酶的演化和對組合和醫藥化學的用途的製作方法
2023-10-25 14:18:27
專利名稱：酶的演化和對組合和醫藥化學的用途的製作方法
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背景技術：
發明領域本發明涉及採用演化的酶酶促合成有機分子的組合文庫領域。本發明提供了酶文庫，它通過定向演化，能生物催化合成許多有機分子衍生物。可篩選該有機分子衍生物文庫，來鑑定活性化合物，如抗生素和其它治療劑，、除草劑和殺蟲劑等。
背景在發現藥物的過程中，優化前導化合物代表了眾多的挑戰之一。前導化合物通常缺乏完全的藥理功能，如高效、選擇性、低毒性、生物利用率等所需的一些藥理性質。因此，對於實現具有理想性質的完整組合的優化藥物常常需要對前導化合物作額外修飾。傳統的衍生方法主要依賴於經驗來指導醫藥化學師選擇要合成和測試的化學類似物。選擇一些化合物用於合成，另一些不用於合成。類似的，當用組合化學產生前導化合物的衍生物時，選擇特定的建築組件來平行合成許多同類物，而其它組件不用於合成。這些選擇通常是根據對醫藥化學的經驗作出的，能對可導致改進的修飾，能導致新的不良性質或惡化現有性質的修飾提供指導。然而不幸的是，這些經驗大多數是個別醫藥化學師獨有的，沒有完整的描述，僅在許多文獻的章節片段中提到。
對具有潛在藥用性能的前導化合物的改進並不是衍生改變有機分子的唯一感興趣的事情。有機分子具有許多用途，包括例如殺蟲劑、除草劑等。為了獲得對某具體應用具有改進性質的化合物，常常需要產生可供篩選的有機分子衍生物文庫，來鑑定顯示理想特性的那些衍生物。
組合合成方法能提供合成各種各樣前導化合物衍生物的方法，而不需要預先猜測哪種衍生物可能最理想。人們可同時製備大量不同的衍生物，而不需要各個合成並對其進行測試。組合合成不僅可用於前導化合物的衍生，還可用於合成篩選用的化合物，以鑑定作為可能的前導化合物，那些化合物值得進一步研究。然而，有機分子衍生物組合物文庫的合成非常有限，因為僅通過化學方法難於或甚至不可能合成許多種類的有機分子衍生物。
酶對可供鑑定顯示所需性質的化合物的化合物文庫的合成，提供了引人注目的方法。酶可在溶液中作用於複雜分子的混合物，催化這些分子衍生物的合成而不產生副產物。前導化合物衍生的傳統化學方法通常是非選擇性的，需要多次保護和去保護步驟，但是酶促合成不需要這些步驟。而且，酶可在相對溫和，不破壞反應產物的條件下起作用。另外，酶可對有機分子，如目前已有的和潛在的前導化合物和其它感興趣的生物活性分子進行多種不同類型的修飾。例如，酶可催化在化合物上加上一個基團(如酯、醯胺、羧酸、氨基甲酸酯或糖苷鍵等)。酶還可在有機分子上加上新的官能團，或可修飾存在於化合物上的現存官能團。酶生物催化還可提供某些特別的優點，如底物、立體和區域選擇性。
雖然酶的組合性生物催化作用具有強大的功能，但仍存在顯著的缺點。例如，還不能得到能夠促進全部有機分子衍生物(合成)的足夠多種多樣的酶。從一組天然存在的酶中不可能得到對於任何感興趣的具體有機分子具有所需底物、立體和區域特異性的酶。因此，存在著對能夠產生各種各樣有機分子衍生物的衍生酶的需要。缺乏這些酶限制了用組合生物催化可獲得的有機分子衍生物的數量和種類。因此，存在著對獲得能催化各種各樣不同有機分子衍生物的衍生酶的方法的需要，以及對這些有機分子衍生物文庫的需要。本發明滿足了這些和其它需要。
發明簡述本發明提供了獲得有機分子衍生物文庫的方法。該方法涉及將一有機分子與重組衍生性酶文庫的一個或多個成員和其它必需的反應試劑接觸，形成有機分子衍生物文庫。該衍生性酶能催化如下反應a)有機分子上一個或多個官能團的修飾；b)在存在於該有機分子上的一個或多個官能團上加上化學基團；或c)在該有機分子上引入新的官能團。此方法可用於各種各樣的有機分子，包括例如具有藥物、除草劑、殺蟲劑等活性的分子，或在工業加工中有用的分子。
在一些實施例中，此方法還涉及通過與衍生性酶接觸獲得的衍生物上進行一次或多次加成反應。因此，最初反應的產物作為進一步反應的中間物。進一步反應包括例如使有機分子衍生物文庫與第二個重組衍生性酶文庫的一個或多個成員以及其它必需的反應試劑接觸，形成另一個有機分子衍生物文庫。另外，可用化學方法或用其它酶修飾該中間物。
在一些實施例中，可通過(1)重組編碼某衍生性酶的至少第一和第二形式的某核酸(其中第一和第二形式在兩個或多個核苷酸上彼此不同)，產生一重組多核苷酸文庫；和(2)表達此重組多核苷酸文庫，獲得重組衍生性酶文庫。如果需要，該方法還包括(3)重組至少一種重組多核苷酸(它編碼此重組衍生性酶文庫的一個成員)和編碼某衍生性酶的核酸的另一種形式(它與第一和第二種形式相同或不同)，從而產生另一個重組核酸文庫；(4)表達該另一個重組多核苷酸文庫，獲得重組衍生性酶的另一個文庫；和(5)如需要，重複(3)和(4)，直到重組衍生性酶的另一個文庫含有所需數量的不同重組衍生性酶。
本發明還提供了獲得能催化所需有機分子衍生物合成的酶的方法。這些方法包括使一有機分子與重組衍生性酶文庫的成員和其它必需的反應試劑接觸，形成一有機分子衍生物文庫；鑑定該有機分子衍生物文庫中所需的有機分子衍生物；和鑑定能催化所需有機分子衍生物合成的該重組衍生性酶文庫成員。
本發明還提供了重組衍生性酶文庫，其中當重組衍生性酶與具有一個或多個官能團的有機分子接觸時，能催化以下反應，例如a)一個或多個官能團的修飾；b)在一個或多個官能團上加入一個化學基團；或c)引入一新的官能團。
在另一個實施例中，本發明提供了有機分子衍生物文庫。通過使具有一個或多個官能團的有機分子與一重組衍生性酶文庫的多個成員接觸，生物催化性合成該文庫。這些酶能催化如下反應例如a)一個或多個官能團的修飾；b)在一個或多個官能團上加入一個化學基團；或c)引入一新的官能團。
附圖簡述
圖1顯示了萬古黴素鹽酸鹽上可能的糖結合點。
圖2顯示了促生長素抑制素上可能的糖結合點。
圖3顯示了膽酸上可能的糖結合點。
圖4顯示了L-甲狀腺素上可能的糖結合點。
圖5顯示了諾加黴素上可能的糖結合點。
圖6顯示了丁香醛連氮上可能的糖結合點。
圖7顯示了阿柔比星上可能的糖結合點。
圖8顯示了鹽酸羥苄羥麻黃鹼上可能的糖結合點。
圖9顯示了利福黴素上可能的糖結合點。
圖10顯示了硫酸瑞斯託黴素上可能的糖結合點。還顯示了骨架上的5個另外的羥基(未用箭頭標出)；這些基團構成了可能的糖結合點。
圖11顯示了紅黴素A的多步化學甲基化及其同類物。
圖12顯示了用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依賴性甲基轉移酶催化的反應。
圖13顯示了可進行改組獲得使用紅黴素及其同類物作為底物的具有6-OMT酶活性的O-甲基轉移酶的專一性。
圖14顯示了通過改組獲得使用紅黴素及其同類物作為底物的具有6-OMT酶活性的O-甲基轉移酶的DNA序列和蛋白質序列的相似性。
圖15顯示了鑑定具有新專一性的甲基轉移酶的微量滴定板高通量初步篩選。
圖16顯示了採用紅黴素A 6-O-甲基轉移酶生物催化合成甲紅黴素的示意圖。
圖17顯示了甲紅黴素合成酶的二次試驗。590/158對的MS/MS檢測鑑定了大環內酯環的甲基化。
圖18顯示了甲紅黴素合成酶的另一二次試驗。硼酸苯酯在中性pH時特異性與順式二醇反應。只有甲紅黴素具有能反應的11-12-順式二醇，得到834.5離子。
圖19顯示了載體pCKZEBB的基因圖。
發明詳述定義「衍生性酶」是能在有機分子上催化反應的酶。例如，衍生性酶能修飾存在於分子上的官能團，在官能團上加上一個化學基團，或在有機分子上加上一新的官能團。有機分子可包括合成的(包括例如非天然存在的化合物如含滷素的化合物等)和天然存在的化合物。
「重組衍生性酶」是非天然存在的酶，與天然存在的衍生性酶在序列上至少有一個胺基酸殘基不同。重組衍生性酶包括由多種胺基酸組件組成的衍生性酶，這些組件在天然存在的酶中不連續。這些組件通常為隨機長度。重組衍生性酶可能是嵌合的，因此其部分序列衍生自至少兩條不同親本酶的序列。嵌合的重組衍生性酶是由含有衍生自至少兩條不同親本基因或親本基因區段的嵌合基因編碼的。親本基因可任選地編碼一衍生性酶。
本文所用的術語「文庫」指多種分子的集合，例如重組衍生性酶和有機化合物同類物的集合。本發明的文庫具有至少兩種不同成員分子，但大小可以不同。通常本發明的文庫具有至少約5個不同分子，更通常具有至少約10個不同成員分子。本發明較大的文庫通常具有至少約100個不同成員分子，有時多於約10,000個，甚至多於約100,000個。本發明非常大的文庫可具有多於1,000,000個成員。
「官能團」指一個或一組原子，它限定於具體有機化合物家族的結構並確定其性質。官能團包括例如鏈烯、炔烴、芳族、滷素、羥基、醚、酯、醛、酮、羧酸、醯胺、胺等。
「前導化合物」是一種具有所需生物學或藥物活性，但可能具有其它不需要的特徵的原型化合物。例如，前導化合物可能有毒，不溶，具有其它生物活性，具有較差的生物利用率(如吸收、分布、代謝和排洩(即ADME))或較差的生物活性等。
「核酸」指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其單鏈或雙鏈形式的多聚物。此術語包括含有已知核苷酸同類物或修飾的骨架殘基或連接鍵的合成性、天然存在或非天然存在的核酸，其具有與參比核酸相似的結合性質，並以參比核苷酸相類似的方式代謝。這些同類物的例子包括但不限於硫代磷酸酯、磷酸醯胺、磷酸甲酯、手性磷酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。
除非另外說明，特定的核酸序列還默認包括其保守性修飾變體(如簡併密碼子取代)和互補序列，以及明白說明的序列。術語「核酸」在本文中與「基因」、「cDNA」、「mRNA」、「寡核苷酸」和「多核苷酸」可互換使用。
本文中術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」可互換使用，指胺基酸殘基的多聚物。此術語用於胺基酸多聚物，其中一個或多個胺基酸殘基是對應的天然存在胺基酸以及天然存在的胺基酸多聚物的的同類物或模擬物。
術語「胺基酸」指天然存在和合成的胺基酸，以及功能與天然存在的胺基酸相似的胺基酸同類物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是遺傳密碼子編碼的胺基酸，以及隨後修飾的胺基酸如羥脯氨酸、γ-羧基穀氨酸和O-磷酸絲氨酸。胺基酸同類物指與天然存在的胺基酸具有相同基礎化學結構的化合物，即α碳和一個氫、一個羧基、一個氨基和一個R基團結合(如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶)。這些同類物具有修飾的R基團(如正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基礎化學結構。胺基酸模擬物指具有與胺基酸的通用化學結構不同的結構，但功能與天然存在的胺基酸相似的化合物。
本文的胺基酸可以用它們一般已知的IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的三字母符號或一字母符號表示。類似的，核苷酸可用它們通常接受的一字母碼表示。
「保守性修飾變體」可同時用於胺基酸和核酸序列。對於具體核酸序列，保守性修飾變體指編碼相同或基本相同的胺基酸序列的那些核酸，或當核酸不編碼胺基酸序列時，指基本相同的序列。具體講可以通過一個或多個所選(或全部)密碼子的第三位用混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代序列來進行簡併密碼子取代(Batzer等，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。由於基因密碼子的簡併性，大部分功能相同的核苷酸可編碼任一給定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼胺基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸中某密碼子限定的每一處，可將此密碼子改變成所述的任一對應密碼子，而不會改變編碼的多肽。這些核酸變體是「沉默變體」，它們是一種保守性修飾的變體。本文引用的編碼某多肽的每一種核酸序列還包括該核酸的每一種可能的沉默變體。本領域技術人員懂得核酸中的每一個密碼子(除了AUG，它和一些生物中的GUG通常是甲硫氨酸的唯一密碼子；和TGG，它通常是酪氨酸的唯一密碼子)都可被修飾，以產生功能相同的分子。因此，在各描述的序列中包括編碼多肽的核酸的每一個沉默變體。
對於胺基酸序列，本領域技術人員懂得對核酸進行個別取代、缺失或加成，可改變肽、多肽或蛋白質的序列、在其序列上加入或缺失一個胺基酸或小比例的胺基酸是一種「保守修飾變體」，其中的改變導致用化學上類似的胺基酸取代一胺基酸。提供功能上類似的胺基酸的保守性取代表是本領域熟知的。這些保守性修飾變體補充但不排除本發明的多態性變體、種間同源物和等位基因。
本文所用的術語「改組」表示不相同序列之間的重組，在一些實施例中改組可包括通過同源重組或通過非同源重組，例如通過cre/lox和flp/frt系統進行交換。改組可使用各種不同形式，包括例如體外和體內改組形式、矽內(in silico)改組形式、利用雙鏈或單鏈模板的改組形式、基於引物的改組形式、基於核酸片段化的改組形式、寡核苷酸介導的改組形式，所有這些都基於不相同序列之間的重組活動，以及其它類似的基於重組的形式將在下文中更詳細的描述或引用。
優選例描述本發明提供了用於產生化合物，特別是有機分子的組合文庫的重組衍生性酶文庫。還提供了用該重組衍生性酶文庫獲得的有機分子衍生物文庫。此有機分子衍生物文庫可用於例如鑑定具有理想生物活性的那些衍生物，因此適用於作為藥用或其它用途的前導化合物的測試，和用於建立先前已鑑定的前導化合物的衍生物組合文庫，該前導化合物用於測試改進的藥物學或其它參數。這些化合物通常是有機分子，包括合成分子(包括例如非天然存在的化合物)和天然存在的化合物例如抗生素。
本發明提供的重組衍生性酶文庫對獲得有機分子衍生物文庫提供了優於現有方法的幾個優點。例如，此重組文庫將含有顯示彼此催化特性不同的酶，催化特徵包括催化速率和催化常數、立體、區域和對映體特異性、底物選擇性的多樣性、產物抑制、在用於生物催化合成的溶劑中的穩定性、在化學加工中的穩定性等。所產生的一群不同酶增加了通過生物催化反應產生的不同化合物的數量。當用一種酶與一有機分子和一化學基團供體作生物催化時，通常僅產生一種衍生物。相反，一群重組酶中包括的酶可能催化與原來的酶不同的反應，從而能產生不同產物，即使開始時採用原來的酶的同一底物。而且用酶合成感興趣的有機化合物大大促進了合成反應的規模。
在優選實施例中，用DNA改組或遞歸重組的其它方法來產生重組酶文庫。DNA改組已證明在改進生物催化劑的已知活性水平上非常有效。該技術的其他價值在於能夠產生先前在野生型酶中未知的催化活性。因此，該技術提供了一種生物催化生成的可靠方法，減少或甚至避免了靶向反應對獲得天然存在的生物催化劑的需要。例如，一類相關基因的DNA改組產生了具有不同生理性質的功能多樣的基因文庫，該文庫包括的序列比一特定蛋白質天然可發現的序列範圍更複雜。由於這些酶文庫的新成員從未在生物中經歷選擇性壓力，它們沒有偏向，可對其篩選是否具有天然樣品中很少或不存在的新活性。因此人們可建立多樣和複雜的能催化一系列重要化學物質的酶文庫。例如，酶可催化存在於有機分子上的官能團的修飾，在官能團上加上化學基團(如醯基化、糖基化、和甲基化)，和在有機分子中引入新的官能團(如通過氧化引入羥基，通過還原引入雙鍵等)。可用此酶文庫直接從底物混合物開始合成一批產物，或從一組確定的底物開始合成一特定化合物。另外，可用該重組酶文庫的一個成員通過使其與底物混合物的諸成員接觸，合成眾多化合物的混合物。在本發明的另一個優選實施例中，可用一組確定的底物測試該重組衍生性酶文庫的每一個成員，來鑑定具有新的和有用的底物選擇性或其它有用特徵的酶。
