方法為當陰性對照無條帶，陽性對照出現與標準圖譜一致的酶切片段時，說明實驗有效；被檢測樣品與標準圖譜中格氏李斯特菌的酶切譜帶一致，說明為格氏李斯特菌陽性；被檢測樣品與標準圖譜中單增李斯特菌的酶切譜帶一致，說明為單增李斯特菌陽性；被檢測樣品與標準圖譜中威爾李斯特菌的酶切譜帶一致，說明為威爾李斯特菌陽性；被檢測樣品與標準圖譜中綿羊李斯特菌的酶切譜帶一致，說明為綿羊李斯特菌陽性；被檢測樣品與標準圖譜中英諾克李斯特菌的酶切譜帶一致，說明為英諾克李斯特菌陽性。所述步驟2)中PCR擴增反應所用的李斯特菌基因特異引物對的序列為 上遊引物 5』 -ATGAATATGAAAAAAGCAAC-3，；
下遊引物 5，-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3，。所述步驟2)中PCR擴增反應的反應液組成如下
10 X擴增緩衝液5 μ L ；(購於FERMENTAS公司) 4種dNTP混合物各
200 ymol/L;(購於生工生物工程(上海)有限公司) 引物對各0.5 μ mol/L ；
DNA模板2 yg;Taq DNA聚合酶2 u;(購於生工生物
工程(上海)有限公司) MgCl2 1. 5 mmol/L ； 加ddH20至50 μ L0所述PCR擴增反應條件如下95 °C變性3 min ；95 °C變性15 S,58 °C變性30 S、 72 °C變性45 S，進行35個循環擴增；72 °C延伸5 min。所述步驟4)中限制性內切酶消化反應體系按20 μ L計如下所示
DNA (PCR擴增後的產物)0.2-1 μ g ； IOX酶切buffer 2.0 μ L ；(購於天根生化科技(北京)有限公司)限制性內切酶Dde I 1-2 u ；(購於天根生化科技(北京)有限公司) 力口 ddH20 M 20 μ L。所述限制性內切酶Dde I消化反應的反應條件如下按上述配比先加入DNA (PCR 擴增後的產物)，10X酶切buffer，加ddH20至20 μ 1，最後加入限制性內切酶Dde I，輕輕混勻，稍加離心，放置於水浴溫育。所述水浴溫度為37°C，溫育時間為lh。一種快速檢測鑑定李斯特菌的PCR-RFLP方法所用的試劑盒，包括如下組成李斯特菌iap基因特異引物對，限制性內切酶Dde I，酶切標準圖譜(見圖3)和陽性對照液(iap 基因標準品)iap基因標準品序列見GenBank。試劑盒中其它組成，可按本領域常規進行選擇。試劑盒實施步驟按上述的快速檢測鑑定李斯特菌的PCR-RFLP方法的步驟進行。本發明的有益效果是本發明建立了檢測和鑑定5種李斯特菌的PCR-RFLP方法及試劑盒，並經實際樣本檢測測試，未發現假陽性結果，表明該方法切實可行。本方法採用PCR 擴增技術，使得檢測5種李斯特菌的靈敏度顯著提高。本方法採用RFLP技術，一次即可對5 種李斯特菌進行篩查，不需要對每種李斯特菌分別進行確證鑑定，節省了實驗時間，加快了檢出速度。綜上所述本發明的李斯特菌檢測和鑑定方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優點，較傳統的生理生化鑑定方法有更高的可重複性，較普通PCR更為快速、簡便，可實現對5種李斯特菌的快速、準確、特異的檢測和鑑定。可應用於檢驗檢疫、臨床診斷、公共衛生等實驗室檢測部門。


圖1為本發明具體實施例1中標準菌珠的PCR擴增產物電泳M、Marker，1、格氏李斯特菌，2、單增李斯特菌，3、威爾李斯特菌，4、綿羊李斯特菌，5，英諾克李斯特菌；
圖2為本發明具體實施例1中標準菌珠的PCR-RFLP產物電泳圖； M、Marker，1、格氏李斯特菌，2、單增李斯特菌，3、威爾李斯特菌，4、綿羊李斯特菌，5，英諾克李斯特菌；
