κ‑酪蛋白來源生物活性肽的製備和應用的製作方法

2023-12-12 14:05:02 1

本申請是原申請的分案申請，原申請的申請日為：2014.12.09；申請號為：2014108094134；發明創造名稱為：κ-酪蛋白的生物活性多肽及其製備和應用。

本發明涉及蛋白領域，具體涉及多種來源於κ-酪蛋白的生物活性多肽及其製備和應用。

背景技術：

由於生物活性肽作為促進健康的生物活性成分，具有傳遞生理信息，調節生理功能的作用，對於人體的神經、消化、生殖、生長、運動、代謝、循環等系統的正常生理活動的維持非常重要。它們不僅具有抗病毒、細菌、抗高血壓、降膽固醇等作用，而且作為免疫調節劑具有調節免疫反應、抗腫瘤等功能；能夠清除自由基具有延緩衰老的功效，是當前國際食品界最熱門的研究課題和極具發展前景的功能因子。各種活性肽常作為功能食品添加成分用於食品的實踐生產，特別是在乳飲料、食品添加劑的應用方面已經取得良好效果。乳源性生物活性肽生物的功能及對消費者的健康的影響正備受重視。

近年來，越來越多的科學研究表明很多來源於生物蛋白的小肽具有多種生物學活性，如激素作用、免疫調節、抗血栓、抗高血壓、降膽固醇、抑菌、抗病毒、抗癌作用等。同時，研究發現小肽可以被人體更好地吸收和利用，改變了傳統的蛋白質只能被降解成胺基酸才能被吸收利用的觀點。在眾多生物蛋白中各種牛乳蛋白是非常重要的生物活性多肽來源之一，它們被乳酸菌分解利用，並發生了一系列生理生化反應，使蛋白質變為多肽或者游離的胺基酸，最終被人體消化吸收或通過小腸上皮細胞的吸收轉運直接進入人體的血液循環，發揮其生物活性作用。

因此，這些生物活性小肽不僅成為篩選藥物的天然資源寶庫，也是功能性食品工業的主要原料成分。目前，生物活性肽的製備及其應用開發已經成為世界範圍內研究的熱點。

免疫活性肽是繼阿片肽發現後首次從乳中獲得並證明其生理活性的一類生物活性肽。1981年，jolles等人首次發現，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，從水解物中得到一種免疫活性肽段，其胺基酸序列為val-glu-pro-ile-pro-tyr，該短肽被證明在體外實驗中能夠增強小鼠腹腔巨噬細胞對綿羊血紅細胞的吞噬作用，靜脈注射，則能增強小鼠對肺炎克氏杆感染的抵抗能力。elitsur等人經胃蛋白酶處理酪蛋白得到arg-tyr-leu-gly-tyr-leu-glu和arg-tyr-leu-gly-tyr-leu，研究證明該兩短肽不僅具有阿片樣活性，也具有免疫調節活性，可增強淋巴細胞增殖，提高自然殺傷細胞(nk)能力，促進噬中性白細胞的移動。張少輝等人利用瑞士乳桿菌發酵脫脂乳獲得了生物活性多肽qepvl及其降解產物qepv，經過體外抗氧化實驗、體外免疫功能促進實驗，驗證了多肽qepv具有較好的抗氧化生物學活性和促進細胞免疫的活性，一方面能夠清除機體內的自由基，減少自由基對人體的傷害；另一方面，生物活性多肽qepvl和qepv還能夠增強機體免疫力，增強淋巴細胞、巨噬細胞的增殖能力，使巨噬細胞一氧化氮誘生量增加，並促巨噬細胞分泌細胞因子。

儘管牛乳蛋白內隱含有許多具有生物活性的肽序列，但這些生物活性肽序列只有通過一定的手段將其釋放出來才能發揮作用。獲取乳蛋白源活性肽的主要手段有兩種：發酵，利用微生物(乳酸菌)發酵乳源蛋白獲取；酶解，包括來自動物的消化道酶和來自植物和微生物的蛋白酶。