然後，可篩選這樣合成的有機分子衍生物，來鑑定那些具有所需特徵的有機分子，或可通過一個或多個其他的化學或酶促反應進一步修飾。人們還可篩選該酶文庫來鑑定這些具有新的和有用的底物選擇性或其它理想特徵的酶，並用這些酶產生理想的化合物。
用本發明的方法獲得的重組酶可在體外使用，或由能進行生物催化的微生物細胞表達。在一些實施例中，改進這些微生物使其表達一種或多種衍生性酶，用於有效地生物催化來製造衍生的產物。例如，該微生物可含有一種或多種，編碼改進的醯基轉移酶、糖基轉移酶、氧化酶、甲基轉移酶或其它生物催化酶的重組多核苷酸，然後由微生物細胞表達。可將這些多核苷酸引入能天然產生感興趣的起始底物的生物。例如，可將編碼某重組衍生性酶的多核苷酸引入能天然產生或通過基因工程改造能產生聚酮或其它抗生素的生物體中。因此，編碼本發明的重組衍生性酶的重組多核苷酸可用於體內衍生預先製備了骨架的有機化合物，在能生物合成此有機分子骨架的生物體體內衍生這些有機化合物；和體外用於衍生預先製備的化合物。
A.重組文庫的建立本發明在一些實施例中涉及建立多核苷酸的重組文庫，然後篩選此文庫以鑑定編碼顯示所需性質的酶或其它多肽的那些文庫成員，所需性質包括例如增強的酶活性、立體特異性、區域特異性和對映特異性、對抑制劑易感性降低、加工穩定性(如溶劑穩定性、pH穩定性、熱穩定性等)。可用多種方法之一建立該重組文庫，包括本文所描述的這些。例如，可獲得各種核酸改組方案，對此本領域有完全描述。可將下列出版物描述的各種這樣的程序和/或方法摻入這些程序中，以及其它多樣性產生方案中Stemmer等(1999)「用於靶向和其它臨床性能的病毒分子育種，腫瘤靶向」41-4；Nesset等(1999)「枯草桿菌蛋白酶亞基因組序列的DNA改組」NatureBiotechnology 17893-896；Chang等(1999)「用DNA家族改組演化細胞因子」NatureBiotechnology 17793-797；Minshull和Stemmer(1999)「分子育種的蛋白質演化」Current Opioion in Chemical Biology 3284-290；Christians等(1999)「用DNA家族改組對用於AZT磷酸化的胸腺嘧啶激酶直接演化」Nature Biotechnology17259-264；Crameri等(1998)「對多個物種的基因家族的DNA改組加速了定向演化」Nature 391288-291；Crameri等「DNA改組對砷酸鹽解毒途徑的分子演化」Nature Biotechnology 15436-438；Zhang等(1997)「通過DNA改組和篩選從半乳糖苷酶直接演化成有效的巖藻糖酶」Proceedings of the National Academy ofScience，U.S.A.944504-4509；Patten等(1997)「DNA改組在藥物和疫苗中的應用」Current Opinion in Biotechnology 8724-733；Crameri等(1996)「通過DNA改組構建和演化抗體-噬菌體文庫」Nature Medicine 2100-103；Crameri等(1996)「通過採用DNA改組的分子演化改進綠色螢光蛋白」Nature Biotechnology14315-319；Gates等(1996)「通過在乳糖抑制蛋白『頭部二聚體』上展示從肽文庫中親和選擇分離配體」Journal of Molecular Biology 255373-386；Stemmer(1996)「性PCR和集合PCR」於The Encyclopedia of MolecularBiology.VCH Publishers，New York，447-457頁；Crameri和Stemmer(1995)「組合多基因盒誘變建立了所有突變體和野生型基因盒的置換圖」Biotechniques18194-195；Stemmer等(1995)「一步裝配一個基因和全質粒形成大量寡聚脫氧核糖核苷酸」Gene 16449-53；Stemmer(1995)「分子計算的演化」Science2701510；Stemmer(1995)「搜索序列空間」Bio/Technology 13549-553；Stemmer(1994)「體外蛋白質通過DNA改組快速演化」Nature 370389-391；和Stemmer(1994)「隨機片段化和重新裝配的DNA改組分子演化的體外重組」Proceedings of National Acadamey of Sciences，U.S.A.9110747-10751。
發明人及其同事在美國專利中發現了其它關於DNA改組方法的詳細內容，包括Stemmer(1997年2月25日)的美國專利5,605,793，「體外重組的方法；」Stemmer等(1998年9月22日)的美國專利5,811,238「通過重複選擇和重組產生具有所需特徵的多核苷酸的方法；」Stemmer等(1998年11月3日)的美國專利5,830,721「通過隨機片段化和重新裝配進行DNA誘變；」Stemmer等(1998年11月10日)的美國專利5,834,252「末端互補聚合酶反應」和Minshull等(1998年11月17日)的美國專利5,837,458「細胞和代謝工程的方法和組合物」。
另外，可在各種PCT和外國專利申請出版物中找到DNA改組方案的細節和形式，包括Stemmer和Crameri「通過隨機片段化和重新裝配進行DNA誘變」WO95/22625；Stemmer和Lipschutz「末端互補聚合酶鏈式反應」WO96/33207；Stemmer和Crameri「用重複選擇和重組產生具有所需特徵的多核苷酸的方法」WO97/0078；Minshull和Stemmer，「細胞和代謝工程的方法和組合物」WO97/35966；Punnonen等，「基因疫苗載體的靶向」WO99/41402；Punnonen等「抗原文庫免疫」WO99/41383；Punnonen等「基因疫苗載體工程」WO99/41369；Punnonen等「基因疫苗免疫調節性能的優化」WO99/41368；Stemmer和Crameri，「通過隨機片段化和重新裝配進行DNA誘變」EP 0934999；Stemmer「通過重複序列重組進化細胞的DNA攝取」EP0932670；Stemmer等「通過病毒基因組改組對病毒嗜性和宿主範圍進行改進」WO9923107；Apt等，「人乳頭瘤病毒載體」WO9921979；Del Cardayre等，「重複序列重組的全細胞和生物進化」WO9831837；Patten和Stemmer，「多肽工程的方法和組合物」WO9827230；Stemmer等，「通過重複序列改組和選擇優化基因治療的方法」WO9813487；Arnold等，「用隨機或限定引物對多核苷酸序列重組」WO9842832；Arnold等「建立多核苷酸和多肽序列的方法」WO9929902；Vind，「構建DNA文庫的體外方法」WO9841653；和Borchert等，「用DNA改組構建文庫的方法」，WO9841622。
一些美國專利申請提供了關於DNA改組和相關技術的其他細節，以及其它多樣性生成方法，包括Patten等1998年9月29日(USSN 60/102,362)，1999年1月29日(USSN 60/117,729)和1999年9月28日(USSN09/407,800)，(代理人卷宗號20-28520US/PCT)提交的「密碼子改變的基因的改組」；del Cardayre等1998年7月15日(USSN 09/166,188)和1999年7月15日(USSN 09/354,922)提交的「重複序列重組的全細胞和生物進化」；Crameri等1999年2月5日(USSN 60/118,813)和1999年6月24日(USSN 60/141,049)和1999年9月28日(USSN 09/408,392，代理人卷宗號02-29620US)提交的「寡核苷酸介導的核酸重組」；和Welch等1999年9月28日(USSN 09/408,393，代理人卷宗號02-010070US)提交的「基於密碼子的寡核苷酸合成在合成改組中的用途」；Selifonov和Stemmer在1999年2月5日(USSN 60/118854)和1999年10月12日(USSN 09/416,375)提交的「製備具有所需特徵的特徵串、多核苷酸和多肽的方法」。在Patten等，WO9827230「多肽工程的方法和組合物」；Affholter2000年3月2日提交的USSN 60/186,482「單鏈核酸模板介導的重組和核酸片段分離」；「產生高度多樣的文庫的方法」，WO0000632；和「獲得體外重組的多核苷酸序列，序列庫和產生序列的方法」，WO0009679中描述了使用單鏈模板的改組形式。
作為前述出版物、專利、出版的申請以及美國專利申請的綜述，可用許多已建立的重組方法進行核酸改組，來提供具有所需性質的新核酸，這些方法可以和其它多樣性生成方法聯合應用。
簡單說，幾種不同類型的重組方法可用於本發明，在上述參考文獻中已列出。第一，核酸可以在體外用任何上述參考文獻中所討論的技術(如DNA酶消化核酸，然後連接和/或PCR重新裝配核酸)重組。第二，核酸可以在體內重複重組，如通過在細胞內的核酸之間發生重組。第三，可採用全基因組重組方法，其中細胞或其它生物體的全基因組進行了重組，可任選的包括用所需的文庫成分摻入基因組重組混合物。第四，可採用合成重組方法，其中合成對應於感興趣的靶的寡核苷酸，在PCR或連接反應中重新裝配，包括對應於一個以上親本核酸的寡核苷酸，從而產生新的重組核酸。可用標準核苷摻入法製備寡核苷酸，或用三核苷酸合成法製備。第五，可用矽內重組法，其中在計算機中使用遺傳算法來重組對應於核酸同類物(或甚至非同源序列)的序列串。可將產生的重組序列串任選的通過核酸合成轉變成對應於該重組序列的核酸，如與寡核苷酸合成/基因重新裝配技術協同。可以重複方式進行前述一般重組形式之一種，來產生更多樣的重組核酸組。第六，可採用實現天然多樣性的方法，例如通過多樣性核酸或核酸片段與單鏈模板雜交，隨後多聚化和/或連接以再產生全長序列，然後任選地降解模板，回收產生的修飾的核酸。
為了說明，在本發明的一個實施例中，用於製備編碼重組衍生性酶的多核苷酸的改組方法包括在一組變種多核苷酸的重疊區段上引發多核苷酸擴增，條件是一個區段作為另一個區段的延伸模板，產生一組重組多核苷酸；和選擇或篩選具有所需特性的重組多核苷酸。
重疊區段可通過各種方法製備，這些方法如本文或本文引用的參考文獻所述，例如化學合成、切割或片段化、多核苷酸群的擴增和其它本領域熟知的方法。
在另一個實施例中，用於產生重組衍生性酶的改組方法包括雜交至少兩組核酸，其中第一組核酸含有單鏈核酸模板，第二組核酸含有至少一組核酸片段；和延長和連接雜交的核酸片段之間的序列缺口，產生至少基本全長的嵌合性核酸序列，該序列對應於此單鏈核酸模板，從而重組了該組核酸片段，和可任選的使至少基本全長的此嵌合性核酸序列與單鏈核酸模板變性；和用至少一種分離技術從單鏈核酸模板上分離至少基本全長的此嵌合性核酸序列；通過核酸消化或物理片段法，片段化分離的至少基本全長的此嵌合性核酸序列，以提供嵌合性核苷酸片段。
上述參考文獻提供了這些和其它基本的重組方式，以及許多對這些方式的改進。不論採用什麼改組方式，都可重組本發明的核酸(彼此重組或與相關的(或甚至不相關的)重組)產生一組多樣性的重組核酸，包括例如同源核苷酸組。
重組後，可選擇產生的任何核酸有無所需活性。在本發明中，這可能包括用任何本領域的試驗以自動化方式測試和鑑定任何可檢測的活性。可用任何可得到的試驗測試各種相關(或甚至不相關)的性能。根據本文描述的本發明，這些方法是自動化的。
DNA誘變和改組提供了產生(用於具有改進特性的蛋白質、途徑、細胞和生物體工程)多樣性的強大而且廣泛適用的方法。除了上述基本方式，有時候需要將改組方法與其它技術聯合以產生多樣性。許多產生多樣性的方法可與改組法聯合(或分別)實施，在本發明的系統中篩選結果(即多樣核酸群)。用本領域已知的誘變法可誘導額外的多樣性。
誘變方法可包括例如出版號WO98/42727中描述的那些；定點誘變(Ling等(1997)「DNA誘變的方法綜述」於Anal Biochem.254(2)157-78；Dale等(1996)「用硫代磷酸酯法針對寡核苷酸隨機誘變」Methods Mol Biol.57369-74；Smith(1985)「體內誘變」Ann.Rev.Genet.19，423-462；Botstein和Shortle(1985)「體內誘變的策略和應用」Science 229，1193-1201；Carter(1986)「定點誘變」Biochem J.237，1-7；Kunkel(1987)「寡核苷酸定向誘變的效果」Nucleic AcidsMolecular Biology)Eckstein，F.和Lilley，D.M.J.編SpringerVerlag，Berlin)；採用含有模板的尿嘧啶誘變(Kunkel(1985)「不經表型選擇快速和有效的位點專一性誘變」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，488-492；Kunkel，T.A.，Roberts，J.D.Zakour，R.A.(1987)「不經表型選擇快速和有效的位點專一性誘變」Methods in Enzymol.154，367-382；Bass，S.，V.Sorrels和P.Youderian(1988)「具有新DNA結合專一性的突變Trp阻遏蛋白」Science 242240-245)；寡核苷酸定向誘變(對於綜述參見Smith，Ann.Rev.Genet.19423-462(1985)；Botstein和Shortle，Science 2291193-1201(1985)；Carter，Biochem.J.2371-7(1986)；Kunkel，「寡核苷酸定向誘變的效果」於Nucleic AcidsMolecular Biology，Eckstein和Lilley編，Springer Verlag，Berlin(1987))；寡核苷酸定向的誘變(Methods in Enzymol.100468-500(1983)，和Methods inEnzymol.154329-350(1987)；ZollerSmith(1982)「採用M13-衍生的載體寡核苷酸定向誘變在任一DNA片段中產生點突變的有效和通用方法」Nucleic AcidsRes.10，6487-6500，ZollerSmith(1983)「DNA片段克隆入M13載體的寡核苷酸定向誘變」Methods in Enzymol.100，468-500；ZollerSmith(1987)「寡核苷酸定向的誘變一種採用兩條寡核苷酸引物和單鏈DNA模板的簡單方法」，Methods inEnzymol.154，329-350)；硫代磷酸酯修飾的DNA誘變(Taylor等(1985)「在限制性酶反應中用硫代磷酸酯修飾的DNA製備帶缺口的DNA」Nucl.Acids.Res.138749-8764；Taylor等(1985)「用硫代磷酸酯修飾的DNA以高頻率快速產生寡核苷酸定向突變」Nucl.Acids.Res.138765-8787(1985)；Nakamaye和Eckstein(1986)「硫代磷酸酯基團對限制性內切酶Nci I的抑制及其在寡核苷酸定向誘變中的應用」Nucl.Acids.Res.149679-9698；Sayers等(1988)，Nucl.Acids.Res.「基於硫代磷酸酯的寡核苷酸定向誘變中的Y-T外切酶」16791-802；Sayers等(1988)「通過在溴乙錠存在下與限制性內切酶反應，鏈專一性切割含有硫代磷酸酯的DNA」Nucl.Acids.Res.16803-814)；採用含尿嘧啶的模板進行誘變(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488-492(1985)和Kunkel等，Methodsin Enzymol.154367-382))；採用缺口雙鏈體DNA進行誘變(Kramer等「寡核苷酸定向突變構建物的缺口雙鏈體DNA方法」Nucl.Acids.Res.129441-9456(1984)；Kramer和Fritz，Methods in Enzymol.「通過缺口雙鏈體DNA進行突變體的寡核苷酸定向構建」154350-367(1987)；Kramer等，Nucl.Acids.Res.167207(1988)；Fritz等(1988)「突變的寡核苷酸定向構建體外無酶促反應的缺口雙鏈體DNA法」Nucl.Acids.Res.166987-6999(1988)採用缺口雙鏈體DNA的誘變；Kramer，W.，Ohmayer，A.Fritz，H.-J.(1988)「在缺口雙鏈體DNA方法中改進的體外酶促反應實現寡核苷酸定向構建突變體」Nucl.Acids.Res.16，7207；和Bass，S.，V.Sorrels和P.Youderian(1988)「具有新DNA結合專一性的突變Trp阻遏蛋白」Science，242240-245)。