圖3為酶切標準圖譜；
M、Marker，1、格氏李斯特菌，2、單增李斯特菌，3、威爾李斯特菌，4、綿羊李斯特菌，5，英諾克李斯特菌。
具體實施例方式實施例1
本實施例的一種快速檢測鑑定李斯特菌的PCR-RFLP方法，包括如下步驟1)基因組 DNA模板的製備；取疑似菌落的細菌培養液1 ml，置於無菌的Eppendorf管中，12000 rpm 離心1 min，去上清，用滅菌蒸餾水洗滌兩次，收集菌體；加入400yL裂解液(40 mmol/ L Tris-醋酸，20 mmol/L 醋酸鈉，1 mmol/L EDTA，1%SDS，pH7. 8)混勻，置於 37 °C 水浴 1 h ；.然後加入200 μ L 5mol/L的氯化鈉溶液，混勻後於13000 rpm離心15 min。取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加兩倍體積無水乙醇，1/10體積醋酸鉀(3 mol/L ,pH8. 0),-20 °C保存1 h後，13000 rpm離心15 min，棄上清液，沉澱用70%乙醇洗2次；置於室溫乾燥後，溶於50yL TE溶液中，置4°C保存備用。2)PCR擴增反應通過李斯特菌iap基因特異引物對，進行PCR擴增反應； (1)引物
根據相關文獻，選擇一對引物為李斯特菌屬的特異性擴增反應引物。用於PCR反應的引物對的序列為
上遊引物5，-ATGAATATGAAAAAAGCAAC-3，， 下遊引物5，-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3，； 李斯特菌的特異性PCR產物大小均為1400 bp左右。(2) PCR 反應 PCR反應液組成如下
IOX擴增緩衝液 5 μ L ；(購於FERMENTAS公司) 4種dNTP混合物各200 μ mol/L ；(購於生工生物工程(上海)有限公司) 引物對各0.5 μ mol/L ； DNA模板2 μ g ；Taq DNA聚合酶2 u ；(購於生工生物工程
(上海)有限公司) MgCl21. 5 mmol/L ； 加 ddH20 至50 μ L0
6
PCR擴增反應條件如下95 °C變性3 min ；95 °C變性15 S,58 °C變性30 S,72 V 變性45 S，進行35個循環擴增；72 °C延伸5 min。
(3) PCR產物電泳檢測
取擴增後的產物5 μ L點樣於1%瓊脂糖凝膠(含0.5 yg/ml溴化乙錠)，以2000 bp Marker為標準分子參照，以5 V/cm的電場強度於0. 5 X TBE電泳緩衝液中電泳30 min ；電泳結果用紫外凝膠成像系統分析、拍照；見圖1，從圖1可得5種李斯特菌均產生1400 bp 左右的特異性擴增條帶。根據待檢樣品的電泳圖是否出現1400 bp左右的特異性擴增條帶可初步判定是否含為5種李斯特菌。PCR產物的序列鑑定
切下帶有所需DNA片段的凝膠，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TAKARA)(購於天根生化科技(北京)有限公司)從瓊脂糖凝膠中回收純化目的片段；DNA測序由大連寶生物工程有限公司完成；測序證明，PCR擴增片段與預期一致。4)限制性內切酶Dde I消化反應限制性內切酶消化反應體系如下所示
DNA (PCR擴增後的產物)0.2-1 μ g ； IOX酶切buffer 2.0 μ L ；(購於天根生化科技(北京)有限公司)限制性內切酶Dde I 1-2 u ；(購於天根生化科技(北京)有限公司) 力口 ddH20 M 20 μ L。限制性內切酶Dde I消化反應條件如下