研究結果表明乳源性生物活性肽作為一類小分子物質，以其分子量低、活性強、用量少的獨特優勢，已越來越多的引起人們的重視。所以它們不僅僅作為功能性食品原料用於各種功能性食品的製造，而且作為免疫調節劑具有調節免疫反應、抗腫瘤等功能；能夠清除自由基具有延緩衰老的功效。此外，多數乳源性生物活性肽能夠抵抗胃腸道的消化，在小腸內以完整的形式被機體吸收，而不必被分解成單個胺基酸，具有易消化吸收，食用安全性極高。因此乳源性生物活性肽的能夠提高機體抵禦外界不良因素的刺激、降低機體發病率等功能特性備受重視，有望成為具有清除自由基、減少患癌機率和延緩衰老的非藥物性物質原料，在功能性食品和醫藥領域具有非常廣闊的應用前景，今後必將成為國際食品界和生物醫藥產業界的最熱門的研究課題，為提高人類健康水平、不得病或者說少得病、延緩衰老、延長壽命發揮重要的作用。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供：

一種分離的生物活性多肽ntvpa，其包括

(a)由asn-thr-val-pro-ala(seqidno：1)所示的胺基酸組成的多肽；

(b)或在seqidno：1所示的胺基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有同等活性的由(a)衍生的多肽；

一種分離的生物活性多肽vvtil，其包括

(c)由val-val-thr-ile-leu(seqidno：2)所示的胺基酸組成的多肽；

(d)或在seqidno：2所示的胺基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有同等活性的由(c)衍生的多肽；

一種分離的生物活性多肽pkknq，其包括

(e)由pro-lys-lys-asn-gln(seqidno：3)所示的胺基酸組成的多肽；

(f)或在seqidno：3所示的胺基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有同等活性的由(e)衍生的多肽。

較優的，所述生物活性多肽的來源為乳源性。

κ-酪蛋白的胺基酸序列為既有技術，具體胺基酸序列如seqidno:4所示：

metmetlysserphepheleuvalvalthrileleualaleuthrleuglyalaglnglu

glnasnglnglugluproileargcysglulysaspgluargphepheserasplysile

alalystyrileproileglntyrvalleuserargtyrprosertyrglyleuasntyrtyr

glnglnlysprovalalaleuileasnasnglnpheleuprotyrprotyrtyralalys

proalaalavalargserproalaglnileleuglntrpglnvalleuserasnthrval

proalalyssercysglnalaglnprothrthrmetalaarghisprohisprohisleu

serphemetalaileproprolyslysasnglnasplysthrgluileprothrileasn

thrilealaserglygluprothrserthrserthrprothrthrgluserthrvalleu

glyaspserprogluvalilegluserproprogluileasnthrvalglnvalthrser

thralaval。

本發明的生物活性多肽ntvpa為乳源性，具體來源於κ酪蛋白，並且為κ酪蛋白(seqidno:4)第102～106位的胺基酸殘基。

本發明的生物活性多肽vvtil為乳源性，具體來源於κ酪蛋白(seqidno:4)第8～12位的胺基酸殘基。

本發明的生物活性多肽pkknq為乳源性，具體來源於κ酪蛋白(seqidno:4)第131～135位的胺基酸殘基。

較優的，所述生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq均具有體外抗氧化活性和增強機體免疫力的功能。

本發明的生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq均可以通過基因工程的方法和化學方法人工合成，也可以從乳製品中通過分離純化、酶降解的方法獲得。

本發明還公開了編碼前述生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq的核苷酸片段。

κ-酪蛋白的胺基酸序列以及核苷酸序列為既有技術，編碼κ-酪蛋白第102～106位胺基酸殘基的核苷酸片段能編碼成熟的生物活性多肽ntvpa，編碼κ-酪蛋白第8～12位胺基酸殘基的核苷酸片段能編碼成熟的生物活性多肽vvtil，編碼κ-酪蛋白第131～135位胺基酸殘基的核苷酸片段能編碼成熟的生物活性多肽pkknq。