其它合適方法包括點錯配修復(Kramer等(1984)「點錯配修復」Cell38879-887(1984))，採用修復缺陷的宿主株進行誘變(Carter等(1985)，「採用M13載體的改進的寡核苷酸定點誘變」Nucl.Acids.Res.134431-4443(1985)；Carter(1987)「採用M13載體的改進寡核苷酸定向的誘變」Methods in Enzymol.154382-403)，缺失誘變(Eghtedarzadeh和Henikoff(1986)「用寡核苷酸產生大缺失」Nucl.Acids.Res.145115)，限制性選擇和限制性選擇與限制性純化(Wells等(1986)「氫鍵形成在穩定枯草桿菌蛋白轉換期中的重要性」Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317415-423)，總基因合成的誘變(Nambiar等(1984)「編碼核糖核酸酶S蛋白的基因的全部合成和克隆」Science 2231299-1301；Sakamar和Khorana(1988)「牛杆狀體外側區段鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(轉導素)亞單位的基因的全部合成和表達」Nucl.Acids.Res.146361-6372；Wells等「基因盒誘變在限定位點產生多重突變的有效方法」Gene 34315-323(1985)；和Grundstrm等(1985)「微量「鳥槍」基因合成的寡核苷酸定向誘變」Nucl.Acids.Res.133305-3316)，雙鏈損傷的修復(Band aid)(Mandecki(1986)「大腸桿菌質粒中寡核苷酸定向的雙鏈損傷的修復位點專一性誘變位點的方法」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 837177-7181)。可在Methods in Enzymol.，154卷中找到上述方法的許多其他細節，此書也是各種誘變方法疑難解答的有用對照。
誘變試劑盒是商品可得到的。例如，試劑盒可購自Stratagene(如QuickChange定點誘變試劑盒；Chameleon雙鏈、定點誘變試劑盒)，Bio/CanScientific，Bio-Rad(如採用上述Kunkel法)，Boehringer Mannheim Corp.Clonetch Laboratories，DNA Technologies，Epicentre Technologies(如5prime3prime試劑盒)；Genpak Inc，Lemargo Inc，Life Technologies(Gibco BRL)，New England Biolabs.Pharmacia Biotech，Promega Corp.QuantumBiotechnologies，Amersham International plc(如採用上述Eckstein法)，和Anglian Biotechnology Ltd(如採用上述Carter/Winter法)。
另外，可使用任何所述的改組技術聯合在基因組(如細菌基因組)中引入額外多樣性的方法。例如，已提出了能產生適合轉化入各種物種(包括大腸桿菌和枯草桿菌)的核酸多聚物的技術(見例如，Schellenberger美國專利號5,756,316)。當這些多聚物含有彼此不同的基因(如衍生自天然多樣性或通過定點誘變、易錯PCR、通過突變細菌菌株傳代等)，轉化入合適的宿主時，引入DNA改組的其他核酸多樣性來源。轉化入宿主的多聚物特別適用於作為體內改組方案的底物。另外，可將共同具有部分序列類似區域的多核苷酸重複性轉化入一宿主，由該宿主細胞體內重組。可用隨後的細胞分裂周期產生文庫，該文庫的成員各含有一個同源性單體群或合併的核酸。另外，可通過標準技術回收此單體核酸，並以任何所述的改組方式重組。
還提出了使用鏈終止法的改組方式(見例如美國專利號5,965,408)。在該方法中，合併對應於一個或多個共同具有序列相似性區域的基因的雙鏈DNA，並使其在存在或不存在對該基因特異性的引物條件下變性。然後退火此單鏈多核苷酸並在聚合酶和鏈終止劑(如紫外線、γ或X-射線輻照；溴乙錠或其它插入物；DNA結合蛋白質，如單鏈結合蛋白，轉錄激活因子或組蛋白；多環芳烴；三價鉻或三價鉻鹽；或快速熱循環介導的縮短聚合等)存在下溫育，產生部分雙鏈體分子。然後變性含有部分延伸鏈的該部分雙鏈體分子，在隨後的複製或部分複製循環中重新退火，產生共同具有不同程度序列相似性的多核苷酸，其對DNA分子起始群而言是嵌合體。可任選的，可在此過程的一個或多個階段擴增這些產物或這些產物的合併物。上述鏈終止方法產生的多核苷酸是以所述方式進一步DNA改組的合適底物。
可通過非同源性改組法(如上述出版物和申請中所述，可以是同源性或非同源性，取決於精確方式)進一步增加多樣性。例如，Ostermeier等(1999)「得到不依賴於DNA同源性的雜交酶的組合方法」Nature Biotechnol.171205所述的產生雜交酶的增量截短法(ITCHY)可用於產生改組文庫，此文庫可任選的作為一輪或多輪體外或體內改組法的底物，另見Ostermeier等(1999)「增量截短的組合蛋白質工程」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 963562-3567；Ostermeier等(1999)「作為新生物催化工程策略的增量截短」Biologlcal and Medical Chmiestry，72139-2144。
已描述了產生多物種表達文庫的方法(如美國專利號5,783,431；5,824,485)並提出了它用於鑑定感興趣的蛋白質活性的用途(美國專利5,958,672)。多物種表達文庫一般是含有多個物種或品系的cDNA或基因組序列，與合適的調控序列在表達盒中可操縱性連接的文庫。cDNA和/或基因組序列可任選的隨機連接，進一步增加多樣性。載體可以是適合在一種以上物種的宿主有機體內(如細菌菌種、真核細胞)轉化和表達的穿梭載體。在某些情況下，通過預先選擇編碼感興趣的蛋白質，或與感興趣的基因雜交的序列，使此文庫具有偏向。可提供任何這樣的文庫作為本文所述改組方法的底物。
在某些應用中，需要在改組前預選或預篩文庫(如擴增的文庫、基因組文庫、cDNA文庫、標準化文庫等)或其它底物核酸，或使底物偏向編碼功能性產物的核酸(改組程序也可能獨立的具有這些作用)。例如，就抗體工程而言，可以在DNA改組之前通過任何描述的方法，將改組過程通過利用體內重組事件，偏向具有功能性抗原結合位點的抗體。例如，在DNA改組前可根據任何本文所描述的方法擴增衍生自B細胞cDNA文庫的重組CDR，將其裝配在框架區中(如Jirholt等(1998)「探索序列空間將體內形成的互補決定區改組到主框架中」Gene 215417)。
文庫可偏向編碼具有所需酶活性的蛋白質的核酸。例如，從文庫鑑定到一顯示特定活性的克隆後，可用任何能引入DNA改變的已知方法(包括但不限於DNA改組)誘變此克隆。然後篩選含有該誘變同源物的文庫中有無所需的活性，它可以與最初限定的活性相同或不同。在美國專利號5,939,250中提出了該過程的一個例子。可用本領域已知的方法鑑定所需活性。例如WO99/10539提出可通過將基因文庫提取物與從代謝豐富的細胞中獲得的成分組合，並鑑定顯示所需活性的組合，來篩選基因文庫。還提出(如WO98/58085)可通過在文庫樣品中插入生物活性底物，來鑑定具有所需活性的克隆，並用螢光分析儀(如流式細胞計數裝置，CCD，螢光計或分光光度計)檢測對應於具有所需活性的產物的生物活性螢光。
還可將文庫偏向具有特定特徵(如與所選核酸探針雜交)的核酸。例如，專利申請WO99/10539提出了可從基因組DNA序列中以下列方法鑑定出編碼所需活性(如酶活性，例如脂肪酶、酯酶、蛋白酶、糖苷酶、糖基轉移酶、磷酸酶、激酶、加氧酶、過氧化酶、水解酶、水化酶、腈水解酶、轉胺酶、氨化酶或醯化酶)的多核苷酸。使來自一群基因組DNA的單鏈DNA分子與偶聯了配體的探針雜交。此基因組DNA可衍生自培養或非培養的微生物，或來自環境樣品。另外，此基因組DNA可衍生自多細胞生物，或衍生自該多細胞生物的組織。
可從捕獲中使用的雜交探針預先或不預先從捕獲介質上釋放，或通過各種各樣本領域已知的其它策略直接進行第二鏈合成，。另外，不經進一步克隆可片段化分離的單鏈基因組DNA群，直接用於使用單鏈模板的改組方式。在例如WO98/27239「多肽工程的方法和組合物」，Patten等；Affholter，2000年3月2日提交的USSN 60/186,482「單鏈核酸模板介導的重組和核酸片段分離」；WO 0000632「產生高度多樣性文庫的方法」；和WO 0009679「獲得體外重組的多核苷酸序列庫的方法和得到的序列」中描述了一些單鏈模板改組方式。在一個這樣的方法中，將此片段群衍生的基因組文庫與對應於相對鏈的部分或通常接近全長的ssDNA或RNA一起退火。該群的複雜嵌合基因的裝配是通過核酸酶去除非雜交的片段末端，聚合填補這些片段之間的缺口，隨後單鏈連接所介導的。可用消化(如果是RNA或者含尿嘧啶)、在變性條件下磁分離(如果以進行這種分離的方式標記)和其它可行的分離/純化方法除去親本鏈。另外，親本鏈可任選的與嵌合鏈共同純化，並在隨後的篩選和加工步驟中除去。
在一常規方法中，將單鏈分子轉變成雙鏈DNA(dsDNA)，特dsDNA分子通過配體介導的結合與固態載體結合。分離未結合的DNA後，將所選DNA分子從載體上釋放下來，並引入合適的宿主細胞中，產生富含能與探針雜交的序列的文庫。用該方法產生的文庫提供了採用本文所述的改組反應進一步改組所需的底物。
還應理解任何適合改組前能豐富文庫的上述技術，可用於篩選用該DNA改組方法產生的產物。
在一個優選例中，用DNA改組製備了重組文庫。可用改組和篩選或選擇「演化」各基因、全質粒或病毒、多基因簇、或甚至整個基因組(Stemmer(1995)Bio/technology 13549-553)。可進行重複的重組和篩選/選擇循環進一步演化感興趣的核酸。這些技術不需要常規多肽工程方法所要求的廣泛分析和計算。改組能在最少數量的篩選/選擇循環中重組大量的突變，此與傳統的配對重組相反。因此，本文描述的序列重組技術提供了特別的優點，在於它們提供了在這些任一或所有突變之間的重組，從而提供了一種非常迅速的方法探查不同組合的突變可能影響到所需結果的方式。然而在一些情況下，結構和/或功能信息是可得到的，雖然不是序列重組需要的，但提供了修改此技術的機會。
這些改組方法通常使用至少兩種起始核酸底物的變種形式。候選底物的變種形式可能顯示彼此基本序列或二級結構有相似性，但它們應該至少在兩個位置是不同的。兩形式之間的最初多樣性可能是天然變異的結果，例如可從一種生物(包括地理變體)的不同個體或品系或同一生物構建的相關序列(如等位變體)獲得此不同變異形式(同源物)。另外，可通過例如易錯轉錄(例如易錯PCR或採用缺乏第一變種形式的校閱活性的聚合酶(見例如Liao(1990)Gene 88107-111))產生第二變種形式，或通過在突變品系中複製第一形式，或通過DNase片段的突變加工和用易錯聚合酶重新裝配引入起始多樣性。底物之間的起始多樣性在重複序列重組的後續步驟中大大增加。
在本發明的優選例中，採用核酸「家族」的改組來建立重組多核苷酸的文庫。當核酸家族被改組時，編碼不同品系、物種或基因家族或其部分的核酸可用作該核酸的不同形式。由於基因組提供了增量的序列信息，用設計引物直接擴增同源物更加可能。例如，如果有幾個物種的脂肪酶或蛋白酶基因序列，可設計引物來擴增同源物。然後可對得到的核酸區段進行改組。
在本發明的實施中不難使用本文描述的所有改組方法。例如，在密碼子修飾改組(在Patten等1998年9月29日提交的「密碼子改變的基因的改組」(USSN60/102,362)、1999年1月29日提交的USSN 60/117,729和1999年9月28日提交的USSN 09/102,362)中，合成了其中編碼多肽的密碼子被改變的核酸，使得可能在該核酸的隨後突變中得到完全不同的突變區域。這增加了改組方案的起始核酸序列多樣性，改變了強迫演化程序的速度和結果。可採用密碼子修飾程序來修飾本文任何編碼衍生性酶的核酸，例如在進行DNA改組之前，或可將密碼子修飾方法與下文所述的寡核苷酸改組程序聯用。
密碼子修飾改組涉及編碼第一多肽序列或其部分的第一核酸序列。然後選擇多條密碼子改變的核酸序列，其每一條都編碼第一多肽的部分或全部，或修飾的或相關的多肽(如可在一生物學試驗中選擇密碼子改變的核酸文庫，該試驗能識別文庫成分或活性)，重組多條密碼子改變的核酸序列，產生靶密碼子改變的第二蛋白質的核酸編碼部分或全部。然後篩選靶密碼子改變的核酸是否有可檢測的功能或結構性質，可任選的包括與第一多肽和/或相關多肽的性質比較。該篩選的目的是鑑定具有與第一種多肽或相關多肽結構或功能特性相等或比它卓越的多肽。基本上可在所需的任何方法中使用編碼這樣的多肽的核酸，包括將靶密碼子改變的核酸引入細胞、載體、病毒(如作為疫苗或免疫原性組合物的成分)、轉基因生物等。
「矽內」改組(Selifonov和Stemmer在「產生具有所需特性的特徵串、多核苷酸和多肽的方法」詳述)，1999年2月5日提交(USSN 60,118,854)和1999年10月12日(USSN 09/416,375)利用計算機算法，在計算機中用遺傳操縱子進行「仿真」改組。對於本發明，在計算機系統中重組衍生性酶基因序列串，通過例如重新裝配PCR合成寡核苷酸產生所需產物。簡單說，遺傳操縱子(代表給定遺傳活動(如點突變、重組兩條同源核酸鏈等)的算法)可用於通過例如排列對比核酸序列串(用標準排列對比軟體或用手工觀察和排列對比)來模擬一種或多種核酸中可能發生的重組或突變活動，並預測重組結果。例如通過寡核苷酸合成和重新裝配PCR，將預測的重組結果用於產生相應的分子。
在「寡核苷酸介導的改組」(Crameri等「寡核苷酸介導的核酸重組」，1999年2月5日(USSN 60/118,813)和1999年6月24日提交的(USSN 60/141,049)和1999年9月28日提交的(USSN 09/408,392))中，對應於相關同源核酸(如本發明中所用的，編碼衍生性酶的核酸的種間或等位變體)家族的寡核苷酸重組產生可選擇的核酸。
