一種防治作物土傳病害生防菌劑的製備方法及其應用的製作方法

2023-12-12 19:44:22

專利名稱：一種防治作物土傳病害生防菌劑的製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生防菌劑，特別是一種用於防治作物土傳病害的木黴菌生物農藥的製備方法及其與化學殺菌劑惡黴靈的協同應用。
背景技術：
隨著越來越多有毒化學農藥逐漸被限制使用，世界各國都在加大生物農藥的研發力度，研製、開發微生物農藥已成為勢在必行。木黴攝iTrichoderma ririofe)作為一類有重要生防價值的拮抗性真菌，早在20世紀30年代就已經發現對植物病原真菌有拮抗作用，其作用機制包括產生抗生素、重寄生作用、溶菌作用、競爭作用等。木黴菌強烈的競爭及生存能力在抑制病原菌尤其是土傳病害的過程中起著重要作用，是一種很有開發利用價值的生防菌。目前國際上已開發註冊有木黴菌產品，但由於諸如產品性能不穩定，孢子壽命短、生防活性低等各種技術原因，尤其是施入土壤後受到各種化學因子的影響使之不能在作物根部定植形成有效群體，影響了該類產品在生產上的應用。近年韓國學者通過提取和分離土壤中有益微生物和在土壤中添加營養物質以改善農作物種植的土壤環鏡，抑制土壤中致病菌；加拿大學者利用多種化學和生物處理方法協同改善農田土壤環境，防治土傳病害。國內已有研究表明木黴菌與化學殺菌劑三唑酮配合使用可提高西瓜根際木黴菌的種群數量，並削弱根際尖孢鐮刀菌。本實驗室多年的研究也表明木黴菌與某些低劑量殺菌劑如敵克松、五氯硝基苯結合使用，不僅有助於保持或增強生防菌的競爭活力，同時可削弱病菌的侵染活性，產生明顯的協同增效作用。殺菌劑惡黴靈高效、低毒、無公害，對人、畜、魚、鳥類均有較好的安全性，能抑制許多植物病原真菌菌絲體的正常生長或直接殺滅病菌，又能促進植物生長。為目前生產上防治土傳病害的高效殺菌劑，對土壤真菌包括鐮刀菌、絲核菌、腐黴菌、柱孢菌、伏革菌等病原菌引起的多種作物枯萎病、立枯病、猝倒病、菌核病、爛秧及慪根等連作重茬障礙有特效。經本發明多年試驗研究發現，惡黴靈在正常田間使用濃度範圍內對木黴菌具有刺激生長作用，且可促進作物根系發育，利用惡黴靈對生防木黴菌的敏感性差異與木黴菌協同施用，將成為提高作物土傳病害防治效果的重要手段，可解決木黴菌生物防治作用不穩定之不足。

發明內容
本發明的目的是提供一種用於防治作物土傳病害的木黴菌生防菌劑的製備方法及其與殺菌劑的協同應用技術。與其它發明不同的是，本發明木黴菌製劑除可直接用於防治作物土傳病害外，還可與殺菌劑惡黴靈協同應用。本發明通過多年大量研究發現大多數木黴菌具有強烈的競爭生存能力及對土壤中病原菌的重寄生作用，而惡黴靈對大多數木黴菌具有刺激生長作用，木黴菌生防製劑與惡黴靈同時施用具有協同增效作用。

本發明的目的是通過如下技術方案實現的:
所採用的生防菌取自作物根表土壤的木黴菌，經純化後轉移至試管斜面內作母菌劑，在三角瓶內振蕩培養為液體菌種，再與營養基質草炭粉、秸杆粉、樹葉粉及孢子生長促進劑進行固體發酵使其產生分生孢子，將載有大量木黴菌孢子的發酵產物與載體混合後製成木黴菌生防製劑，在田間可與殺菌劑惡黴靈同時施用具有顯著協同增效作用。所述防治作物土傳病害生防菌劑按如下步驟製備而成:
1、斜面母菌種的製備:取作物根表土壤5-10克，加無菌水1000倍成稀釋液；