本發明第二方面公開了前述生物活性多肽的製備方法，步驟如下：

1)發酵：將瑞士乳桿菌(lactobacillushelveticus)添加到脫脂乳中進行厭氧發酵，獲得瑞士乳桿菌發酵乳；

2)多肽的粗提：對步驟1)的瑞士乳桿菌發酵乳進行低溫離心分離，取上清液；

3)多肽的純化：

a.對步驟2)的上清液進行超濾處理，收集濾液；

b.固相萃取柱分離：收集的濾液採用waterssep-pakc18固相萃取柱萃取，收集生物活性多肽混合物；

4)多肽的消化及穩定性：採用兩步酶解法酶解步驟3)的生物活性多肽混合物，獲得被消化後的生物活性多肽混合物；第一步酶解所採用的酶為胃蛋白酶，第二步酶解所採用的酶為胰酶。

本發明所述脫脂乳為經過脫脂處理的牛乳，通常脫脂乳中脂肪含量小於0.1％。

較優的，步驟1)中，瑞士乳桿菌為瑞士乳桿菌(lactobacillushelveticus，cicc6024)。

較優的，步驟1)中，所述厭氧發酵的條件為：發酵溫度36～38℃，發酵培養6～8h；更優選發酵溫度37℃，發酵培養7h。

較優的，步驟2)中，所述低溫離心的條件為：4℃，8000～10000rpm，離心15～30min。

較優的，步驟3)a中，所述超濾處理所採用的是截留分子量分別為3kda的超濾管。

更優的，步驟3)a中，所述超濾處理過程中，轉速為4800r/min，時間為30min，離心溫度為4℃。

較優的，步驟3)b中，固相萃取柱分離，具體方法為：活化和平衡waterssep-pakc18固相萃取柱；將步驟3)a中收集的濾液進行稀釋後上樣，採用洗脫液洗脫，收集所得到的洗脫液，即包含生物活性多肽混合物。

較優的，步驟3)b中，固相萃取柱分離法中，所採用的洗脫液為甲醇和ddh2o的混合液，所述甲醇和ddh2o的混合液中甲醇與ddh2o的體積比為80:20，所述甲醇和ddh2o的混合液中含有0.1％(v/v)的甲酸。

較優的，步驟3)b中，固相萃取柱分離法中，採用甲醇活化waterssep-pakc18固相萃取柱；優選2ml甲醇。

較優的，步驟3)b中，固相萃取柱分離法中，採用ddh2o平衡waterssep-pakc18固相萃取柱；優選1mlddh2o。

較優的，步驟3)b中，固相萃取柱分離法中，將步驟3)a中收集的濾液進行稀釋50倍後上樣，採用400ul洗脫液洗脫。

較優的，步驟3)b固相萃取柱分離法中，先採用2ml甲醇活化waterssep-pakc18固相萃取柱，採用1mlddh2o平衡waterssep-pakc18固相萃取柱；上樣樣品為2ml；將步驟3)a中收集的濾液稀釋50倍，採用400μl洗脫液洗脫。

較優的，步驟4)所述兩步酶解法具體步驟為將步驟3)得到的含有多肽的混合物溶於滅菌去離子水中，調節ph值為2.0±0.1,再加入胃蛋白酶，獲得反應液，於37±0.5℃的恆溫水浴中保溫反應90min，獲得第一步酶解液；將第一步酶解液的ph值調整為7.5±0.1，並加入胰酶，於37±0.5℃的恆溫水浴中保溫反應150min，獲得第二步酶解液；將第二步酶解液採用沸水浴法使酶失活，時間為5min，獲得酶解產物；採用冷凍乾燥獲得粉狀酶解產物。

更優選的，所述沸水浴法為95℃水浴法。

較優的，步驟4)所述胃蛋白酶的添加量為胃蛋白酶10～30mg/g底物；所述胰酶的添加量為胰酶30～50mg/g底物。

更優的，步驟4)所述胃蛋白酶的添加量為胃蛋白酶20mg/g底物；所述胰酶的添加量為胰酶40mg/g底物。

較優的，提取分子量為501.26da的多肽的洗脫峰，即為生物活性多肽ntvpa；提取分子量為544.38da的多肽的洗脫峰，即為生物活性多肽vvtil；提取分子量為614.37da的多肽的洗脫峰，即為生物活性多肽pkknq。