寡核苷酸介導的重組的一個優點是能重組同源核酸與序列相似性低的或甚至非同源的核酸。在這些同源性低的寡核苷酸改組方法中，將一組或多組核酸區段，例如與一組交換家族多樣性寡核苷酸重組。這些交換寡核苷酸每一條都具有多個序列多樣性區域，對應於序列相似性低的同源或非同源核酸，的多個序列多樣性區域。通過與一條或多條同源或非同源核酸比較，衍生的這種交換寡核苷酸可與這些核酸區段的一個或多個區域雜交，促進重組。
當重組同源核酸時，雜交和延伸(如通過重新裝配PCR)諸組寡核苷酸重疊性家族(它們通過比較同源核酸併合成寡核苷酸區段而產生)，得到一群重組核酸，可選擇所需性狀或特徵。通常，諸組重疊寡核苷酸包括多種寡核苷酸成員類型，它們具有衍生自多條同源靶核酸的共有區域亞序列。一般通過排列對比同源核酸序列和所選的序列相同性保守區域和序列多樣性區域，提供這些重疊寡核苷酸組。(依次或平行)合成了多條對應於序列多樣性的至少一個區域的寡核苷酸。
通過切割一條或多條同源核酸(如用Dnase)或更常見，通過合成一組對應於至少一條核酸的多個區域(通常作為一組核酸片段的成員而提供對應於全長核酸的寡核苷酸)可提供用於寡核苷酸改組方法中的區段組或區段亞組。在本文所述的改組程序中，這些區段(如編碼衍生性酶的核酸區段)可與寡核苷酸的改組家族聯用，例如在一個或多個重組反應中產生編碼重組衍生性酶的核酸。
通常在一輪重組和篩選/選擇後可實現改進。然而，可採用重複序列重組來實現所需特性的進一步改善。可用許多不同方式和方式的預突變(它們擁有一些共同的原理)實現序列重組。重複序列重組需要連續多輪重組以產生分子多樣性。即建立彼此顯示一些序列相同性，但突變不同的核酸分子家族。在任何給定的輪次中，重組可以在體內或體外，胞內或胞外發生。另外，重組產生的多樣性可在任何輪次中通過將先前的誘變方法(如易錯PCR或基因盒誘變)應用於重組的底物或產物而得到增強。在一些例子中，當使用該序列的不同變體形式作為生物體的不同個體或品系的同源物，或使用同一生物的相關序列作為等位變體時，可在體內或體外重組僅一輪之後實現新的或改進的性能或特性。
通常在細胞中完成重組多核苷酸的表達，以獲得重組衍生性酶。可在體外或體內如美國專利號5,837,458中所述的建立重組多核苷酸文庫。對於體外文庫的產生，可將此重組多核苷酸引入細胞以表達。
B.用於生物催化合成組合文庫的衍生性酶的類型本發明的方法用於能催化感興趣的有機分子修飾的大範圍的衍生性酶。這些酶可通過例如在分子上加上一個官能團或通過修飾分子上現存的官能團來修飾底物。感興趣的修飾還包括在官能團上加上化學基團。在本文優選實施例中，衍生性酶不加到有機分子的骨架長度上。在例如Khmelnitsky等(1996)MolecularDiverisity and Combinatorial Chemistry，14章，144-157頁(American ChemicalSociety)和Michels等(1998)Tibtech 16210-215中描述了感興趣的反應類型。下文描述了不同類型的衍生性酶種類和本發明的方法應用於這些酶的例子。
除了增加重組酶文庫中發現的酶活性的多樣性外，還可獲得在某些特性上增強的酶，這增加了此酶在修飾有機化合物(如天然化合物、非天然化合物(如5-氟尿嘧啶、疊氮胸苷等)、小分子和聚合物(如肽和肽變體、寡核苷酸/多核苷酸及其變體、多羥基鏈烷酸酯、多糖、聚乳酸、聚乳酸-共-乙醇酸、聚乙二醇等))中的用處。本發明實施中使用的小分子通常具有低於約2500道爾頓的分子量，通常低於約2000道爾頓，有時低於約1500道爾頓。
可篩選這些文庫以鑑定與野生型酶相比較編碼顯示用於感興趣的反應，所需的一個或多個性能上有所改進的酶。例如，可通過篩選，鑑定編碼對於某具有化合物具有改進的底物特異性，或對於該化合物上的所需官能團具有改進的區域選擇性的酶的文庫成員。
在一些實施例中，重組衍生性酶是某給定的野生型基因的變體，通過本文所述的多樣性產生方法(如改組和基因重裝配改組方法)引入變異。因此可用密集採樣在該給定序列周圍提供有限但完整的多樣性。在其它實施例中，通過對幾種不同的野生型基因使用多樣性產生方法產生了重組文庫。實現了有限和不完整的多樣性，它分散在整個功能性序列空間內，與分散採樣相同。當產生新的酶的特異性時，後一種方法是優選的。
1.對現存官能團的修飾和將新官能團引入有機分子在一些實施例中，重組衍生性酶及其文庫可催化存在於感興趣的有機分子上現存官能團的修飾。例如，感興趣的衍生試劑可氧化或還原一官能團、水解一基團或用一種官能團替換另一種。其它感興趣的反應包括內酯化，異構化和差向異構化。
a.羥化在一些實施例中，有機分子中的氫被羥基取代。這常常可導致生物活性的顯著改變。羥化常常與首先通過肝臟的代謝增強相關。在候選藥物中引入羥基還可以賦予在隨後一組轉移酶(如催化甲基化、硫酸鹽化、磷酸化和糖基化的酶)的作用下更快速的代謝。
在用於引入羥基的衍生性酶中有單氧和二氧化酶。本領域已知的單氧化酶範圍提供了產生用於本發明的方法的重組單氧化酶文庫的合適起始點。一類有用的單氧化酶的例子是亞鐵血紅素依賴性真核和細菌細胞色素P-450。在存在氧和完整的氧化還原再循環系統中，P450顯示了單氧化酶活性。然而對許多同樣的底物可利用加入過氧化氫或其它過氧化物來繞過對NAD(P)H的需要(即考慮到過氧化酶活性)。酶(如P450)在化學困難位點進行化學反應的能力是熟知的。天然存在的P450對類固醇的修飾在生物合成和藥物代謝中很廣泛。因此，例如P450的改組文庫將對進一步化學(或酶促)衍生或篩選產生許多新結合點。本文提到的其它酶也可以用於在臨床重要的化合物家族中建立新的結構多樣性。
P450單氧化酶基因家族特別適用於家族改組，以獲得重組衍生性酶。已知道許多不同物種的約70-80個P450單氧化酶家族。為了鑑定可作為一個家族一起改組的同源基因，可在「色素P450結構、機制和生物化學」的附錄，第2版(PaulR.Ortiz de Montellano編，Plenum Press，New York，1995)(「Ortiz deMontellano」)中找到P450酶的代表性排列對比。最新的P450名單可在全球資訊網World Wide Web上(http//drnelson.utmem.edu/homepage.html)以電子格式找到。為了說明用改組改進P450酶家族，選擇了一個或多個超過1000個成員的該超家族，與相似的同源序列排列對比，並根據這些同源序列進行改組。例如，牛P450sec酶的基因(CYP11A1)屬於一個緊密相關的P450基因家族。DNA改組(Crameri等，Nature 391288)可用於從該基因家族建立雜交變體，其文庫可用於產生有機分子衍生物的組合文庫。特別是鏈黴菌產生的P450單氧化酶可用於產生天然產物如抗生素。適合用於改組的P450單氧化酶的例子包括以下酶，其每一種至少在胺基酸水平上有45％的相同性細胞色素p450單氧化酶(委內瑞拉鏈黴菌)AF087022細胞色素p450單氧化酶(紅色糖多孢菌)M83110細胞色素p450單氧化酶(紅色糖多孢菌)M54983細胞色素p450單氧化酶(吸水鏈黴菌)X86780細胞色素p450單氧化酶(抗生鏈黴菌)L47200在待批的，共同擁有的美國專利申請號60/148,850中更詳細地討論了重組偏50單氧化酶基因文庫的建立，它在1999年8月12日提交。
注意到下文關於單氧化酶描述的基礎化學是已知的。除了Ortiz deMontellano(見上)，Stryer(1988)Biochemistry，第三版(或以後的版本)，Freemanand Co.New York，NY；Pine等，Organic_Chemistry第四版(1980)McGraw-Hill，Inc.(USA)(或以後版本)；March，Advanced_Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure第四版J.Wiley and Sons(New York，NY，1992)(或以後版本)；Greene等，Protective Groups In Organic Chemistry，第二版，JohnWileySons，New York，NY，1991(或以後版本)；Lide(編)(1995)The CRC Handbookof Chemistry and Physics 75th版(或以後版本)；和其中的參考文獻中發現了所涉及的各種化學物質的一般指南。另外，用於本發明的許多化學和工業過程的廣泛指南可在Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology(第三版和第四版，1998年)，Martin Grayson，執行編輯，Wiley-Interscience，John Wiley and Sons，NY和其中的參考文獻中找到(「Kirk-Othmer」)。
適用於有機分子引入羥基和其它修飾的其它單氧化酶包括具有以下活性的酶，例如烷烴氧化(如羥基化、酮、醛的形成等)、烯烴環氧化、芳族羥基化、N-去烷基化(如烷基胺的)、S-去烷基化(如還原的含硫有機物)、D-去烷基化(如烷基醚的)、醯氧基苯酚的氧化、醛轉化成酸、醇轉化成醛或酮、脫氫、脫羰基、滷代芳族和滷代糖類的氧化性脫滷素、Baeyer-Villiger單氧化、環孢菌素的修飾、美伐他汀的羥基化、紅黴素的羥基化、N-羥基化、亞碸形成、或磺醯脲的氧化。本領域技術人員對於其它氧化性轉化是清楚的。用於本發明的合適單氧化酶的例子在待批的，共同擁有的美國專利申請系列號09/373,928，標題為「產生工業化合物的單氧化酶基因的DNA改組」(1999年8月12日提交)中有所描述。
二氧化酶是另一類用於生物催化合成有機分子衍生物的衍生性酶。例如細菌芳烴二氧化酶(ADO)可將π鍵氧化成相應的鄰位二醇。在氧的存在下和還原性化合物如NAD(P)H的存在下這些酶能催化與芳環和非芳環多鍵一樣多樣性的化合物的還原性雙加氧化。芳烴二氧化酶作用產生的環狀順-二羥基化產物的非苯酚性質，通過避免聚集毒性和反應性環氧中間物(它們可顯著損害生物催化劑的性能)，為製造有機分子衍生物提供了顯著優點。
芳烴二氧化酶包括例如甲苯2，3-二氧化酶、異丙基苯2，3-二氧化酶、苯-1，2-二氧化酶、二苯基-2，3-二氧化酶、萘-1，2-二氧化酶和許多同源和/或功能上相似的酶。合適的芳烴二氧化酶編碼的多核苷酸可用本領域技術人員已知的克隆方法從許多生物獲得。下列名單提供了編碼芳烴二氧化酶並適用於本發明的方法的多核苷酸例子。基因座是通過GenBank ID鑑定的，其編碼芳烴二氧化酶的全部或部分蛋白質組分。合適的基因座包括例如[PSETODC1C]甲苯1，2-二氧化酶；[AF006691]、[PJU53507]、[PSECUMA]、[REU24277]、異丙基苯-2，3-[E04215]、[PSEBDO]二氧化酶；苯-1，2-二氧化酶；[AEBPHA1F]、[CTU47637]、[D78322]、[D88020]、[D88021]、[PSEBPHA]、[PSEBPHABC]、[PSEBPHABCC]、[PSU95095]、[RERBPHA1]、[RGBPHA]、[RSU27591]二苯基-2，3-二氧化酶；[PSU15298]氯苯二氧化酶；[AB004059]、[AF010471]、[AF036940]、[AF053735]、[AF053736]、[AF079317]、[AF004283]、[AF004284]、[PSENAPDOXA]、[PSENAPDOXB]、[PSENDOABC]、[PSEORF1]、[PSU49496]、萘-1，2-二氧化酶；[AF009224]、[PSEBEDC12A]苯甲酸-1，2-二氧化酶；[PWWXYL]甲苯甲酸二氧化酶；[ASCBAABC]、[U18133]3-氯苯甲酸-3，4-二氧化酶；[PCCBDABC]2-氯苯甲酸-1，2-二氧化酶；[BSU62430]2，4-二硝基甲苯二氧化酶；[PSU49504]2-硝基甲苯二氧化酶；[PPU24215]對香豆酸(cumate)-2，3-二氧化酶；[PSEPHT]鄰苯二甲酸-4，5-二氧化酶；[AB008831]、[ACCANI]、[D85415]苯胺1，2-二氧化酶；[D90884]苯丙酸2，3-二氧化酶；[PPPOBAB]苯氧基苯甲酸二氧化酶；[AF060489]、[AB001723]和[D89064]咔唑二氧化酶。
還可利用的是基因組含有編碼其它二氧化酶的生物，其它二氧化酶包括1，2，3，4-四氫化萘-5，6-二氧化酶，Sikkema等，Appl.Eviron.Microbiol.59567-573(1993)；對香豆酸-2，3-二氧化酶DeFrank等，J.Bacteriol 1291356-1364(1977)；芴酮1，1a-二氧化酶，Selifonov等J.Biochem.Biophys.Res.Comm.19367-76(1993)；二苯並呋喃-4，4a二氧化酶，Trenz等，J.Bacteriol 176789-795(1994)；鄰苯二甲酸-3，4-二氧化酶，Eaton等J.Bacteriol.15148-58(1982)；和2-氯苯甲酸-1，2-二氧化酶(Selifonov等，Biochem Biophys.Res.Comm.213(3)759-767(1995)等)。在待批的共同擁有的美國專利申請系列號60/148,450，標題為「產生工業化學藥物的二氧化酶基因的DNA改組」(1999年8月12日提交)中描述了適用於製備本發明的酶文庫的這些和其它二氧化酶。
一旦將羥基引入某前導化合物或其它有機分子後，常需要如下所述在羥基上加上官能團(如糖基化、醯基化等)。因此，本發明還提供以下方法通過使該有機分子與第一重組衍生性酶文庫接觸獲得了有機分子衍生物庫，然後與第二重組衍生性酶文庫接觸。第二文庫的酶通常但不必須是能催化在官能團上加上化學基團的酶。另外，可用化學方法或其它本領域技術人員已知的方法修飾該羥基化化合物。
b.滷化酶滷化酶組成了可用於獲得有機分子衍生物文庫的另一類衍生性酶的例子。滷化酶通常滷化芳環，它可成為複雜的天然或非天然產物和其它感興趣的有機分子(如前導分子)的一部分。合適的滷化酶的例子包括以下酶滷化酶PrnA、PrnB、PrnC(U74493；(P.fluorescen)螢光變形菌)、推定的滷化酶PltM、PltD、PltA(AF081920；螢光變形菌)，推定的氧化酶/滷化酶(Y16952；東方擬無枝酸菌(Amycolatopsis orientalis))。雖然這些具體的酶的胺基酸序列相同性小於35％，編碼這些酶的多核苷酸也能用作探針來獲得可用於DNA改組的更密切相關的滷化酶。
c.其它替代類似的，可在有機化合物中引入含硫基團。例如通常可引入硫醇，來產生硫醇根陰離子，它對重金屬具有強親和力。常常在酶活性位點發現重金屬。用於這些實施例的衍生性酶包括例如醯基磺基轉移酶家族。可用此酶家族將磺基轉移到有機分子的芳基部分上。芳基磺基轉移酶家族包括許多具有非常高的胺基酸序列相同性(＞80％)的成員，從而使它們能容易地一起改組，產生重組衍生性酶文庫。可用於重組的合適的磺基轉移酶的例子包括例如芳胺磺基轉移酶(U33886，智人)、苯酚磺基轉移酶(D85541；獼猴Macaca Fascicularis)、苯酚磺基轉移酶(D29807；犬Canisfamiliaris)、苯酚磺基轉移酶(U34753；Bos taurus)和長壓定磺基轉移酶(L19998；Rattus norvegicus)。
在其它實施例中，一個或多個鹼性基團可取代先前存在的官能團。這些在醫藥化學中最常用的鹼性基團是胺、脒、胍、和幾乎所有含氮的雜環。在已具有生物活性的分子中引入這些基團的作用與引入酸性功能具有基本上相同的增溶作用。胺和鹼性雜環在成功的藥物中是普遍存在的。不難通過例如使用醯基轉移酶或酯酶，用含有胺基的雙功能化合物引入胺基。
2.在官能團上加上化學基團本發明的其它實施例提供了重組衍生性酶及其文庫，它們能催化在存在於感興趣的有機分子(如前導化合物)上的官能團上加上一個或多個化學基團。在這些實施例中，本發明的重組衍生性酶是可使一個基團與核心功能性藥物基團在不破壞該藥物功能的位置結合的那些酶。這樣的結合可提高該藥物分子作為前藥的溶解度。