取馬鈴薯150-200克、葡萄糖15-20克、孟加拉紅0.04-0.07克、硫酸鏈黴素0.03-0.04克、惡黴靈0.1-0.2克、瓊脂17-20克、水1000毫升製成菌種培養液；將稀釋液與菌種培養液按1: 9的重量比例一起倒入培養皿內製成平板，25-28°C下培養48小時，經分離獲得木黴菌菌株，經純化後轉移至試管斜面內作斜面母菌種；
2、二級菌種的製備:取馬鈴薯150-200克、葡萄糖或蔗糖15-20克、水1000毫升，配製成二級發酵培養液，調PH值為6-8，分裝在250-500毫升三角瓶中，裝液量為100-200毫升，在121°C下滅菌30-40分鐘，接入斜面母菌種，搖床轉速為150-200轉/分，發酵溫度26-30°C，發酵時間為2-4天，得到大量發散的絮狀菌絲及分散的分生孢子二級菌種；
3、固體發酵:所採用的固體發酵培養基成分為:培養料草炭或秸杆粉或樹葉粉28-40克、稻殼10-12克、水50-60克、磷酸二氫鉀0.1-0.2克、硫酸鎂0.1-0.2克、硫酸鈣0.1-0.2克；先將無機鹽溶入水中，再將培養料與水充分混合後製成固體發酵培養基，固體發酵培養基裝入耐高溫塑膠袋或發酵瓶中，在120°C下滅菌70-90分鐘，接入重量比例5-10%的二級菌種，控制發酵溫度為25-30°C，發酵時間4-6天，至培養料變成綠色即木黴菌分生孢子；
4、作物土傳病害生防菌劑的製備:將滿載木黴菌孢子的固體培養料經常溫乾燥後，用萬能粉碎機粉碎成高濃度木黴菌孢子粉，取重量比例為30-49.99%孢子粉與重量比例為50-69.99%輕質碳酸鈣或硅藻土，再加入重量比例為0.01%的惡黴靈作為增效劑，充分混合後製成木黴囷 製劑。5.生防菌劑的應用:將木黴菌生防菌劑200-400倍用於防治作物土傳病害，並可與殺菌劑惡黴靈4000-5000倍協同施用。施用方法為床面拌土或浸蘸種苗或生長期灌根。本發明的優點在於:
1.從作物根表得到木黴菌菌株經發酵製成孢子製劑，製作方法簡單，
適合於不同規模生產。2.木黴菌固體發酵原料為草炭粉、秸杆粉和樹葉粉，來源豐富，價格低廉，同時又是設施蔬菜栽培及防治由尖孢鐮刀菌為主的土傳病害引起的連作障礙的土壤改良劑，與木黴菌混合培養製成生防製劑施入土壤，既有利於改善土壤環境，又有利於菌絲在土壤中的伸展蔓延，在木黴菌大量繁殖的過程中抑制土壤致病菌的生長，同時解決土傳病和連作障礙問題。3.本發明製備的木黴菌生防製劑可與殺菌劑惡黴靈複合施用，二者具有顯著協同增效作用，可防治多種作物土傳病害。惡黴靈是一種內吸性殺菌劑、同時又是一種土壤處理齊U、植物生長調節劑，其作用機理獨特，並具有促進作物根系生長發育、生根壯苗作用。木黴菌與惡黴靈結合既能抑制病原菌萌發，又能促進根系生長，有利於木黴菌在作物根系的繁衍，具有防病增產的雙重功能。按照本發明提供的木黴菌，通過人工培養後又施入於作物根圍，並隨著根系的生長在土壤進一步繁衍，形成有益木黴菌在土壤中的良性循環，與惡黴靈一起達到對土傳病害的持續控制，無殘留，無汙染，對大棚黃瓜、西瓜、甜瓜及棚下人參、西洋參等土傳病害防治效果達78%以上。本發明適用於大多數木黴菌株，製作方法簡單，省水省電，適合於不同規模生產，市場前景廣闊。
具體實施例方式以下結合具體的實施例對本發明的技術方案作進一步描述。實施例1
1.斜面母菌種的製備:取作物根表土壤5克，加無菌水5千克製成稀釋液；取馬鈴薯150克、葡萄糖20克、孟加拉紅0.04克、硫酸鏈黴素0.03克、惡黴靈0.1克、瓊脂20克、水1000毫升製成菌種培養液；將稀釋液與菌種培養液按1: 9的重量比例一起倒入培養皿內製成平板，25°C培養48小時，經分離獲得木黴菌菌株，經純化後轉移至試管斜面內作斜面母菌種；
