利用長春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法
2024-01-18 18:51:15 1
利用長春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法
【專利摘要】本發明涉及一種利用長春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，包括長春花感病植株的培育、長春花的扦插再生、長春花扦插再生條件的優化、藥物處理和抗韌皮部桿菌藥物的篩選。本發明以植物韌皮部桿菌的天然寄主長春花為篩選抗韌皮部桿菌藥物的試材，篩選方法快速、操作簡便，能直觀、準確評價待篩選藥物抗韌皮部桿菌的效果。
【專利說明】利用長春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及篩選抗菌藥物的方法，具體涉及一種利用長春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，屬植保【技術領域】。
【背景技術】
[0002]韌皮部桿菌(Ca.Liberibacter)是一種引起柑橘黃龍病、馬鈴薯斑馬片病等嚴重病害的病菌，對世界柑橘、馬鈴薯等生產造成巨大的損失。如柑橘黃龍病2005年在美國佛羅裡州首次發現，在短短的5年時間裡，已經擴散到全部34個柑橘產生產縣，造成高達46億美元的經濟損失；同樣地，馬鈴薯斑馬片病是20世紀90年代中期在南美洲首次發現的新病害，近年該病害在美國、墨西哥及紐西蘭等地擴散為害，對當地馬鈴薯生產構成嚴重威脅。這類菌至今還未能獲得純化培養，因此其科赫氏假說(Koch』 s postulates)還未得到驗證，也無法通過離體培養進行藥物篩選，嚴重製約了該菌和相關病害的防治。
[0003]長春花是韌皮部桿菌的天然寄主，病原菌在長春花體內繁殖速度很快，而且感病後症狀明顯，是一種理想的篩選抗韌皮部桿菌藥物的植物材料。健康的長春花生長快，扦插成活率高，對外界條件要求很低，但當長春花感染韌皮部桿菌後，由於病原菌的快速繁殖造成韌皮部的嚴重損傷，很難扦插成活。因此，如果通過在培養基中添加外源生長調節劑以及控制培養條件，促進帶菌發病的長春花枝條扦插後能夠保持正常的髮根和生長，這樣就能通過發病的長春花扦插再生和病原菌的增殖情況進行抗韌皮部桿菌的藥物篩選和評價。
[0004]經檢索，目前，未見有抗韌皮部桿菌藥物篩選方法的相關文獻報導。本領域技術人員長期希望找到一種能快速、準確、操作簡便地用於篩選及評價抗韌皮部桿菌藥物的方法，用於防治柑橘黃龍病、馬鈴薯斑馬片病等病害。
【發明內容】
[0005]本發明目的是提供一種利用長春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，能快速、準確、操作簡便地用於篩選及評價抗韌皮部桿菌藥物。
[0006]為實現上述目的，本發明的技術方案如下:
[0007]本發明利用長春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，其特徵在於如下步驟:
[0008](I)長春花感病植株的培育:通過菟絲子的吸器與寄主植物維管束相連接，將感染柑橘黃龍病植株的韌皮部桿菌病原菌傳到種子培育的長春花，I~6個月後，長春花葉片出現感染韌皮部桿菌的症狀，經PCR檢測，確定長春花植株感病，保育在防蟲溫室中。
[0009](2)長春花的扦插再生:在採集長春花感病枝條前I~12個小時,完全燒灌植株，採集I~IOcm至少包含兩張葉片的帶菌枝條，在`枝條的基部用促根劑和植物生長調節劑蘸浸，種植在栽培基質中，置於10~35°C的遮陰、防蟲控溫溫室中，保持空氣相對溼度60~95%;其特徵在於所述栽培基質為蛭石、或砂、或蛭石和砂、或蛭石和有機土的混合基質，其配比一般為蛭石和砂各50%，或蛭石和有機土各50%。所述的植物生長調節劑一般為NAA或/和IBA，二種植物生長調節劑的濃度各為2~16 μ g/ml ;蘸浸時間一般為1_8個小時；[0010](3)長春花扦插再生條件的優化:調整培養基基質組成、噴施植物生長調節劑、促根劑和營養液；
[0011](4)藥物處理:取待篩選的藥物，0.1~1000mg/L浸泡處理嚴重感病的長春花枝條I~12小時，進行扦插、管理，扦插後I~4周，用相同的藥物再處理I~3次；所述待篩選的藥物，如抗生素、化學殺菌劑、生物殺菌劑、抗菌多肽等。
[0012](5)抗韌皮部桿菌藥物的篩選:2~6個月後，觀察不同藥物處理的成活再生生物量和檢測新生長枝條的韌皮部桿菌的含量，篩選出抗韌皮部桿菌藥物。
[0013]其中步驟(3)所述調整基質，指將基質調整為有機土和蛭石各50%的混合物；所述的營養液為MS或MT，使用濃度為水和營養液的體積比為1:1。
[0014]本發明的有益效果是:
[0015]1、能直觀、準確評價待篩選藥物抗韌皮部桿菌的效果。
[0016]2、篩選方法快速、操作簡便。
【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。
[0018](I)通過菟絲子的吸器與寄主植物維管束相連接，將感染柑橘黃龍病植株的韌皮部桿菌傳到種子培育的長春花，2個月後，長春花葉片出現感染韌皮部桿菌的症狀，經PCR檢測，確定長春花植株感病，保育在防蟲溫室中。