結合可以是可逆或不可逆的。可逆的結合包括例如酯、肽和葡萄糖苷的結合。不可逆結合包括例如通過O-和N-烷基化結合。C-C鍵的建立可通過移植的側鏈(如二甲基氨基乙基或嗎啉基乙基鏈)或酸性側鏈(如羧基、磺基、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2)，或用中性基團(如甘油基)實現。用本發明的酶和方法還可加上更大的增溶基團。這些實施例包括但不限於-O-CH2-CH2-COOH、-NH2-CH2-CH2-CH2-、-C＝N-O-CH2-CO2H、O-嗎啉基乙基-和-O-CO-CH2-CH2-CO2H。
也可結合不可離子化的側鏈，包括例如羥基化和聚氧亞甲基化的側鏈或多種葡糖苷，以增強溶解度。這類側鏈還包括聚乙二醇衍生物，它也用於提高溶解度和緩釋。
用於在前導化合物或其它有機分子上預先存在的官能團上加上化學基團的衍生性酶的例子是葡糖苷轉移酶、醯基轉移酶、醯胺酶、N-甲基轉移酶、磷酸轉移酶、芳基磺基轉移酶等。
a.醯基轉移酶醯基化是一類修飾化學，理論上對有機分子的衍生可提供很大的多樣性。然而醯基化的常規化學方法通常是非選擇性的，需要多次保護和去保護步驟。在有機溶劑中通過醯基轉移酶(包括脂肪酶和蛋白酶)實現的酶醯基化可提供某些優點，例如底物-、立體-和區域選擇性。然而不能從一組天然存在的醯基轉移酶中獲得對於任何具體有機分子擁有所需的各種底物-、立體-、區域特異性的-種酶。因此，本發明提供了含有可用於合成前導化合物和其它有機分子的醯基化衍生物的群重組醯基轉移酶的文庫。
因此，本發明提供了編碼脂肪酶和蛋白酶和醯基轉移酶的重組多核苷酸文庫。這些方法涉及建立重組多核苷酸文庫作為編碼能進行乙醯化反應的酶的底物多核苷酸。這些酶包括例如脂肪酶和蛋白酶。脂肪酶和蛋白酶在有機溶劑中的逆反應可將各種醯基轉移到複雜天然產物的羥基位點上。這些酶通常具有廣譜底物專一性但活性很低。
例如，脂肪酶家族不難從公眾可得的資料庫中鑑定到。適用於改組(胺基酸相同性大於50％)的脂肪酶家族的一個例子包括下列成員Y00557，霍亂弧菌(Vibriocholae)；D50587假單胞菌KFCC10818(AAD22078)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(BAA23128)、銅綠假單胞菌(D50587)；乙酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)(AF047691)；和威斯康星假單胞菌(P.wisconsinensis)(U88907和2072017)、假單胞菌(P26877)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)(M74101)；短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)(A34992)；Galactomyces geotrichium(A02813)；皺落假絲酵母(Candida rugosa)(WO99/14338)；和乙酸鈣不動桿菌(S61927)。
許多編碼醯基轉移酶的基因(此醯基轉移酶利用輔酶A的各種羧酸衍生物作為底物)是已知的，催化這些反應的酶在原核和真核生物中是普通存在的。適合用作底物的核酸的例子包括例如糖苷6-O乙醯轉移酶(EC 2.3.1.18)；大腸桿菌的lacA(B0342(lacA)或其它生物體的lacA(GENBANK座位號MG396；D02_orf152(lacA)；MJ1064(lacA)，MJ1678，MTH1067)；絲氨酸O-乙醯基轉移酶(EC 2.3.1.30)，(GENBANK座位號B3607(cysE)、HI0606(cysE)、HP1210(cysE)、SLR1348(cysE))；醇O-乙醯基轉移酶(EC 2.3.1.84)，來自例如釀酒酵母(座位YGR177C、YOR377W)；芳胺N-乙醯基轉移酶(EC 2.3.1.118，代表性GENBANK座位包括Q00267、D90786、Z92774、I78931、AF030398、AF008204、AF042740)；肉毒鹼O-乙醯轉移酶(EC 2.3.1.7)來自例如哺乳動物或酵母(GENBANK座位YAR035(YAT1)和YM8054.01(CAT2))；膽鹼O-乙醯轉移酶(EC 2.3.1.6)、例如哺乳動物來源的；和乙醯輔酶A去乙醯長春刀靈4-O-乙醯轉移酶(EC 2.3.1.107)(St-Pierre等(1998)Plant J.14703-713)。
本發明改進酶的合適醯基供體包括例如可作為特定酶的供體的那些化合物。代表性醯基供體底物包括乙烯酯、三氟乙酯和其它脂肪族酯，以及苄基和脂肪酸等。見例如Mozhaev等(1998)Tetrahedron 543791-3982，具體是3976頁。
在本發明的一個優選模式中，改組的醯基轉移酶基因是編碼對醯基提供轉移的酶的基因，並使用宿主微生物菌株細胞中的內源乙醯輔酶A化合物池。還可通過在進行醯基化反應的宿主微生物菌株中引入乙醯輔酶A連接酶(可任選的通過DNA改組來改進)來增強乙醯輔酶A的內源性池。然後給菌株提供培養液中的外源乙酸或其它羧酸，它們隨後通過醯基連接酶與輔酶A連接。在待批的共同擁有的美國專利申請系列號09/373,928，題為「產生工業用化學藥物的單氧化酶基因的DNA改組」(1999年8月12日提交)中描述了合適的醯基連接酶及其優化方法。
醯基化衍生的感興趣化合物包括例如天然產物和例如多酮、視黃酮、肽抗生素等，以及非天然存在的化合物。這些化合物可作為例如抗生素、化療藥物等用途。一般底物分子在可發生醯基化的位置具有一個或多個羥基殘基。區域選擇性對於在可發生醯基化的位置具有多個官能團的分子特別重要。本發明的方法中提供了一種方法，通過它可獲得一種酶，此酶能醯基化感興趣的官能團，但不醯基化其它可能易被醯基化的基團。
特定分子的醯基化可減少不良特性。在採用本發明的方法開發的具有改進性能的藥物衍生物中，有抗癌藥，包括通過破壞微管蛋白運動而起作用的藥物。這些化合物包括例如秋水仙鹼、秋水仙胺、足葉草毒素、紫杉酚、長春鹼、長春新鹼等。感興趣的底物的一個特別例子是艾潑昔龍，它是一種候選的強抗癌藥，目前正在研究階段。選擇性在該化合物的兩個羥基上可醯基化提高其水溶性。可用本發明的重組醯基轉移酶文庫獲得在這些位點專一性醯基化的衍生物。其它例子有雷帕黴素和FK506。可利用醯基化雷帕黴素的C-28羥基或FK506非脫水的C-35羥基來將其免疫抑制活性與其神經再生活性分離開(Gold，B.G.(1997)Mol.Neurobiol.15285-306)。已知雷帕黴素或FK506與FKBP(FK結合蛋白)的一部分結合負責神經再生活性。醯基化可破壞FKBP-雷帕黴素(或FK506)與效應蛋白神經鈣蛋白(calcineurin)的結合。因此，上述羥基的醯基化將破壞神經鈣蛋白結合。區域選擇性將在這些修飾中起主要作用，因為在這兩種分子中都有幾個羥基。
不論重組多核苷酸文庫(編碼脂肪酶、蛋白酶或其它醯基化酶)是通過DNA改組或其它上述方法獲得，對該文庫的篩選在體外用純化或部分純化的酶或細菌或酵母裂解液在有機溶劑系統中，通過下面所述的一種或多種篩選方法更容易進行。例如，可通過檢測底物和酶促催化反應產生的衍生物之間的物理差異檢測天然產物和小分子的醯基化衍生物增加的信息。這些方法包括HPLC、質譜、UV/Vis和IR光譜、NMR等。
另一種目前優選的方法採用標記的醯基供體前體，如標記的羧酸或其衍生物，給予表達編碼改組脂肪酶、蛋白酶或其它醯基轉移酶的基因文庫的細胞。測量反應產物中標記物的量。對於疏水性反應產物，可將衍生物抽提到合適的有機溶劑中，或可以通過加入足量疏水多孔樹脂珠(如XAD1180、XAD-2、-4、-8)用固相法抽提這些化合物。就放射性標記而言，閃爍染料可存在於有機溶劑中，加到樣品中，或用化學方法摻入珠聚合物中。後者是一種閃爍臨近試驗法的改進。
檢測醯基化反應的區域選擇性的方法包括例如HPLC和以HTP模式的流通NMR譜。當用NMR譜測定天然產物或小分子的不同區域醯基化衍生物的相對量時，優選通過酶對同位素(13C和/或2H)標記底物的作用獲得後者。NMR技術的另一種變化包括採用對醯基供體中間物的前體同位素標記。
b.糖基轉移酶產生有機分子衍生物組合文庫的另一個感興趣的衍生性酶的例子是糖基轉移酶。糖基化可提高有機分子(包括前導分子)的生物利用率，降低毒性，和提高的水溶性。因為糖基化難於用化學方法進行，含糖的新抗生素(如新的糖肽和糖基化的大環內酯抗生素)難於製備。
然而用糖基轉移酶能夠實現含有一個或多個羥基的有機受體化合物的糖基化。因此伴隨著本發明重組酶文庫提供的糖基化活性的變化越多，可獲得許多有機分子變體。用本文提供的技術，提供了能催化各種先前不能實現的糖基化的新酶。例如，本發明文庫中的重組衍生性酶可顯示對受體(如複雜的天然和合成的有機分子)和供體(如不同的糖)的改變的專一性。還可獲得合成氨基脫氧糖能力的提高，如通過生物轉化。用本發明的重組衍生性酶，可得到新的底物，建立和改進新的酶活性；可用生物催化代替困難的化學方法，實現大規模生產。
用本文所述的多樣性產生方法(包括例如改組)可演化糖基轉移酶，產生在各種不同的反應參數上顯示最佳性能的重組糖基轉移酶。典型的反應參數包括但不限於反應專一性、酶的混雜程度和立體化學。例如，可任選地將酶演化成能轉移不同的核苷二磷酸(NDP)糖和NDP-糖類似物；能將糖轉移到不同的受體分子；能使糖結合在(與天然存在的酶相比)不同的位置上，以具有在含有受體的多樣位點中位置的模糊性，和能催化多步糖基化。
在另一個實施例中，可演化酶產生重組衍生性酶，該酶能利用其它可任選合成的糖。例如激活的糖(如脫氧和硫酸化的糖)；非天然糖(如硝基化、磺酸化、磷酸化和雙脫氧糖)；聚醇(如肌醇(inositol)、肌醇磷酸酯和肌醇膦酸)；其它類似糖的結構和化合物以及其它核苷。
可任選的用重組糖基轉移酶將糖轉移到另外的糖受體上，包括但不限於聚酮、非核糖體肽、有機合成的複雜分子和化合物文庫。本發明中感興趣的其它糖接受體包括但不限於無糖基萬古黴素鹽酸鹽(一種肽抗生素)、促生長素抑制素(一種生長激素)、胰島素和胰高血糖釋放抑制蛋白、膽酸(一種去汙劑類固醇)、諾加黴素(抗腫瘤抗生素)、L-甲狀腺素(一種甲狀腺激素)、丁香醛連氮、阿柔比星(抗腫瘤抗生素和商品RNA合成抑制蛋白)、鹽酸羥苄羥麻黃鹼(一種腎上腺能激動劑和平滑肌鬆弛劑)、利福黴素(一種抗生素)和硫酸瑞斯託黴素(一種抗生素)。這些化合物都具有與萬古黴素糖苷配基的3-二維相似性，如通過與從Chemweb(http//www.chemweb.com/databases)獲得的化學資料庫的分子動態界面定義的那樣。
圖1-10顯示了這些分子和它們的感興趣的糖結合位點。其它可糖基化的感興趣的天然產物包括例如洛伐他丁、無糖基紅黴素、海膽黴素、紫杉酚和頭孢氨苄。
可任選的用演化的糖基轉移酶糖基化任何含有至少一個羥基的分子。優選藥物學上感興趣的化合物。可任選的僅在一個位置糖基化具有一個以上的羥基的糖接受體。如此可通過在一個或其它位置糖基化來產生不同的異構體。另外，例如當限於NDP時，可任選在不同位置以不同程度糖基化具有一個以上羥基的化合物。在另一個實施例中，用NDP-糖和糖基轉移酶組合在多維上處理化合物，可提供重複糖基化。
在一些實施例中，選擇的糖基轉移酶是能從UDP-己糖衍生物上轉移己糖殘基的糖基轉移酶。優選的己糖包括例如D-葡萄糖、D-半乳糖和D-N-乙醯葡糖胺。結合中需採用演化的糖基轉移酶的感興趣的糖包括但不限於以下的糖UDP-N-乙醯半乳糖胺、UDP-N-乙醯葡糖胺、UDP-半乳糖、UDP-半乳糖醛酸、UDP-葡糖醛酸、UDP-甘露糖、UDP-木糖、UDP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖、ADP-核糖、ADP-甘露糖、GDP-海藻糖、GDP-葡萄糖和GDP-甘露糖，所有都可購自Sigma(St.Louis，MO)。脫氧糖，如2-脫氧-D-木己糖、2-脫氧-D-阿拉伯糖己糖、L-海藻糖、L-鼠李糖、D-黴菌素糖、L-瓦拉糖(vallarose)、D-海藻糖、D-奎諾糖、D-鼠李糖、D-坎那糖(canarose)、D-奧利糖(oliose)、D-毛地黃糖(digitose)、D-波伊文糖、L-夾竹桃糖、抑素糖(chalcose)、D-阿米糖(amicetose)、L-香草糖(rhodinose)、蛔糖、阿比可糖、泊雷糖、泰威糖、可立糖等。這些糖和其它糖在Annu Rev.Microbiol，48223-256(1994)中有所描述。
本發明提供了獲得重組多核苷酸的方法，這些多核苷酸編碼某些性能增強的糖基轉移酶，其特性的增強提高了這些酶在糖基化有機化合物合成中的用處。在目前的優選例中，在加到生物催化反應混合物中的微生物中引入編碼改進的糖基轉移酶的多核苷酸。在一些實施例中，用獲得糖基轉移酶基因以外的微生物表達糖基轉移酶。
在目前優選例中，發明方法中所用的糖基轉移酶，是通過使編碼該酶的核酸重組，然後經過選擇鑑定得到編碼具有增強的感興趣特性的酶的重組多核苷酸而優化的。例如，可選擇那些重組多核苷酸，它們編碼的酶能選擇性只糖基化一個羥基。這樣可控制區域選擇性，以提供兩種可能的異構化合物，或者能糖基化各種各樣的化合物，如能利用天然糖基轉移酶通常不利用的各種糖和糖同類物的酶，和能糖基化各種天然糖基轉移酶不能結合糖分子的有機化合物的酶。
可通過對編碼這些酶的核酸(即作為重組底物的核酸)應用例如本文所述的各種多樣性產生的重組方法(例如改組)，來建立用於鑑定編碼具有增強特性的重組糖基轉移酶，經過選擇或篩選的重組多核苷酸文庫。在建立重組多核苷酸文庫中，適合用作底物的糖基轉移酶來源包括例如東方擬無枝酸菌(A.orientalis)的gtf基因，它編碼能催化例如葡萄糖轉移到無糖基萬古黴素的糖基轉移酶。催化這些反應的酶在原核和真核生物中是普通存在的。
可從糖基轉移酶超家族中選擇一個或多個糖基轉移酶，與相似的同源序列排列對比，針對這些同源序列進行改組。糖基轉移反應在自然界普遍存在，本領域技術人員可從各種生物中用一種或多種已知方法分離得到這些基因。以下例舉可用作建立重組文庫核酸來源的編碼糖基轉移酶的核酸，然後篩選文庫鑑定顯示有機化合物的糖基化改進(如改變的底物專一性)的那些。例如在建立本發明的重組文庫中可用肌醇1-α-半乳糖轉移酶，EC2.4.1.123；苯酚β-葡萄糖轉移酶，EC2.4.1.35(NTU32643、NTU32644)；視黃酮7-O-β-葡萄糖轉移酶，EC2.4.1.81；視黃醇3-O-葡萄糖轉移酶，EC2.4.1.91(AB002818、ZMMCCBZ1、AF000372、AF028237、AF078079、D85186、ZMMC2BZ1、VVUFGT)；o-二羥基香豆素7-O-葡萄糖轉移酶，EC2.4.1.104；牡荊葡基黃酮β-葡萄糖轉移酶，EC2.4.1.105；松果醇葡萄糖轉移酶EC2.4.1.111；單萜醇β-葡萄糖轉移酶，EC2.4.1.127；芳胺葡萄糖轉移酶EC2.4.1.71；sn-甘油-3-磷酸1-半乳糖基轉移酶，EC2.4.1.96；葡糖醛酸轉移酶，EC2.4.1.17(RNUDPGTR、AA912188、AA932333)；人UGT和同工酶(約35個基因)；水楊基-醇葡萄糖轉移酶，EC2.4.1.172；4-羥基苯甲酸4-O-β-D-半乳糖轉移酶，EC2.4.1.194；玉米素O-β-D-葡萄糖轉移酶，EC2.4.1.203；D-海藻糖-2-葡萄糖轉移酶，VFAUDPGFTA；和脫皮甾醇UDP-葡萄糖轉移酶(egt)MBU41999作為底物。