2.二級菌種的製備:取馬鈴薯150克、葡萄糖或蔗糖20克、水1000毫升，配製成二級發酵培養液，調PH值為6，分裝在250毫升三角瓶中，裝液量為100毫升，在121 °C下滅菌30分鐘，接入斜面母菌種，搖床轉速為150轉/分，發酵溫度26°C，發酵時間為4天，得到大量發散的絮狀菌絲及分散的分生孢子二級菌種；
3.固體發酵:所採用的固體發酵培養基成分為:培養料為草炭或秸杆粉或樹葉粉40克、稻殼10克、水50克、磷酸二氫鉀0.1克、硫酸鎂0.2克、硫酸鈣0.15克；製作方法是先將無機鹽溶入水中，再將培養料與水充分混合後製成固體培養基，裝入耐高溫塑膠袋或發酵瓶中，在120°C下滅菌70分鐘，接入重量百分比為5%的二級菌種，控制發酵溫度為25°C，發酵時間6天，至培養料變成綠色即木黴菌分生孢子；
4.生防菌劑的製備:將滿載 木黴菌孢子的固體培養料經常溫乾燥後，用萬能粉碎機粉碎成高濃度木黴菌孢子粉，取重量比例為30%孢子粉與重量比例為69.99%硅藻土，再加入重量比例為0.01%的惡黴靈作為增效劑，充分混合後製成木黴菌製劑。用於黃瓜枯萎病防治結果表明:在黃瓜播種時以木黴菌製劑200倍拌土、與惡黴靈4000倍拌土同時施用，裝營養缽育苗，4葉期再以木黴菌製劑200倍兌水、與惡黴靈4000倍兌水同時施用灌根一次，並分別以單用木黴菌製劑和惡黴靈做對照，其防治效果分別為94.23%,79.34%和76.6%,複合處理比單獨處理增加防效14.89%和17.63%。用於西瓜枯委病防治結果表明:在西瓜播種時以木黴囷製劑200倍祥土與惡黴靈4000倍拌土同時施用，裝營養缽育苗，4葉期再以木黴菌製劑200倍兌水、與惡黴靈4000倍兌水同時施用灌根一次，並分別以單用木黴菌製劑和惡黴靈做對照，其防治效果分別為88.45%,76.67%和79.53%,複合處理比單獨處理增加防效11.78%和8.92%。實施例2
1.斜面母菌種的製備:取作物根表土壤7.5克，加無菌水7.5千克，製成稀釋液；取馬鈴薯175克、葡萄糖17.5克、孟加拉紅0.05克、硫酸鏈黴素0.035克、惡黴靈0.15克、瓊脂18克、水1000毫升製成菌種培養液；將稀釋液與菌種培養液按1: 9的重量比例一起倒入培養皿內製成平板，26°C下培養48小時，經分離獲得木黴菌菌株，經純化後轉移至試管斜面內作斜面母菌種。
2.二級菌種的製備:取馬鈴薯170克、葡萄糖或蔗糖18克、水1000毫升，配製成二級發酵培養液，調PH值為7，分裝在250毫升三角瓶中，裝液量為150毫升，在121 °C下滅菌30分鐘，接入斜面母菌種，搖床轉速為170轉/分，發酵溫度28°C，發酵時間為3天，得到大量發散的絮狀菌絲及分散的分生孢子二級菌種。
3.固體發酵:所採用的固體發酵培養基成分為:培養料草炭或秸杆粉或樹葉粉28克、稻殼12克、水60克、磷酸二氫鉀0.2克、硫酸鎂0.15克、硫酸鈣0.1克。製作方法是先將無機鹽溶入水中，再將培養料與水充分混合後製成固體培養基，裝入耐高溫塑膠袋或發酵瓶中，在120°C下滅菌80分鐘，按重量百分比接入8%的二級菌種，控制發酵溫度為27°C，發酵時間5天，至培養料變成綠色即木黴菌分生孢子。4.