在本發明中，已知ntvpa的分子量，提取分子大小為501.26da的洗脫峰，即為本發明的生物活性多肽ntvpa。具體的，本發明ntvpa分子大小為501.26da的洗脫峰其保留時間為1.93min。

在本發明中，已知vvtil的分子量，提取分子大小為544.38da的洗脫峰，即為本發明的生物活性多肽vvtil。具體的，本發明ntvpa分子大小為544.38da的洗脫峰其保留時間為7.30min。

在本發明中，已知pkknq的分子量，提取分子大小為614.37da的洗脫峰，即為本發明的生物活性多肽pkknq。具體的，本發明pkknq分子大小為614.37da的洗脫峰其保留時間為10.36min。

本發明第三方面公開了前述生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq或其衍生物在製備抗氧化和/或增強機體免疫力的食品、保健品及藥物中的應用。

本發明的生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq、或其衍生物可以用於酸奶等乳製品以及各種食品、減少自由基對皮膚傷害的化妝品；並且由於本發明的生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq能夠通過胃腸道直接吸收不被降解，因此可以用於製備提高免疫力的保健品，或者用於製備具有抗氧化和/或增強機體免疫力的藥物。

本發明第四方面公開了一種抗氧化藥物，包含前述生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq或前述生物活性多肽的衍生物。

本發明第五方面公開了一種增強機體免疫力藥物，包含前述生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq或前述生物活性多肽的衍生物。

本發明第六方面公開了一種潛在的延緩衰老/抗衰老的保健產品，包含前述生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq或前述生物活性多肽的衍生物。

所述多肽的衍生物，是指在多肽的胺基酸側鏈基團上、氨基端或羧基端進行羥基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙醯化、磷酸化、酯化或糖基化等修飾，得到的多肽衍生物。

本發明生物活性多肽的有益效果為：本發明的乳源性生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq具有很好的抗氧化活性和促進機體免疫力活性；一方面能夠清除機體內的自由基，減少自由基對人體的傷害；另一方面，本發明的生物活性多肽還能夠增強機體免疫力，增強巨噬細胞的吞噬功能，提高機體抵禦外界病原體感染的能力，降低機體發病率，而且模擬消化實驗結果表明發現的三條生物活性多肽在通常的動物體內消化條件下穩定，不會被進一步降解，能夠被動物機體直接吸收利用發揮其具有的生物活性功能，對開發具有抗氧化功能、增強免疫功能、延緩衰老的食品、保健品和藥品具有十分重要的意義和應用價值。

附圖說明

圖1：瑞士乳桿菌發酵乳消化產物的洗脫圖譜

圖2：質量色譜提取圖(m/z＝501.26)

圖3：質荷比為501.26的片段的一級質譜圖

圖4：質量色譜提取圖(m/z＝544.38)

圖5：質荷比為544.38的片段的一級質譜圖

圖6：質量色譜提取圖(m/z＝614.37)

圖7：質荷比為614.37的片段的一級質譜圖

圖8：質荷比為501.26的片段的二級質譜圖

圖9：質荷比為501.26預測得到的序列的az，by斷裂情況(ntvpa)

圖10：質荷比為544.38的片段的二級質譜圖

圖11：質荷比為544.38預測得到的序列的az，by斷裂情況(vvtil)

圖12：質荷比為614.37的片段的二級質譜圖

圖13：質荷比為614.37預測得到的序列的az，by斷裂情況(pkknq)

圖14：對照組質量色譜提取圖(m/z＝544.38)

圖15：對照組質荷比為544.38的片段的一級質譜圖

圖16：對照組質荷比為544.38的片段的二級質譜圖

圖17：對照組質荷比為544.38預測得到的序列的az，by斷裂情況(vvtil)