本領域技術人員可通過富集培養技術從各種土壤、沉澱、空氣和水樣分離的許多微生物中找到合適的糖基轉移酶基因。特別是從土壤細菌分離出的糖基轉移酶，能糖基化多種多酮苷元，這些糖基化的天然產物具有許多不同的生物活性，如抗生素和抗癌藥的活性。編碼這些酶的基因不難從公共資料庫得到。例如糖基轉移酶(抗生鏈黴菌(S.antibioticus)，AJ002638；紅色酵母(Sac erythraea)Y14332；委內瑞拉鏈黴菌(S.venezuelae)，AF079762；波塞鏈黴菌(S.peucetius)，L47164和弗式鏈黴菌(S.fradiae)，X81885)。這些基因具有50％的胺基酸序列相同性，因此任何兩條或多條是作為一個家族一起改組是理想的。
例如，用於初始改組的糖基轉移酶是gtfA、gtfB、gtfC、gtfD和gtfE，來自不同的東方擬無枝酸菌菌株。這些基因編碼將糖基轉移到萬古黴素和艾裡莫黴素(eremomycin)的糖苷配基上的糖基轉移酶，它們是非核糖體肽抗生素。ZmijewskiBriggs FEMS Microbiology Letters 59，129-134(1989)。Solenberg等，ChemBiol.4，195-202(1997)。Wageningen等ChemBiol.5，155-162(1998)。例如，GtfB和gtfE從TDP-葡萄糖或UDP-葡萄糖上將糖基轉移到萬古黴素上。這些糖基轉移酶基因具有59％(gtfA-gtfD)-82％(gtfB-gtfE)之間的相似性。蛋白質序列具有52％(gtfA-gtfD)-80％(gtfB-gtfE)之間的相似性。可從不同的東方擬無枝酸菌東方亞種菌株擴增得到5個公開的基因(gtfD和gtfE來自ATCC 43490或ATCC 43491，gtfA、gtfB、gtfC來自NNRL18098)。其它許多未確定特徵，但是相關的糖基轉移酶基因可任選的從其它東方擬無枝酸菌菌株(ATCC 19795、21425、35164、15165、15166、39444、43333、53550和53630)進行PCR擴增，並克隆入合適的克隆和表達載體中。可從產巴爾西黴素(balhimycin)的地中海擬無枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)菌株DSM5908和其它擬無枝酸菌擴增其它基因(Pelzer等(1997)J.Biotechnol.57115-128)。可用SDS-PAGE和考馬斯染色和/或如果加入檢測標記，可用蛋白質印跡測試gtf編碼的蛋白質在大腸桿菌中的表達。可測試單個克隆如gtfB和gtfE的野生型活性。例如，gtfB和gtfE可從TDP-葡萄糖或UDP-葡萄糖上將葡萄糖轉移到萬古黴素的苷元上。(Folena-Wassermann等，J.of Antibiotics 39，1395-1406(1986))。可用反相HPLC監測萬古黴素苷元的體外糖基化。(Solenberg等ChemBiol.4，195-202(1997))。然後，用功能性gtfB和gtfE克隆和幾個表達所需大小多肽鏈的其它基因的克隆(如gtfA、gtfC、gtfD等)在篩選載體存在下產生gtf基因的PCR產物。例如，用各種上述改組方法產生和重新裝配各PCR產物的DNAsel片斷。通常片斷大小在25個鹼基對和250個鹼基對之間，但該大小可用本領域熟知的方法通過實驗不難測定。
c.甲基轉移酶甲基轉移酶是可將一個化學基團加到存在於前導化合物或其它有機分子上的官能團上的另一種感興趣的衍生性酶。例如，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依賴性甲基轉移酶(MT)構成了一類酶，它們形成蛋白質、核酸、糖、多糖、脂類、木質素和各種低分子量化合物(如大環內酯)的甲基-酯、甲基-醚、甲基-硫酯、甲基-胺和甲基-醯胺衍生物。SAM攜帶有活化的甲基，此甲基能有效的轉移到具有廣大範圍化學反應性的親核試劑上。活化甲基從SAM轉移到受體親核試劑上是熱力學理想的，因此驅動甲基轉移反應至完成。
一類感興趣的甲基轉移酶是N-甲基轉移酶。作為例子，下列N-甲基轉移酶具有至少59％的胺基酸序列相同性，因此使該家族非常適合改組推定的TDP-N-二甲基德氨糖-N-甲基轉移酶(U77459；紅色酵母(Saccharomyces erythraea))、甲基轉移酶(AJ002638；抗生鏈黴菌(S.antibiotics))、N，N-二甲基轉移酶(AF079762；委內瑞拉鏈黴菌(S.venezuelae))、N-甲基轉移酶(X81885；弗式鏈黴菌(S.fradiae))。該酶家族常常甲基化與複雜天然產物結合的氨基脫氧糖的氨基。
還感興趣的是O-甲基轉移酶，其幾個家族是已知的。例如，下列甲基轉移酶家族能甲基化複雜天然產物的羥基31-去甲基-FK506甲基轉移酶(U65940；鏈黴菌)；甲基轉移酶(X86780；吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus))、碳黴素4-O-甲基轉移酶(D30759；耐熱鏈黴菌(Streptomyces thermotolerans))和O-甲基轉移酶(M93958；生米卡鏈黴菌(Streptomyces mycarofaciens))。這些家族成員在胺基酸水平具有45％以上的相同性。
d.醯胺酶本發明還提供了重組醯胺酶文庫。該酶家族可用於在有機分子中引入醯胺基團。醯胺酶反應的逆反應將羧酸基團轉變成羧醯胺。適合本發明方法中使用的一個這樣的家族包括下列醯胺酶，它們在胺基酸水平具有55％以上的相同性N-乙醯基-脫水胞壁醯-L-丙氨酸醯胺酶(AF082575；銅綠假單胞菌)，N-乙醯基-脫水胞壁醯-L-丙氨酸醯胺酶(U40785；陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae))、AmpD蛋白(X15237；大腸桿菌)和AmpD蛋白質(U32716；流感嗜血菌(Haemophilus influenzae Rd)。
e.磷酸轉移酶還感興趣的是在前導化合物或其它有機分子的現有官能團上加上磷酸基團。因此，本發明提供了用於獲得磷醯基化有機分子衍生物的重組磷酸轉移酶的文庫。例如，可對大環內酯和肽磷酸轉移酶家族(其成員具有至少36％的胺基酸序列相同性)進行重組(如大環內酯2』-磷酸轉移酶I(D16251；大腸桿菌)、大環內酯2』-磷酸轉移酶II(D85892；大腸桿菌)、紫黴素磷酸轉移酶(X02393；酒紅鏈黴菌(S.vinaceus))。這組酶能將磷醯基轉移到大環內酯或肽抗生素上，從而滅活它們。通過使用全組磷酸轉移酶文庫可獲得大環內酯或肽抗生素不同位點的磷醯基化。
f.其它酶類除以上列出的以外的酶類，在前導產生或/和優化中引入或修飾功能基團也很重要。例如，能催化氧化-還原反應的酶對於在有機化合物中將功能性醇氧化成醛/酮，或將醛/酮基團還原成醇是重要的。然後可用所述的其它類酶進一步修飾這些新建立的基團。適用於改組的一個這樣的家族是乳糖脫氫酶，它能將酮轉變成醇，具有80％以上的胺基酸序列相同性(Y00711。智人；U07181，褐家鼠(Rattusnorvegicus)；77022A，豬(Sus scrofa domestica)；L79954，(Trachemys script)等)。醇脫氫酶是另一種能將醇氧化成醛的酶家族。該酶家族的合適基因不難得到用於改組(M84409，智人；L15704，(Peromyscus maniculatus)；156882，鴕鳥(Struthiocamelus)；P80222，密西西比鱷(Alligator mississippiensis)等)。這兩個酶家族的改組可改變它們對更複雜的有機化合物的底物專一性。
其它酶家族，例如能將硫化物氧化成亞碸，硫醇氧化成硫醛的酶，和能催化羥腈形成和環氧化等的酶也是DNA改組的目標，因此在組合生物合成中是有價值的催化劑。
C.用重組衍生性酶文庫獲得有機分子衍生物的組合文庫在其它實施例中，本發明提供了獲得有機分子衍生物文庫的方法。這些方法涉及將一種有機分子(一種底物)與重組衍生性酶文庫和其它必需的試劑接觸，形成有機分子衍生物文庫。如上所述的衍生性酶可催化下列反應，例如a)修飾存在於有機分子上的一個或多個官能團；b)在存在於有機分子上的一個或多個官能團上加上一化學基團；或c)在有機分子上引入新的官能團。
1.用於衍生的感興趣的有機分子感興趣的有機分子包括例如具有藥物學活性、除草劑或殺蟲劑活性等的有機分子。在感興趣的有機分子中有天然產物，如抗生素(包括例如聚酮、類固醇、非核糖體肽抗生素等)。例如，類固醇是藥物的使用非常廣泛的基礎結構，其中環上的取代基可將藥物靶向許多不同的治療目標。這些結構大多數是從天然來源衍生的，並作過效力篩選。類固醇藥物上觀察到的取代基包括羥基、甲氧基、烷氧基、糖基化、硫酸化、滷化、雙鍵和三鍵、羰基等。類固醇環結構的化學衍生可在幾個已有詳細描述的位點上進行，或通過修飾天然存在的結構或其非天然存在的變體來實現。
環狀糖肽和大環內酯(如萬古黴素和紅黴素)也是化學上困難的結構，它們可通過使用改組酶文庫修飾。在自然界分離得到了許多這樣的結構，文獻中、公司庫存中也有描述，具有令人感興趣的生物活性但是其它方面是失敗的。如毒性、生物利用率、溶解度、藥物動力學、缺乏選擇性是候選藥物不能成為藥物的一些原因。可利用改組文庫改善這些缺點和其它特徵。
前列腺素、生物鹼、蒽醌是其它具有許多生物活性成員的分子家族。這些也是用改組酶文庫改進的良好候選對象。
可用重組衍生性酶衍生的藥物化合物的具體例子包括例如筒箭毒鹼鹽酸鹽、阿庫氯銨、泮庫溴銨、維庫溴銨、阿曲庫銨苯磺酸鹽、776C85、7CIMe-MDO-CPT、9-氨基喜樹鹼、A-007、A-108835、A-121798、紫花洋地黃甙A和B、毛花甙A、B和C、α-乙醯地高辛、β-乙醯地高辛、地高辛、β-甲基地高辛、κ-毒毛旋花苷、κ-毒毛旋花素-β、鈴蘭苷、鈴蘭毒甙、葡萄糖海蔥甙A、海蔥甙A、海蔥次甙、海蔥擬素。還感興趣的有利膽藥和膽動力藥，包括例如羥甲香豆素、肝泰樂、鵝去氧膽酸和烏索脫氧膽酸鹽。氟可龍、帕拉米松、地塞米松、倍他米松、可的松、氫化可的松、強的松、潑尼松龍、曲安奈德、曲安西龍、甲基潑尼松龍和潑尼立定是適合衍生的糖皮質激素。感興趣的皮質類固醇還包括例如潑尼卡酯、氫可的松醋丙酯、氟考丁酯、(ioteprednol etabonate)等。
2.酶反應為了獲得有機分子衍生物文庫，使底物與重組酶文庫的成員接觸。可用許多方法進行酶促反應，包括用全細胞生物轉化、滲透的細胞、細胞裂解液和純化的蛋白質。
當底物(如有機分子)與含有重組衍生性酶文庫的細胞接觸時，發生全細胞生物轉化。此文庫可表達成可複製基因包(如噬菌體或酵母展示)上的表面蛋白質，或作為與溶液中的底物相互作用的分泌蛋白質。還可在細胞內表達這些酶，此時底物擴散進入細胞然後發生反應。在每一種情況下，用本領域技術人員已知的方法(包括例如離心、沉澱、用有機溶劑抽提和過濾)從細胞中分離得到衍生性酶作用的產物。
可通過加入許多熟知的滲透劑(如硫酸多粘菌素B)滲透表達此文庫的細胞。可改進滲透劑水平，使底物和產物通過自由擴散到文庫的酶中，並再次離開細胞。在滲透劑水平較高時，蛋白質可釋放到溶液中。感興趣的化合物將從全細胞中分離得到。
可以細胞裂解液形式利用此文庫，其中可通過施加以下熟知的裂解條件來破碎表達此文庫的細胞，包括加入去汙劑、PMBS和溶菌酶或超聲。可在反應前通過離心除去細胞碎片，雖然這不是必需的。然後在裂解液中加入底物，在確定溫度下培育一定的時間。然後如前所述抽提產物並如下分析。
另外，可用許多熟知的技術在篩選或用於製備有機分子衍生物之前純化此文庫編碼的重組衍生性酶。這些方法包括例如凝膠過濾、離子交換、親和或疏水層析，得到部分或完全純化的蛋白質。本領域技術人員還知道許多其它純化方法。然後使純化的蛋白質在有利於酶活性的條件下接觸底物。
可用標準方法使用於轉化的反應條件對最大程度酶促轉化最優，這些方法包括用最佳的鹽水平、緩衝液、溫度和反應時間長度。酶促反應中使用的底物和任何其它物質優選採用能促進高轉化率的濃度。
有機分子和其它反應試劑與重組衍生性酶的接觸可一次用整個酶文庫，或與此文庫中重組酶的混合物，或在一次反應中與一個重組酶接觸。如果使用混合物，一旦用所述方法鑑定到活性的混合，可展開此混合物，以分離得到顯示所需活性的具體克隆。例如，可將表達重組衍生性酶文庫各個成員的集落置於微量滴定板或其它合適的容器中，進行高通量篩選。
在一些實施例中，在與其它反應物接觸之前，重組酶的文庫成員被固定在固相載體上。例如，可將編碼酶的重組多核苷酸引入一表達載體，該載體還包括標記的編碼序列，從而使重組衍生性酶作為帶有標記的融合蛋白而表達。另外，標記可以在表達後與衍生性酶結合。此標記通常是一結合對的成員，其中對應的成員易於獲得，並固定在固相載體上。例如，重組酶可表達成與生物素的融合蛋白，然後通過與鏈黴親和素結合而固定。其它合適的結合對包括例如甘露糖結合蛋白和澱粉、組氨酸標記和固定化的金屬離子、穀胱甘肽-S-轉移酶和還原的穀胱甘肽、鏈黴親和素結合標記和鏈黴親和素、表位標記(如E-標記、myc-標記、HAG-標記、His-標記)和相應的抗體、幾丁質結合功能域和幾丁質、S-標記和RNase減去S-肽突變體、纖維素結合蛋白和功能域與纖維素、硫氧還蛋白和DsbA與硫醇化合物(如ThiobondTM)、聚陽離子標記(如聚精氨酸)和聚陰離子柱、IgG和IgG衍生的肽與蛋白質A、蛋白質G等、鈣調蛋白結合肽和鈣調蛋白、histactophilin和固定的金屬螯合層析。
與酶連接的標記結合的結合對成員優選與固相載體結合。適用的固相載體是本領域技術人員已知的。本文所用的固相載體是基本固定排列的材料基質。固相載體的例子包括玻璃、塑料、聚合物、金屬、非金屬、陶瓷、有機物等。固相載體可以是平面或平坦的，或可以是幾乎不同的構型。例如，底物可以作為顆粒、珠、束、沉澱、凝膠、片層、管、球、容器、毛細管、墊、薄片、薄膜、盤、蘸棒、滑片等形式存在。磁珠或顆粒(如磁性乳膠珠和氧化鐵顆粒)是可用於本發明的固相底物的例子。在例如美國專利號4,672,040中描述了磁性顆粒，可從例如PerSeptiveBiosystems，Inc.(Framingham MA)、Ciba Corning(Medfield MA)、BangsLaboratories(Carmel IN)和BioQuest，Inc.(Atkinson NH)購得。選擇底物擴大信噪比，主要是使背景結合最小化，從而容易洗滌和節約成本。
可通過例如從儲器取出珠或蘸棒，傾空或稀釋儲器如微量滴定板孔，漂洗珠(如具有鐵核心的珠可用磁鐵輕易的分離和洗滌)、顆粒、層析柱或用洗液或溶劑過濾，將其它細胞組分或從反應物等與重組酶分離。分離步驟有時包括延長漂洗或洗滌，或多次漂洗或洗滌。例如，當固相物質是微量滴定板時，可用洗液洗滌諸孔數次，該洗液通常含有能干擾以後有機分子衍生物的篩選的反應混合物的成分，如鹽、緩衝液、去汙劑、非特異性蛋白等。
本發明提供的重組衍生性酶文庫不僅可用於獲得有機分子衍生物文庫，還提供了一個來源，可從該來源鑑定能催化感興趣的特定反應的重組酶。例如，一旦鑑定出特定的有機分子衍生物具有所需特性，可從酶文庫中鑑定出能催化特定衍生物的形成的特定的重組酶。
3.有機分子衍生物的篩選此重組衍生性酶文庫可用於產生有機分子衍生物的組合文庫，進而篩選後一文庫，以鑑定顯示所需活性的衍生物。在這些實施例中，篩選的產物常常是以前未曾製備過的化合物。另外，此重組酶文庫提供了一種來源，可從此來源鑑定到能催化某有機分子的特定已知修飾的酶。因此例如，可從此文庫獲得一種酶，該酶能酶促合成已知的化合物，該化合物先前僅能通過效果較差的方法(如化學合成)來合成。
一旦合成了有機分子衍生物文庫，一般對該文庫進行篩選，以鑑定具有特別興趣的衍生物。通常為了鑑定在特定生物活性上顯示有改進的衍生物，可採用設計來檢測和/或定量檢測所需活性的生物試驗。可隨機進行所需生物活性(包括例如細胞毒性、基因毒性等)、所需的生物利用率(包括血漿半衰期、腎清除等特性)、所需物理化學特性(包括水溶性、脂溶性、有機溶劑(如正辛醇)中的溶解度、pH穩定性(如胃中的低pH環境)、溫度穩定性、對小腸酶的抗性、肝臟酶的抗性、血漿酶的抗性、組織滲透性(如皮膚、黏膜等)、血腦屏障滲透性)和其它可通過衍生實現的所需特性的篩選，例如與化合物的結構無關，或可以先分析文庫中化合物的結構，以鑑定具有感興趣特定結構的化合物。一旦鑑定到具有所需生物活性的化合物，可使用結構分析鑑定此重組衍生性酶文庫賦予的結構特徵。