按上述配比先加入DNA (PCR擴增後的產物)，10 X酶切buffer，加ddH20至20 μ L， 最後加入限制性內切酶Dde I，輕輕混勻，稍加離心，放置於溫度為37 ！水浴溫育1 h。PCR-RFLP的消化產物電泳鑑定
取消化反應後的產物10 μ L點樣於1%瓊脂糖凝膠(含0.5 yg/ml溴化乙錠)，以2000 bpMarker為標準分子參照，以5 V/cm的電場強度於0. 5XTBE電泳緩衝液中電泳30 min ； 電泳結果用紫外凝膠成像系統分析、拍照；其中利用標準菌株進行上述PCR-RFLP的消化反應後電泳圖為標準菌珠的PCR-RFLP產物電泳圖，見圖2，從圖2可得經限制性內切酶 Dde I消化後，5種李斯特菌產生特異的酶切譜帶。格氏李斯特菌具有250 bp和1200 bp左右的酶切片段；單增李斯特菌不被酶切，保持1400 bp左右的PCR產物片段；威爾斯李斯特菌具有600 bp,560 bp,400 bp,260 bp和200 bp左右的酶切片段；綿羊李斯特菌具有1200 bp和400 bp左右的酶切片段；英諾克李斯特菌具有710 bp,550 bp,260 bp左右的酶切片段。通過標準菌珠的PCR-RFLP產物電泳圖構建酶切標準圖譜，見圖3。所以鑑定並區分這5種李斯特菌為當陰性對照無條帶，陽性對照出現與酶切標準圖譜一致的酶切片段時，說明實驗有效；此時，被檢測樣品與酶切標準圖譜中格氏李斯特菌的酶切譜帶一致，說明為格氏李斯特菌陽性；被檢測樣品與酶切標準圖譜中單增李斯特菌的酶切譜帶一致，說明為單增李斯特菌陽性；被檢測樣品與酶切標準圖譜中威爾李斯特菌的酶切譜帶一致，說明為威爾李斯特菌陽性；被檢測樣品與酶切標準圖譜中綿羊李斯特菌的酶切譜帶一致，說明為綿羊李斯特菌陽性；被檢測樣品與酶切標準圖譜中英諾克李斯特菌的酶切譜帶一致，說明為英諾克李斯特菌陽性。本實施例的一種快速檢測鑑定李斯特菌的PCR-RFLP方法所用的試劑盒，包括如下組成上述李斯特菌iap基因特異引物對，限制性內切酶Dde I，酶切標準圖譜和陽性對照液。 本實施例建立了檢測和鑑定5種李斯特菌的PCR-RFLP方法及試劑盒，並經實際樣本檢測測試，未發現假陽性結果，表明該方法切實可行。本方法採用PCR擴增技術，使得檢測5種李斯特菌的靈敏度顯著提高。本方法採用RFLP技術，一次即可對5種李斯特菌進行篩查，不需要對每種李斯特菌分別進行確證鑑定，節省了實驗時間，加快了檢出速度。所以說本實施例所述的李斯特菌檢測和鑑定方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優點，較傳統的生理生化鑑定方法有更高的可重複性，較普通PCR更為快速、簡便，可實現對5種李斯特菌的快速、準確、特異的檢測和鑑定。可應用於檢驗檢疫、臨床診斷、公共衛生等實驗室檢測部門。
權利要求
1.一種快速檢測鑑定李斯特菌的PCR-RFLP方法，其特徵在於包括如下步驟1)基因組DNA模板的製備；2)PCR擴增反應通過李斯特菌iap基因特異引物對，進行PCR擴增反應；3)PCR產物檢測凝膠電泳檢測PCR產物；4)限制性內切酶消化反應用DdeI內切酶對PCR產物進行酶切；5)酶切產物檢測凝膠電泳檢測酶切產物，並與酶切標準圖譜比對。