圖18：trolox標準曲線

具體實施方式

在進一步描述本發明具體實施方式之前，應理解，本發明的保護範圍不局限於下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發明的保護範圍。

當實施例給出數值範圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值範圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本發明。

除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法、檢測方法、製備方法均採用本技術領域常規的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養、重組dna技術及相關領域的常規技術。這些技術在現有文獻中已有完善說明，具體可參見sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

實施例1活性肽ntvpa、vvtil、pkknq的製備

一、瑞士乳桿菌發酵乳的製備

採用脫脂奶粉(紐西蘭nzmp牌脫脂奶粉)與水配置12wt％的脫脂乳(12wt％的脫脂乳的製備為將12g脫脂奶粉加入到88g水中，下同)。隨後，將購買的菌種活化即以2％的量接種到12％(w/v)的滅菌脫脂乳中培養，溫度37℃，培養時間7h，即完成瑞士乳桿菌的活化，連續活化2次，製得發酵乳，作為瑞士乳桿菌發酵乳發酵劑備用。

取10ml已製備的瑞士乳桿菌發酵劑接種到500ml已滅菌的12wt％脫脂乳中(接種率為2v/v％)，37℃發酵7小時後，攪開凝乳後，在4℃條件下保存，得到瑞士乳桿菌發酵乳。

二、生物活性多肽混合物的製得和確認

1.實驗方法

1)樣品處理

分別將前一步驟製備的瑞士乳桿菌發酵乳和對照發酵乳，以及12wt％的脫脂乳裝入離心管中進行低溫離心，離心條件為9000rpm/min，4℃，20min。離心後棄沉澱，取上清液。

將上清液分別倒入超濾管中，濾膜的截留分子量為3kda，超濾過程中，轉速為4800r/min，時間為30min，離心溫度為4℃。收集瑞士乳桿菌發酵乳的濾液，於-4℃冷凍保存。

將2ml超濾液稀釋50倍後固相萃取，用1mlc18小柱，2ml甲醇活化柱子，1mlddh2o平衡柱子，上樣樣品為2ml稀釋50倍後的濾液，最後400μl洗脫液洗脫，其中洗脫液為80:20v/v甲醇/水和0.1％v/v的甲酸。

將得到的洗脫液氮吹後凍幹成乾粉，後模擬胃腸道消化實驗：首先，採用滅菌去離子水溶解乾粉，在溶液中加入胃蛋白酶(購自sigma公司)，比例是每克樣品加入胃蛋白酶20mg，調節反應液的ph值至2.0，在37℃恆溫水浴中保溫90min；然後將反應液的ph值調整至7.5，加入胰酶(corolasepp，購自德國ab公司)，比例是每克樣品加入胰酶40mg，在37℃恆溫水浴中保溫150min；最後置於95℃水浴中加熱5min使酶失活。同時設置對照組，除不加入胃蛋白酶和胰蛋白酶外，在相同時間做相同的ph和溫度處理。將對照組和樣品組真空冷凍乾燥成粉末後，存儲於-80℃備用。

2)液質分析

液相色譜條件：

儀器：watersacquityuplc超高效液相色譜儀

色譜柱規格：cshc18色譜柱

流速：0.4ml/min

溫度：45℃

紫外檢測波長：220nm

進樣量：5μl

流動相a液：ddh2o

流動相b液：乙腈溶液

梯度條件：0min-2.5min保持99％a液，1％b液；2.5min-5minb液從1％變為5％，a液從99％變為95％；5min-10minb液從5％變為10％，a液從95％變為90％；10min-17min％b液從10％變為25％，a液從90％變為75％；17min-22min，b液從25％變為40％，a液從75％變為60％；22min-27min，b液從40％變為80％，a液從60％變為20％；27min-29min，b液從80％變為100％，a液為0％，保持2min；31min-31.5min，b液從100％變為5％，a液從0％變為95％；31.5min-32min，b液從5％變為1％，a液從95％變為99％；32min-34min，保持99％a液，1％b液。