在大多數情況下，預計文庫中存在的重組衍生性酶以可預測的方式化學修飾某給定底物。例如，糖基轉移酶將糖基轉移到底物的氨基或羥基上。這可導致該分子物理行為可預測的改變，而用於篩選。此特定酶文庫催化任何給定底物的化學轉化很可能是相同的，例如糖基轉移酶將一糖基置於底物上，甲基轉移酶將加上一個甲基，P450將加上一個羥基等。這使得能對於各文庫設計基因篩選方法。例如，糖基轉移酶總是產生一種糖-底物連接，因此對於某種連接的糖的特定化學測試將能檢測產物的形成。激酶文庫將把一個磷酸基團轉移到底物上，特定磷酸試驗將能檢測產物的存在。
可得到許多分析篩選工具來檢測組合文庫中的化合物結構。例如，已知許多方法能以高通量形式檢測低濃度化合物，包括流式分析NMR和質譜。這些分析工具或其它工具包括UV/Vis和IR譜、螢光光譜、發光等可用於同時檢測和定量酶促反應中產生的新化合物。
在文庫篩選中不期望100％的底物轉化成產物，因此宜建立分析技術，來檢測酶活性產生的特定變化。例如，可通過觀察與酶接觸後質譜中14amu的增加，檢測重組酶文庫中對特定的感興趣的底物具有甲基轉移酶活性的酶的存在。因此，常常可特異性地監測和檢測此文庫導致的底物化學結構中的改變。然後可將這些變化與能催化該特定反應的重組酶文庫成員聯繫起來。
另一種檢測酶文庫中能催化新底物的特定反應的重組酶是否存在的方法是例如，在反應過程中摻入一分子標記。合適的標記包括例如放射性標記如3H、14C、32P等。這可用放射性協同底物(如3H3甲基S-腺苷甲硫氨酸)來實現，其中僅標記甲基化的反應產物。還可採用其它標記；許多是本領域已知的。例如，可用含有標記的糖分子檢測糖基化。
在一些情況下，預計此改組文庫對底物作用的產物可提供一種比底物在外部應力(如極端pH)下更穩定的產物，或提高此化合物在特定溶劑中的穩定性。還可用合適的分析方法或生物試驗方法監測這種行為的改變。
在某些情況下，檢測新形成的產物可能需要通過標準層析方法(如TLC、HPLC、CE或GC)將該產物與底物分開。這之後可以進行分光光度或其它(如火焰離子化、質譜)方法，以檢測感興趣的新化合物的形成。
實施例提供下列實施例是為了說明，不是為了限制本發明。
實施例1糖基轉移酶文庫的產生和去萬古胺萬古黴素的產生的高通量篩選方法該實施例描述了如何產生重組糖基轉移酶文庫，和用這些酶產生去萬古胺萬古黴素的方法。
A.從東方擬無枝酸菌東方亞種菌株克隆gtfA、B、C、D、E基因1.gtf編碼DNA的產生基因組DNA的製備從ATCC和NRR1獲得了東方擬無枝酸菌東方亞種菌株ATCC43490和NRRL18098。根據提供者的推薦製備了瓊脂糖培養皿中的起始培養物。液態培養物在TSB，25℃-28℃生長2-5天。根據標準方法(Ausubel等(1987)Current Protocolsin Molecular Biology，第一版，John WileySons，Inc.NY)抽提基因組DNA。
加入引物進行PCR用基因組DNA、1皮摩爾基因特異性引物、200微摩爾dNTP、2單位Deep Vent聚合酶和0.2單位其5』-3』外切核酸酶活性缺乏變體，在1.5M三甲銨乙內酯和1-3.5mM MgSO4的50微升體積中，根據酶供應商(New England Biolabs)的指南進行PCR。在所有情況下使用用蠟珠(MβP)的熱起始。在DNA工程熱循環儀上，按下列方案設置循環開始95℃5分鐘；5輪95℃45秒，76℃1分鐘20秒；5輪95℃45秒，75℃1分鐘20秒；5輪95℃45秒，74℃1分鐘20秒；10輪95℃45秒，73℃1分鐘20秒；10輪95℃45秒，73℃1分鐘20秒。根據輸入序列U84349和U84350設計了所有引物。對於gtfA的擴增，使用了引物gtfA.For和gtfA.Rev。對於gtfB的擴增，使用了引物gtfB.For和gtfB.Rev。對於gtfC的擴增，使用了引物gtfC.For和gtfC.Rev。對於gtfD的擴增，使用了引物gtfD.For和gtfD.Rev。對於gtfE的擴增，使用了引物gtfE.For和gtfE.Rev(表1)。
表1引物、寡核苷酸和多核苷酸
用NdeI和EcoRV消化得到的PCR產物。用瓊脂糖凝膠電泳和QIAEXII(Qiagen)純化對應於gtf基因的消化的PCR產物。
2.載體pCKZEBB的性質和結構載體pCKZEBB衍生自pAK400(Krebber等(1997)J.Immunol.Meth.20135-55)。保留了pAK400的下列特徵。保留lacIq基因壓制lac操縱子，保留lacIq基因和lac啟動子(lacp/o)之間的轉錄終止子(hpt)，以終止從lacI啟動子通讀轉錄入lac啟動子控制的操縱子，降低基線非誘導表達，保留lac啟動子操縱子，以引發轉錄和控制轉錄，保留在靶基因起始密碼子前面的來自T7噬菌體基因10的T7g10前導序列，能從NdeI限制性位點的ATG起始密碼子引發強翻譯。在NdeI-HindIII lac啟動子操縱子控制的表達盒後是lpp轉錄終止子(lppt)，然後是f1複製起始點，以產生單鏈RNA，然後是氯黴素抗性基因(camR)和雙鏈DNA複製的ColE1起點。
在pCKZEBB中，lac啟動子操縱子控制的多順反子信息，替換了pAK400中的lac啟動子操縱子控制的單順反子信息。lac啟動子轉錄的操縱子位於pAK400載體唯一的NdeI和HindIII之間。在pCKZEEB中，lacZ基因的變體(起始密碼子ATG摻入NdeI位點，除去內部NdeI位點，在基因末端，終止密碼子前加入EcoRV位點，產生的EcoRv lacZ片段在載體中倒轉)作為編輯片段插入NdeI EcoRV靶基因克隆位點。可用靶糖基轉移酶基因替換該lacZ片段。在lacZ後面是生物素化的標記(aa序列)，然後是衍生自trp基因末端的翻譯偶聯標記。當替換lacZ編輯(stuffer)片段時兩個標記都在框內與靶糖基轉移酶融合。翻譯偶聯標記(TGA)終止密碼子的A核苷酸構成了綠色螢光蛋白編碼基因(GFP；Crameri等(1996)Nature Biotechnol.14315-319)的翻譯起始密碼子部分。GFP基因後面是PCR克隆的birA基因，它含有BL21(DE3)的核糖體結合位點。似乎在birA基因中存在序列模糊性，因為在該區域中存在一個NcoI限制性位點。
圖19顯示了pCKZEBB的圖，此載體的核苷酸序列為SEQ ID NO19。
當在30微克/毫升的氯黴素和1mMIPTG上生長時，用pCKZEBB轉化的大腸桿菌不顯示綠色螢光。當編輯lacZ片段被全長靶基因(框內含有生物素化-翻譯偶聯標記)所替換時，A)IPTG誘導的靶基因表達通過與GFP基因翻譯性偶聯打開了攜帶細菌綠色螢光的質粒(OppenheimYanofsky(1980)Genetics 95，785-795)，和B)該靶基因將在體內通過birA衍生的生物素全酶連接酶(Smith等(1998)Nul.Acids.Res.261414-1420)加上生物素化標記而生物素化。(Schartz(1993)Bio/Technology111138-1143)。
3.gtfPCR克隆入pCKZEBB用NdeI和EcoRV切割載體pCKZEBB，作為兩部分除去lacZ基因編輯。得到的載體用牛小腸磷酸酶脫去磷醯基。用QIAEXII(Qiagen)從瓊脂糖凝膠上分離出對應於該載體的DNA片段。將上述的EcoRV和NdeI消化的PCR產物按照標準方法連接到此載體片段中。連接後，用連接混合物轉化電穿孔的大腸桿菌TG1電感受細胞(Stratagene)，接種於含有30微克/毫升氯黴素和1mM IPTG的LB-瓊脂培養平板上，37℃生長過夜。挑選顯示不同程度螢光的綠色螢光菌落，並製備質粒DNA。
4.限制性分析和測序用限制性酶分析得到的載體，測序含有插入物的克隆。鑑定能表達作為生物素化-翻譯偶聯標記融合蛋白的糖基轉移酶之一的質粒。採用攜帶了對應於公開序列的基因的克隆，作為改組模板。
B.通過家族改組重組和突變單、雙、三、四和全部五個基因組合。
1.pCK載體中的wt基因擴增通過引物CK.For3和H3.Rev用聚合酶按照廠商推薦，從得到的質粒(包括一些載體衍生的旁側序列)擴增糖基轉移酶基因。用Qiaquick柱(Qiagen)純化PCR。
2.隨機DNA片段的產生用DNAseI(Boehringer)消化衍生自各質粒的PCR產物。置於冰上停止反應，從2％瓊脂糖凝膠中用玻璃過濾皿(glassfilter disks)(Whatman)和透析膜(Spectrapor)分離得到所需大小的片段(Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91107474-10751和Stemmer(1994)Nature 370389-391)。
3.糖基轉移酶基因的裝配對於各家族裝配反應，調節了DNAsed DNA片段的幾種濃度和比例以及PCR循環參數，從而在步驟4中獲得最大量的改組基因(Crameri等(1998)Nature391288-291，Christians等(1999)Nature Biotechnol.17259-64)。
4.PCR拯救糖基轉移酶基因用2微升最終裝配反應物作為模板。在最後的PCR反應中，加入1微摩爾引物CK.For2和N3.Rev、每1單位Tag聚合酶加0.2mM各核苷酸。設定了下列PCR參數1輪96℃3分鐘；30輪96℃0.5分鐘，60℃0.5分鐘，72℃1.5分鐘；1輪，72℃5分鐘。
C.gtfPCR產物克隆入pCKZEBB用XbaI和EcoRV消化表達載體pCKZEBB和PCR拯救的改組的糖基轉移酶基因。載體pCKZEBB另外脫去磷醯基。從瓊脂糖凝膠中分離得到載體片段和編碼糖基轉移酶的PCR片段，並彼此連接。
用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌TG1，接種於含30微克/毫升氯黴素、1％葡萄糖的LB-瓊脂中37℃振搖1小時後，37℃培養過夜。
D.糖基轉移酶文庫的預篩選、主平板的產生和表達將菌落挑入LB-Cam-葡萄糖平板中，並在37℃ON培養，產生主平板。從主平板上將菌落排列到LB-Cam-Agar上，37℃培育平板過夜。將平板暴露於365納米紫外線中，鑑定綠色螢光菌落。將主平板的各綠色螢光菌落重新排列在96孔平板上，該平板各孔中裝有100微升2YT-Cam30-1％葡萄糖，37℃培養過夜。將50微升培養物轉移到1毫升2YTCam30-1毫克/毫升生物素中，16℃培養7小時。然後加入50微升100微摩爾IPTG，16℃培育培養物過夜。
E.用溶菌酶和硫酸多粘菌素B的組合裂解細胞離心培養物(4000rpm15分鐘)沉澱細胞。用500微升50mM甲酸銨(pH7.4)洗滌細胞沉澱，再沉澱一次。將細胞重懸於300微升裂解緩衝液(10微升Ready to Lyse溶菌酶)(Epicentre)、2微升RNaseA(Qiagen)、2微升DNAse I(Boehringer)、2微升1M MgSO4中，10毫升含1毫克/毫升硫酸多粘菌素B(sigma)的溶液、2mM DTT的50mM甲酸銨(pH7.4)的溶液，環境溫度攪拌30分鐘。然後離心(15分鐘，4000rpm)澄清裂解液。
F.用磁珠從單克隆純化蛋白質將鏈黴親和素包裹的磁珠排列在96孔板中。洗滌磁珠，用珠的磁性和緩衝液(50微摩爾甲酸銨，pH7.4，2mM DTT)洗滌珠，重懸於每孔20微升緩衝液中。將澄清的細胞裂解液(100微升)轉移到裂解平板的珠中，在環境溫度下培育15分鐘。然後用緩衝液(150微升)洗滌5次，最後重懸於20微升緩衝液中。
G.用文庫中的糖基轉移酶進行化合物的體外修飾將反應混合物(80微升)加到珠上的純化蛋白質中，環境溫度攪拌珠過夜。反應混合物含有150微摩爾萬古黴素苷元(如J.Chem.Soc.ChemCommun.(1988)1306-1307所述合成)、500微摩爾UDP葡萄糖、2mM DTT的50微摩爾甲酸銨pH7.4溶液。加入1體積甲醇淬滅反應，離心混合物(2000rpm5分鐘)。將上清液(100微升)移到新的96孔板中，進行質譜分析。
H.測量糖基化的發生將淬滅的反應混合物(10微升)注入正模式的三重四極電噴質譜儀裝置中。使分子性離子通過第一個四極(萬古黴素苷元為1143amu，去萬古胺萬古黴素為1305amu)，在第二個四極中進行碰撞，然後在第三個四極中檢測100amu的子代離子峰。該過程獲得的峰的積分與形成的產物直接成比例。這確定了文庫克隆在產生去萬古胺萬古黴素中的相對合理性。
I.過程的重複使用如需要，這些步驟可重複。例如，可用多個編碼特定衍生性酶的變體的基因，用從一個文庫獲得的單個基因，用回交的野生型基因改組的單個基因，用每個基因都編碼具有不同活性的酶的多個基因重複步驟B-H。
在此過程的變化中，可將步驟G中的UDP-葡萄糖用其它NDP-糖取代。調整了步驟H中的MS參數，以檢測預計的分子性離子。
實施例2用於產生甲紅黴素的甲基轉移酶文庫的產生和紅黴素6-O-甲基轉移酶的演化該實施例描述了重組O-甲基轉移酶(OMT酶)文庫的產生和該文庫的酶對合成甲紅黴素(6-O-甲基紅黴素)衍生物的用途。
已顯示具有6-甲氧基的紅黴素同類物家族具有有用的藥物學性質。這些化合物現在是通過多步化學甲基化紅黴素A及其同類物製備的(
圖11)。能選擇性的將活化的甲基轉移到6-羥基的酶能一步高產量的在體內或作為一次生物轉化在體外生產這類紅黴素同類物。本實施例描述了獲得這些甲基轉移酶的方法。
此時未檢測到紅黴素6-OMT酶活性。因此必需建立一種新特異性的OMT酶。如果此文庫的序列多樣性源自天然存在的序列，而不是隨機點突變，通過抽取改組文庫104-105個成員的樣品，大大提高了發現新活性的機會。這樣的文庫跨越更大部分的序列空間含有豐富的功能性序列。因此，採用編碼(能特異性甲基化類似於紅黴素6-羥基的底物的)OMT酶的同源基因家族進行DNA改組。由於不能確定該家族的那個成員在產生6-OMT酶活性中更加強影響，製備了各種改組文庫。例如，對各亞家族單獨改組，或整個家族一起改組。這可用幾種改組方式(設計用於影響高序列相同性和低序列相同性的基因重組)實現。
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依賴性甲基轉移酶(MT)構成了一類酶，它們能形成蛋白質、核酸、糖、多糖、脂類、木質素和各種低分子量化合物(如大環內酯)的甲基酯、甲基醚、甲基硫醚、甲基胺和甲基醯胺衍生物。SAM攜帶著能有效轉移到具有廣譜化學反應性的親核試劑上的活化甲基。該活化的甲基從SAM轉移到接受體的親核試劑是熱力學理想的，因此能驅動此甲基轉移反應至基本完成(
圖12)。已知7個基因家族編碼的SAM-依賴性OMT酶，對碳黴素、麥迪黴素、番紅黴素(saframycin)、雷帕黴素、利福黴素和FK506的仲醇有特異性(
圖13)。這些底物親核試劑與紅黴素A的6-羥基比較，提示親代OMT酶接受紅黴素作為底物只需要對局部特性上作極小的調整。其它感興趣的基因是編碼ERYG的基因，它O-甲基化紅黴素C的碳黴糖基團，導致合成紅黴素A。EryG在DNA水平上與rapQ共有54％的相同性，可能提供了含有叔醇OMT酶活性的其它OMT酶亞家族(
圖14)。
待改組的基因可從基因組DNA或PCR合成的寡核苷酸合成。然後將這些基因克隆入合適的載體，用於表達。編碼碳黴素-4-OMT酶的基因的完整序列未知，但是可克隆該基因，或用其它OMT酶的全序列改組其部分序列。