2.如權利要求1所述的一種快速檢測鑑定李斯特菌的PCR-RFLP方法，其特徵在於 所述的步驟5)中比對方法為當陰性對照無條帶，陽性對照出現與標準圖譜一致的酶切片段時，說明實驗有效；被檢測樣品與標準圖譜中格氏李斯特菌的酶切譜帶一致，說明為格氏李斯特菌陽性；被檢測樣品與標準圖譜中單增李斯特菌的酶切譜帶一致，說明為單增李斯特菌陽性；被檢測樣品與標準圖譜中威爾李斯特菌的酶切譜帶一致，說明為威爾李斯特菌陽性；被檢測樣品與標準圖譜中綿羊李斯特菌的酶切譜帶一致，說明為綿羊李斯特菌陽性； 被檢測樣品與標準圖譜中英諾克李斯特菌的酶切譜帶一致，說明為英諾克李斯特菌陽性。
3.如權利要求1所述的一種快速檢測鑑定李斯特菌的PCR-RFLP方法，其特徵在於所述步驟2)中PCR擴增反應所用的李斯特菌基因特異引物對的序列為上遊引物 5，-ATGAATATGAAAAAAGCAAC-3，；下遊引物 5，-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3，。
4.如權利要求1所述的一種快速檢測鑑定李斯特菌的PCR-RFLP方法，其特徵在於所述步驟2)中PCR擴增反應的反應液組成如下IOX擴增緩衝液5 yL; 4種dNTP混合物各200 μ mol/L ；引物對各 0.5 μ mol/L ；DNA 模板 2 yg;TaqDNA聚合酶2 u ；MgCl21. 5 mmol/L ； 力口 ddH20 至50 μ L。
5.如權利要求4所述的一種快速檢測鑑定李斯特菌的PCR-RFLP方法，其特徵在於所述 PCR擴增反應條件如下95 °C變性3 min ；95 °C變性15 S,58 °C變性30 S,72 °C變性45 S，進行35個循環擴增；72 °C延伸5 min。
6.如權利要求1所述的一種快速檢測鑑定李斯特菌的PCR-RFLP方法，其特徵在於所述步驟4)中限制性內切酶消化反應體系按20 μ L計如下所示PCR 擴增後的產物 DNA 0. 2-1 μ g ； IOX 酶切 buffer 2. 0 μ L ；限制性內切酶Dde I 1-2 u ；力口 ddH20 M 20 μ L。
7.如權利要求6所述的一種快速檢測鑑定李斯特菌的PCR-RFLP方法，其特徵在於所述限制性內切酶Dde I消化反應的反應條件如下按上述配比先加入PCR擴增後的產物DNA， IOX酶切buffer，加ddH20至20 μ L，最後加入限制性內切酶Dde I，輕輕混勻，稍加離心，放置於水浴溫育。
8.如權利要求7所述的一種快速檢測鑑定李斯特菌的PCR-RFLP方法，其特徵在於所述水浴溫度為37 °C，溫育時間為1 h。
9.如權利要求1所述的一種快速檢測鑑定李斯特菌的PCR-RFLP方法所用的試劑盒，其特徵在於包括如下組成李斯特菌iap基因特異引物對，限制性內切酶Dde I，酶切標準圖譜和陽性對照液。
全文摘要
本發明公開了一種快速檢測鑑定李斯特菌的PCR-RFLP方法及檢測用試劑盒，包括如下步驟1)基因組DNA模板的製備；2)PCR擴增反應通過李斯特菌iap基因特異引物對，進行PCR擴增反應；3)PCR產物檢測凝膠電泳檢測PCR產物；4)限制性內切酶消化反應用DdeⅠ內切酶對PCR產物進行酶切；5)酶切產物檢測凝膠電泳檢測酶切產物，並與酶切標準圖譜比對。本發明的李斯特菌檢測和鑑定方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優點。
文檔編號C12Q1/04GK102329883SQ201110314558
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月17日 優先權日2011年10月17日
發明者葉妍妍, 孔繁德, 徐淑菲, 楊俊萍, 林立, 郭書林, 陳信忠, 陳垚, 龔豔清 申請人:廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心