質譜條件：

離子方式：es+

質量範圍(m/z)：50-2000

毛細管電壓(capillary)(kv)：3.0

採樣錐(v)：35.0

離子源溫度(℃))：105

去溶劑溫度(℃)：350

錐孔氣流量(l/hr)：50.0

去溶劑氣流(l/hr)：600.0

碰撞能量(ev)：6.0

碰撞氣流(ml/min)：0.6

掃描時間(sec)：0.26

內掃描時間(sec)：0.02

根據上述實驗條件，利用masslynx軟體分析，得到瑞士乳桿菌發酵乳消化產物中多肽物質保留時間和分子量，如表1所示，用masslynx軟體提取多肽的質量色譜提取圖、一級質譜圖，見圖2-7。

表1瑞士乳桿菌發酵乳消化產物中的多肽核質比

三、生物活性多肽的胺基酸序列確定方法

1.實驗方法

(1)牛乳來源κ-酪蛋白胺基酸序列庫的建立

κ-酪蛋白胺基酸序列通過biopep搜索得到，將搜索得到的酪蛋白胺基酸序列建成一個資料庫。

2)多肽質量的匹對

對uplc-ms分析得到的質量，在牛奶蛋白的胺基酸序列資料庫中進行搜索，得到相關的多肽序列。該步驟通過java程序和mysql資料庫實現，具體的要求如下：輸入由uplc-ms得到的質量，輸出質量誤差在±0.01內的多肽序列、該序列的質量、該序列的具體蛋白來源。

3)多肽序列的驗證

將得到的胺基酸序列通過masslynx軟體中的biolynx驗證，將預測得到多肽序列理論上的二級質譜圖與ms/ms得到的實際二級質譜圖對比，軟體通過二級質譜圖中主要的峰是否匹對成功，給出分值，來確認預測得到的多肽。二級質譜匹對圖和預測得到的序列的az，by斷裂情況圖見圖8-13所示。

2.實驗結果

經過驗證得到生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq，均為乳源性，具體來源於牛乳κ-酪蛋白，其中ntvpa為κ-酪蛋白第102～106位的胺基酸殘基，vvtil為κ-酪蛋白第8～12位的胺基酸殘基，pkknq為κ-酪蛋白第131～135位的胺基酸殘基，分別記為seqidno：1-3。

此外，通過對照組的實驗結果可知多肽ntvpa、pkknq均未在對照組的相同保留時間處出峰，即ntvpa、pkknq兩種都是經胃腸道模擬消化降解得到，並不存在於瑞士乳桿菌發酵乳中。而多肽vvtil在對照組的相同保留時間處出峰，如圖14～17所示，並且峰面積的改變不大，說明多肽vvtil是由瑞士乳桿菌分解牛乳中κ-酪蛋白得到的生物活性多肽，而且在消化酶的作用下相對穩定，經胃腸道模擬消化試驗後不易被降解。

實施例2生物活性肽的抗氧化活性實驗

採用清除自由基法(dpph·法)和總抗氧化能力法(abts法)，對實施例1得到的生物活性多肽的抗氧化活性進行了測試。

1、[dpph·]法測定生物活性肽的體外抗氧化活性

1)實驗試劑及儀器

試劑：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl[dpph·])，日本wako公司生產；甲醇，上海國藥公司提供；合成實施例1中得到的乳源性生物活性多肽。