[0019]PCR檢測方法如`下:①病原菌DNA的提取:用Qiagen的植物DNA提取試劑盒提取(DNeasy Plant Mini Kit, Cat.69106，Qiagen, MO, USA)。將感病的長春花葉片，撕取中脈，將約200mg中脈裝入2.0ml離心管，加入APl緩衝液和RNAase後，用勻漿機(Fast Pr印24)打碎，然後在65°C下溫育20min，期間反覆顛倒試管2~3次；加入AP2緩衝液置於冰浴中20min,然後在10，OOOXg下離心5min,加入1.5倍體積的AP3/E緩衝液,反覆振蕩數次,轉入微濾柱,10，000 X g離心Imin ;用AW緩衝液清洗兩次之後再空柱離心徹底甩幹，最後向柱中加入50 μ I AE緩衝液洗脫，8，000 Xg離心Imin洗脫植物總DNA，所得用於PCR檢測；②病原菌的實時定量PCR檢測:採用TaqMan進行，利用亞洲韌皮桿菌核糖體蛋白基因16s核糖體DNA的特異性祀序列按照Primer Express軟體(ABI,USA)設計的探針和引物的組合(參考 Li 等 2006 的方法):HLBas (5 『-GTCGAGCGCGTATGCAA TACG-3』)、HLBr (5 『-CTACCTTTTTCTACGGGATAACGC-3』)、HLBp (5 『-AGACGGGTGAGTAACGCG-3』)，由上海生物工程公司合成引物，TaqMan螢光探針5'端、3'端分別用FAM報導螢光染料和TRAMA淬滅螢光染料標記，鋁膜袋閉光保存於_20°C備用。採用20 μ I反應體系，含有終濃度I X TaqMan qPCR Mix (AppliedBiosystems)、300nM(each)引物(HLBas and HLBr), 150nM 探針(HLBp)以及適量模板。PCR反應程序:在 ABI PRISM7500 (Applied BiosystemsjFoster City, CA)螢光定量PCR儀上進行，預擴增95°C，lmin ;然後95°C，3s，60°C，30s，40個循環；末次延伸72°C，7min ;在每個循環的延伸階段(60°C)同步多次採集螢光。
[0020](2)採集2~4cm至少包含兩張葉片的嚴重感染韌皮部桿菌含菌量的枝條，用5 μ g/ml的IBA和5 μ g/ml NAA處理枝條的基部4個小時,然後將處理後的扦插枝條種植在蛭石和砂各50%的培養基質中，置於25°C的遮陰、防蟲控溫溫室中，保持空氣相對溼度90%。
[0021](3)以有機土和蛭石的混合物為培養基基質，扦插後，每隔一個星期噴施相同濃度的NAA和IBA —次，共噴施兩次；並且配合施用營養液MS或MT。
[0022]從表1結果可以明顯看出，經過上述優化的再生長春花系統，可以有效促進帶病長春花枝條的生長，其再生率高達60%以上，而常規方法無法促進帶病長春花枝條的生長，再生率為0.1%。
[0023]表1:優化與常規長春花處理感病長春花枝條的再生效果比較
[0024]
【權利要求】
1.一種利用長春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，其特徵在於步驟如下: (1)長春花感病植株的培育:通過菟絲子的吸器與寄主植物維管束相連接，將感染柑橘黃龍病植株的韌皮部桿菌病原菌傳到種子培育的長春花，I~6個月後，長春花葉片出現感染韌皮部桿菌的症狀，經PCR檢測，確定長春花植株感病，保育在防蟲溫室中。 (2)長春花的扦插再生:在採集長春花感病枝條前I~12個小時，完全澆灌植株，採集I~IOcm至少包含兩張葉片的帶菌枝條，在枝條的基部用促根劑和植物生長調節劑蘸浸，種植在栽培基質中，置於10~35°C的遮陰、防蟲控溫溫室中，保持空氣相對溼度60~95% ； (3)長春花扦插再生條件的優化:調整培養基基質組成、噴施植物生長調節劑、促根劑和營養液； (4)藥物處理:取待篩選的藥物，0.1~1000mg/L浸泡處理嚴重感病的長春花枝條I~12小時，進行扦插、管理，扦插後I~4周，用相同的藥物再處理I~3次； (5)抗韌皮部桿菌藥物的篩選:2~6個月後，觀察不同藥物處理的成活再生生物量和檢測新生長枝條的韌皮部桿菌的含量，篩選出抗韌皮部桿菌藥物。
2.根據權利要求1所述的一種利用長春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，其特徵在於所述栽培基質為蛭石、或砂、或蛭石和砂、或蛭石和有機土的混合基質。其配比一般為蛭石和砂各50%，或蛭石和有機土各50%。
3.根據權利要求1或2所述的一種利用長春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，其特徵在於蛭石和砂的混合基質，其配比為蛭石和砂各50% ;蛭石和有機土的混合基質，其配比為蛭石和有機土各50%。
4.根據權利要求1所述的一種利用長春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，其特徵在於植物生長調節劑一般為NAA或 /和IBA。
5.根據權利要求4所述的一種利用長春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，其特徵在於植物生長調節劑NAA和IBA的使用濃度各為2~16 μ g/ml。
6.根據權利要求1所述的一種利用長春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，其特徵在於長春花扦插再生過程中，噴施 的營養液為MS或MT。
【文檔編號】A01G1/00GK103798012SQ201310691324
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年12月12日 優先權日:2013年12月12日
【發明者】張木清 申請人:廣西大學