生防菌劑的製備:將滿載木黴菌孢子的固體培養料經常溫乾燥後，用萬能粉碎機粉碎成高濃度木黴菌孢子粉，取重量比例為40%孢子粉與重量比例為59.99%輕質碳酸鈣，再加入重量比例為0.01%的惡黴靈作為增效劑，充分混合後製成木黴菌製劑。用於甜瓜枯萎病防治結果表明:在甜瓜播種時以木黴菌製劑200倍拌土與惡黴靈4000倍拌土同時施用，裝營養缽育苗，4葉期再以木黴菌製劑200倍兌水、與惡黴靈4000倍兌水同時施用灌根一次，並分別以單用木黴菌製劑和惡黴靈做對照，其防治效果分別為88.27%,74.34%和83.41%,複合處理比單獨處理增加防效13.93%和4.86%。用於辣椒枯萎病防治結果表明:在辣椒移栽時用木黴菌製劑300倍拌土與惡黴靈5000倍拌土同時施用，採用上鋪下墊辦法穴施，一個月後再以木黴菌製劑300倍兌水、與惡黴靈5000倍兌水同時施用灌根一次，並分別以單用木黴菌製劑和惡黴靈做對照，其防治效果分別為78.36%,69.76%和76.23%,複合處理比單獨處理增加防效8.6%和2.13%。實施例3 1.斜面母菌種的製備:取作物根表土壤10克，加無菌水10千克，製成稀釋液；取馬鈴薯200克、葡萄糖15克、孟加拉紅0.07克、硫酸鏈黴素0.04克、惡黴靈0.2克、瓊脂17克、水1000毫升製成菌種培養液；將稀釋液與菌種培養液按1: 9的重量比例一起倒入培養皿內製成平板，28°C下培養48小時，經分離獲得木黴菌菌株，經純化後轉移至試管斜面內作斜面母菌種。2.二級菌種的製備:取馬鈴薯200克、葡萄糖或蔗糖15克、水1000毫升，配製成二級發酵培養液，調PH值為8，分裝在500毫升三角瓶中，裝液量為200毫升，在121 °C下滅菌40分鐘，接入斜面母菌種，搖床轉速為200轉/分，發酵溫度30°C，發酵時間為2天，得到大量發散的絮狀菌絲及分散的分生孢子二級菌種。
3.固體發酵:所採用的固體發酵培養基成分為:培養料草炭或秸杆粉或樹葉粉34克、稻殼11克、水55克、磷酸二氫鉀0.15克、硫酸鎂0.1克、硫酸鈣0.2克。製作方法是先將無機鹽溶入水中，再將培養料與水充分混合後製成固體培養基，裝入耐高溫塑膠袋或發酵瓶中，在120°C下滅菌90分鐘，按重量百分比接入10%的二級菌種，控制發酵溫度為30°C，發酵時間4天，至培養料變成綠色即木黴菌分生孢子。4.生防菌劑的製備:將滿載木黴菌孢子的固體培養料經常溫乾燥後，用萬能粉碎機粉碎成高濃度木黴菌孢子粉，取重量比例為49.99%孢子粉與重量比例為50%輕質碳酸鈣，再加入重量比例為0.01%惡黴靈作為增效劑，充分混合後製成木黴菌製劑。用於人參鏽腐病防治結果表明:在2年苗移栽時先用木黴菌製劑每簾(10平方米)200克均勻混入參床耕作層，展葉後再以木黴菌製劑200倍加惡黴靈5000倍兌水灌根一次，以單用木黴菌製劑做對照，其防治效果分別為87.97%和71.15%，複合處理比單獨處理增加防效16.82%，優質人參比率提高27.22%。用於人參根腐病防治結果表明:在2年苗移栽時先用木黴菌製劑每簾(10平方米)250克均勻混入參床，展葉後再以木黴菌製劑400倍加惡黴靈5000倍兌水灌根一次，以單用惡黴靈製劑做對照，其防治效果分別為91.43%和81.89%，複合處理比單獨處理增加防效
9.54%ο木黴菌與惡黴靈同時施用具有顯著協同增效作用。除了本發明的木黴菌製劑外，還可採用其他多種木黴菌製劑與殺菌劑惡黴靈協同施用。木黴菌製劑中還可採用多種其他固體培養基，只要能夠提供木黴菌生長並同時具有改良土壤作用即可。參考文獻:
1.生防木黴菌的生物安全性檢測.中國農業科學，2006(4)
2.綠色木黴菌T23對黃瓜枯萎病防治效果及防禦酶活性影響.植物病理學報，2005 (2)
3.幾種常用土壤殺菌劑對木黴菌防治甜瓜枯萎病效果的影響.中國蔬菜，2005(8)
4.五種殺菌劑對木 黴菌及尖孢鐮刀菌的毒力測定.植物保護.2005(3)
權利要求
1.一種防治作物土傳病害生防菌劑的製備方法，其特徵在於包括如下具體步驟: (1)斜面母菌種的製備:取作物根表土壤5-10克，加無菌水1000倍成稀釋液； 取馬鈴薯150-200克、葡萄糖15-20克、孟加拉紅0.04-0.07克、硫酸鏈黴素0.03-0.04克、惡黴靈0.1-0.2克、瓊脂17-20克、水1000毫升製成菌種培養液；將稀釋液與菌種培養液按1: 9的重量比例一起倒入培養皿內製成平板，25-28°C下培養48小時，經分離獲得木黴菌菌株，經純化後轉移至試管斜面內作斜面母菌種； (2)二級菌種的製備:取馬鈴薯150-200克、葡萄糖或蔗糖15-20克、水1000毫升，配製成二級發酵培養液，調PH值為6-8，分裝在250-500毫升三角瓶中，裝液量為100-200毫升，在121°C下滅菌30-40分鐘，接入斜面母菌種，搖床轉速為150-200轉/分，發酵溫度26-30°C，發酵時間為2-4天，得到大量發散的絮狀菌絲及分散的分生孢子二級菌種； (3)固體發酵:所採用的固體發酵培養基成分為:培養料草炭或秸杆粉或樹葉粉28-40克、稻殼10-12克、水50-60克、磷酸二氫鉀0.1-0.2克、硫酸鎂0.1-0.2克、硫酸鈣0.1-0.2克；先將無機鹽溶入水中，再將培養料與水充分混合後製成固體發酵培養基，固體發酵培養基裝入耐高溫塑膠袋或發酵瓶中，在120°C下滅菌70-90分鐘，接入重量比例5-10%的二級菌種，控制發酵溫度為25-30°C，發酵時間4-6天，至培養料變成綠色即木黴菌分生孢子； (4)作物土傳病害生防菌劑的製備:將滿載木黴菌孢子的固體培養料經常溫乾燥後，用萬能粉碎機粉碎成高濃度木黴菌孢子粉，取重量比例為30-49.99%孢子粉與重量比例為50-69.99%輕質碳酸鈣或硅藻土，再加入重量比例為0.01%的惡黴靈作為增效劑，充分混合後製成木黴囷製劑。
2.一種如權利要求1所 述的防治作物土傳病害生防菌劑的應用，其特徵在於將權利要求I製備的木黴菌生防菌劑200-400倍用於防治作物土傳病害，並可與殺菌劑惡黴靈4000-5000倍協同施用，其施用方法為床面拌土或浸蘸種苗或生長期灌根。
全文摘要
本發明提供一種用於防治作物土傳病害的生防菌劑的製備方法及其應用。採用木黴菌株(Trichodermaviride)為母菌劑，以草炭粉、秸稈粉和樹葉粉，硅藻土和輕質碳酸鈣為載體製成生防菌製劑，並以微量殺菌劑惡黴靈作為增效劑。用於防治由鐮孢菌等病原真菌引起的作物土傳病害。本發明的特徵在於利用木黴菌對惡黴靈的敏感性差異將木黴菌生防菌劑與惡黴靈協同施用，具有既能抑制土壤中病原菌萌發，又能促進木黴菌的繁殖，同時促進作物根系生長的多重協同功效。
文檔編號C12R1/885GK103141519SQ201310066268
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月4日 優先權日2013年3月4日
發明者鄭雅楠, 魏漢蓮, 楊長成, 高增貴, 李可強, 關昕, 莊敬華 申請人:瀋陽農業大學