主要儀器：pro200酶標儀，奧地利tecan公司產品；96孔細胞培養板，美國millipore公司製造；分析天平，meitelei-tolido公司產品。

2)實驗方法

(1)0.1mmol/l[dpph·]甲醇溶液

用分析天平稱取19.72mg[dpph·]溶於500ml甲醇溶液中，配製得到的0.1mmol/l[dpph·]甲醇溶液，錫紙避光保存，即配即用。

(2)[dpph·]法測定生物活性肽的抗氧化活性

在1.5mlep管中加入500μl濃度為0.1mmol/l[dpph·]甲醇溶液、按表2分別加入500μl不同濃度的待測樣品和去離子水作為空白對照。

待檢測樣品加樣完畢後，混合均勻，室溫靜置30min後取200微升至96孔板中，用酶標儀在517nm處檢測吸光值。按照下式計算自由基清除率，實驗結果見表1。

公式：[dpph·]自由基清除率＝(a0-as)/a0×100％

其中a0表示空白對照組的吸光值，as表示樣品組的吸光值。

表2dpph法測定生物活性多肽的總抗氧化能力結果

通過[dpph·]法對生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq體外總抗氧化活性進行了測定，發現多肽ntvpa具有清除自由基能力，其具體ic50(mg/ml)值見表2。根據抗氧化能力的標準可認定發明的生物活性多肽具有抗氧化能力。

2、abts法測定生物活性肽的體外抗氧化活性

1)實驗試劑及儀器

試劑：總抗氧化力試劑盒(abts法)，碧雲天公司生產；甲醇，上海國藥公司提供；合成實施例1中得到的乳源性生物活性多肽。

主要儀器：pro200酶標儀，奧地利tecan公司產品；96孔細胞培養板，美國millipore公司製造。

2)實驗方法

(1)abts工作液的配置

取40微升abts溶液與40微升氧化劑溶液配製成abts工作母液，配製後避光存放12-16小時後使用，配好的abts工作母液在室溫下避光存放，2-3天內穩定。使用前，把abts工作母液用pbs稀釋成abts工作液，大約40倍，要求abts工作液的吸光度減去相應的pbs空白對照後，a734為0.7±0.05。

(2)trolox標準曲線的製作

用樣品配製溶液稀釋標準品，把10mmtrolox標準溶液稀釋成0.005、0.01、0.03、0.05、0.1、0.25、0.5和1.0mm。在96孔板的每個檢測孔中加入200微升abts工作液，標準曲線檢測孔內加入10微升各種濃度的trolox標準溶液，輕輕混勻。室溫孵育4分鐘後，用酶標儀在734nm處測定吸光值。

trolox濃度與吸光值呈良好的正比關係，濃度越高，吸光值越低。本發明trolox標準曲線結果見圖14，標準曲線的線性關係良好，相關係數為0.9981，trolox標準曲線的精密度和準確度均符合檢測要求，可用於後續計算。

(3)abts法測定生物活性肽的抗氧化活性

在96孔板的每個檢測孔中加入200微升abts工作液，空白對照孔中加入10微升pbs溶液，樣品檢測孔內加入10微升各種樣品，輕輕混勻。室溫孵育4分鐘後，用酶標儀在734nm處測定吸光值。測定根據標準曲線計算出樣品的總抗氧化能力。總抗氧化能力表示方式以trolox標準溶液的濃度來表示。按照下式計算總抗氧化能力，實驗結果見表3：

表3abts法測定生物活性多肽的總抗氧化能力結果

通過總抗氧化能力法(abts法)對生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq體外總抗氧化活性進行了測定，發現生物活性多肽ntvpa具有較強的抗氧化能力：在濃度為5mg/ml情況下多肽ntvpa所對應的trolox濃度為1.0554mmol/l。因此，可認定發明的生物活性多肽ntvpa具有顯著的抗氧化能力，而vvtil、pkknq具有一定的抗氧化能力，但相對ntvpa較弱。

根據以上實驗結果說明來源於κ-酪蛋白的生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq具有抗氧化能力，能夠清除動物機體內的自由基，具有潛在的延緩衰老/抗衰老功能。

以上所述，僅為本發明的較佳實施例，上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而並非對本發明任何形式上和實質上的限制，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還將可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護範圍。凡熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，當可利用以上所揭示的技術內容而做出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發明的等效實施例；同時，凡依據本發明的實質技術對上述實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬於本發明的技術方案的範圍內。

sequencelisting

浙江輝肽生命健康科技有限公司

κ-酪蛋白來源生物活性肽的製備和應用

171880

4

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1

5

prt

artificial

ntvpa

1

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15

2

5

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vvtil

2

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15

3

5

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3

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15

4

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κ-酪蛋白

4

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151015

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202530

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