產生了幾個SAM依賴性OMT酶的文庫。針對紅黴素A及其同類物篩選這些文庫的6-OMT酶活性。合併已鑑定的克隆並進一步演化，將酶改進到實用活性水平。
通常須篩選該改組家族的104-105個克隆，以鑑定具有去氧紅黴素(deserythormycin)6-OMT酶活性的克隆。在去氧紅黴素A的存在下培養細胞培養物，然後取出這些培養物的上清液，檢測6-O-甲基去氧紅黴素A肟的存在。將OMT酶基因與已鑑定的克隆相分離，合併，改組，然後篩選活性提高的去氧紅黴素A 6-OMT酶。繼續進行另一輪改組和篩選，直到酶活性達到適用於生產6-O-甲基去氧紅黴素的水平。
為了確保對有用活性的鑑定，可篩選此改組文庫針對紅黴內酯B、去氧紅黴素A、紅黴素A及其肟衍生物的6-OMT酶活性。雖然可能在原始文庫中檢測不到去氧紅黴素A肟6-OMT酶活性，但具有其它6-OMT酶活性的克隆可能存在。然後這些克隆可用於下面輪次的改組，以進一步定製6-OMT酶的特異性。例如，如果檢測到對紅黴素A有活性，可首先篩選後面文庫對去氧紅黴素A的活性，最後篩選對去氧紅黴素肟的活性。用該方法預計從每個新文庫僅產生專一性的精細改變。
基因和文庫產生分離得到了編碼麥迪黴素3』O-甲基轉移酶(mdmC)、黃樟黴素(safromycin)O-甲基轉移酶(safC)、雷帕黴素31-O-甲基轉移酶(rapI)和FK506 31-O-甲基轉移酶(fkbM)(
圖13)的開放閱讀框的基因，將其克隆入合適的大腸桿菌表達載體(pET22B(+))中。對這些基因(相同性範圍是50-80％)然後進行家族改組，改組產生一個編碼嵌合性O-甲基轉移酶(OMT酶)的基因文庫。將此文庫克隆回表達載體，在合適的大腸桿菌宿主(BL21(DE3))中表達。現在可篩選該文庫中具有新特性的嵌合酶，如對於目標甲基化的新特異性。
OMT酶活性的遺傳篩選可以高通量用以下試驗測量OMT酶活性。該試驗能測量(3H)S-腺苷甲硫氨酸放射性標記的甲基轉移到轉移到所需的供體分子(見
圖15)。此試驗是依據標記的甲基從帶電荷高的分子(SAM)轉移到更疏水的分子(
圖12)。用有機溶劑抽提反應物，使未反應的SAM留在水相中，而甲基化的底物選擇性地抽提入有機相。然後測量有機相中的放射性含量。該試驗的優點是一般它可用於可抽提的底物，非常高通量，可用於同時對化合物集合的活性作篩選。方法如下淺青紫鏈黴菌(Streptomyces lividans)是一種特別合適的宿主，有至少兩個理由第一，它可用從大腸桿菌分離的質粒DNA高效轉化。第二，它對紅黴素及其同類物是可滲透的，所以可試驗全細胞而不是裂解液。另外，可用高通量形式測量大腸桿菌或枯草桿菌細胞抽提物的酶活性。將純化的酶或細胞裂解液加到50mM磷酸緩衝液，pH7.5(含有0.4mM MgSO4、0.1mM DTT、0.1mM(3H)S-腺苷甲硫氨酸和1-10mM靶底物)的試驗混合物中。培育後，加入乙酸乙酯淬滅反應。取出有機相的樣品(50微升)，與閃爍試劑(150微升)混合，用96孔閃爍計數儀測量放射性。放射活性高於沒加酶的對照樣品的樣品克隆，視為陽性，可在更好的定量試驗中進一步研究。
甲紅黴素合成酶的演化甲紅黴素是6-O-甲基紅黴素。目前製備甲紅黴素的方法是紅黴素的7步化學甲基化。能一步進行該化學反應的酶可能提供一種通過發酵或生物轉化製備甲紅黴素的方法(見
圖16)。為了建立這樣的酶，篩選OMT酶文庫的紅黴素6-O-甲基化活性。
將改組的OMT酶文庫接種在固態培養基上，以分離各克隆。將各克隆挑入含有LB培養液(200微升)和氨苄青黴素(100微克/毫升)的96孔平板中。30℃培養平板10小時，或直到培養物達到0.7的光密度。加入0.1mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，以誘導MT酶的表達，細胞再培養3個小時。離心平板，丟棄上清。將細胞沉澱重懸於50mM磷酸緩衝液配的pH7.5裂解緩衝液(200微升)中，該緩衝液含有1mM EDTA、1mM DTT、2微克/毫升的硫酸多粘菌素B和1毫克/毫升T4溶菌酶。反應物30℃培育15分鐘。
用96頭液體搬運站(如MultimekTM)將各孔(20微升)樣品轉移到含有甲紅黴素合成試驗緩衝液(280微升)的96深孔平板中。此緩衝液是50mM磷酸緩衝液，pH7.5，含有0.4mM MgSO4、0.1mM DTT、0.1mM(3H)S-腺苷甲硫氨酸和1mM紅黴素。反應物30℃保溫1小時。在各孔中加入乙酸乙酯(300微升)，劇烈振搖平板，離心，取出上面有機相中的樣品(50微升)，加到含有閃爍液(150微升)的平板中。然後用平板閃爍計數器閱讀此平板。與攜帶親代基因或無MT酶基因的樣品相比，有機相中有放射性的樣品可能含有能將甲基轉移到紅黴素上的酶。因為在紅黴素上有5個可轉移甲基的羥基，必須分辨其是否轉移到6-羥基上。
甲紅黴素合成酶的二次試驗甲紅黴素的二次試驗是以用硼酸苯酯化學修飾，並用質譜分析為基礎的。紅黴素可以在5個位置(大環內酯環的6、11或12位，或在克拉定糖或脫氧糖胺上)被O-甲基化。硼酸苯酯可專一性的與順式二醇結合，例如紅黴素的11，12二醇。因此如果硼酸苯酯與酶促產生的甲基化紅黴素結合，此甲基不可能位於11或12位。為了測定修飾的紅黴素是否是甲紅黴素，進行了下列試驗。
如上所述進行了紅黴素的酶促反應甲基化，除了修飾用的SAM未放射性標記外，一細胞的抽提物顯示放射性試驗陽性。從反應混合物抽提後，用二維質譜(MS/MS)分析有機相，其中親低離子片段化成亞分子片段(見
圖17)。
甲紅黴素具有陽離子分子量748.48，帶正電是因為脫氧糖胺的胺質子化。甲紅黴素陽離子片段化後，克拉定糖和脫氧糖胺可與大環內酯環相分離，然而僅檢測到含有脫氧糖胺的分子，因為它們帶有胺。748.48離子的片段化得到兩個不同的新離子590.4和158.12。590離子是6-O-甲基去氧紅黴素A(缺乏克拉定糖基團的甲紅黴素)。158.12離子是脫氫脫氧糖胺，除去大環內酯環5-羥基的結果。具有590和158離子的748.48峰的MS/MS質譜不同於大環內酯環上(即在6、11或12位)甲基化的紅黴素衍生物。如果樣品顯示該質譜，那麼須作進一步分析以確定是否它是6位甲基化的。用過量硼酸苯酯在中性條件下處理此有機抽提物，然後用質譜分析。如果只在6位修飾，11和12位游離可形成與硼酸苯酯的加合物。因此，834.52離子，甲紅黴素硼酸苯酯加合物的存在表明樣品含有甲紅黴素，以及對應的克隆編碼紅黴素6-O-甲基轉移酶。
應理解本文所述的例子和實施例僅為了說明，以此為根據本領域技術人員可提出各種修改或改變，這些修改和改變均包括在申請和權利要求範圍內的精神和預測中。本文引用的所有出版物、專利和專利申請在此引入以供參考。
權利要求
1.一種獲得有機分子衍生物文庫的方法，其特徵在於，該方法包括使有機分子與重組衍生性酶文庫的一個或多個成員以及其它必需的反應物接觸，形成有機分子衍生物文庫，其中衍生性酶催化選自以下的反應a)修飾一個或多個存在於有機分子上的官能團；b)在存在於有機分子上的一個或多個官能團上加上化學基團；和c)引入新的官能團。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該方法還包括將所述有機分子衍生物文庫與第二個重組衍生性酶文庫以及其它必需的反應物接觸，形成另一個有機分子衍生物文庫，其中第二個文庫的衍生性酶催化選自以下的反應a)修飾一個或多個官能團；b)在一個或多個官能團上加上化學基團；和c)引入新的官能團。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，第二個文庫的衍生性酶在被第一個文庫的衍生性酶修飾或加上的官能團上，催化修飾或加上一個化學基團。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在與重組衍生性酶文庫接觸後，還通過化學或酶促反應對該有機分子衍生物文庫的一個或多個成員進行衍生。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，通過改組方法獲得此重組衍生性酶文庫。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述改組方法包括(1)重組至少第一和第二種形式的編碼衍生性酶的核酸來產生重組多核苷酸文庫，所述第一和第二種形式的核酸彼此有兩個或多個核苷酸不同；和(2)表達該重組多核苷酸的文庫，獲得重組衍生性酶文庫。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，重組步驟在體外進行。
8.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，該方法還包括(3)重組編碼該重組衍生性酶文庫一個成員的至少一種重組多核苷酸和另一種編碼衍生性酶的核酸，所述核酸可以與第一和第二種形式相同或不同，來產生另一個重組核酸文庫；(4)表達另一個重組多核苷酸文庫，獲得另一個重組衍生性酶文庫；和(5)如需要重複(3)和(4)，直到另一個重組衍生性酶文庫含有所需數量的不同重組衍生性酶。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，該方法中至少一個重組步驟是在體外進行的。
10.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述改組方法包括(1)在一群不同多核苷酸的重疊區段上，引發多核苷酸擴增過程，條件是一個區段作為另一個區段延伸的模板，來產生一群重組多核苷酸；和(2)選擇或篩選有所需特性的重組多核苷酸。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，重疊區段是通過切割該變種多核苷酸群產生的。
12.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，切割是通過DNase I消化。
13.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，重疊區段是通過化學合成產生的。
14.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，重疊區段是通過擴增所述多核苷酸群產生的。
15.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述變種多核苷酸群是等位基因的變體。
16.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述變種多核苷酸群是種間變體。
17.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述改組方法包括(1)雜交至少兩組核酸，其中第一組核酸含有單鏈核酸模板，第二組核酸含有至少一組核酸片段；和(2)延伸、連接或同時延伸和連接雜交核酸片段之間的缺口，產生至少基本全長的對應於單鏈核酸模板的嵌合性核酸序列，從而重組了該組核酸片段。
18.如權利要求17所述的方法，其特徵在於，該方法還包括(3)使至少基本全長的嵌合性核酸序列和單鏈核酸模板變性；(4)通過至少一種分離技術，將至少基本全長的嵌合性核酸序列與單鏈核酸模板相分離；和用核酸酶消化或物理片段化使分離的至少基本全長的嵌合性核酸序列片段化，得到嵌合性核酸片段。
19.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述有機分子是前導化合物。
20.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述有機分子是天然存在的化合物。
21.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述有機分子是非天然存在的化合物。
22.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，使重組衍生性酶文庫的成員與有機分子各個接觸。
23.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該重組衍生性酶文庫的成員在與有機分子接觸前細分成多個庫。
24.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，重組衍生性酶文庫的成員以重組衍生性酶的混合物與該有機分子接觸。
25.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，通過將重組多核苷酸引入可複製遺傳包裝載體中來表達此重組多核苷酸，從而產生其編碼的重組衍生性酶，作為與展示在可複製遺傳包裝表面的蛋白質相融合的蛋白。
26.如權利要求25所述的方法，其特徵在於，可複製遺傳包裝選自噬菌體、細胞、孢子和病毒。
27.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述衍生性酶催化有機分子上一個或多個官能團的修飾或用另一個官能團代替一個或多個官能團。
28.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述官能團是氫，取代是用羥基取代。
29.如權利要求28所述的方法，其特徵在於，衍生性酶選自單氧化酶和二氧化酶。
30.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，衍生性酶催化在有機分子中引入新的官能團。
31.如權利要求30所述的方法，其特徵在於，衍生性酶選自滷化酶和磺基轉移酶。
32.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述衍生性酶能催化在一個或多個官能團上加上一化學基團。
33.如權利要求32所述的方法，其特徵在於，所述衍生性酶選自糖基轉移酶、醯基轉移酶、醯胺酶、甲基轉移酶和磷酸轉移酶。
34.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，所述衍生性酶是醯基轉移酶，所述化學基團選自乙烯酯、三滷乙基、酯、羧酸乙烯酯、氨基甲酸乙烯酯、肟酯、羧酸肟和雙功能基團。
35.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，所述衍生性酶是糖基轉移酶，所述化學基團選自糖苷、氨基糖苷和糖苷酸。
36.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，所述衍生性酶是糖基轉移酶，所述有機分子選自無糖基萬古黴素HCl、促生長素抑制素、膽酸、L-甲狀腺素、諾加黴素、丁香醛連氮、阿柔比星、鹽酸羥苄羥麻黃鹼、利福黴素和瑞斯託黴素。
37.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，所述衍生性酶是O-甲基轉移酶，所述有機分子是紅黴素。
38.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，所述衍生性酶是醯胺酶，所述化學基團選自醯胺和肽。
39.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該方法還包括篩選有機分子衍生物文庫，以鑑定顯示所需特性的那些有機分子衍生物。
40.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所需特性是與靶分子結合。
41.如權利要求40所述的方法，其特徵在於，所述靶分子選自受體、信號蛋白和配體。
42.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，該方法還包括篩選重組衍生性酶文庫，以鑑定能催化有機分子修飾的成員，其可賦予產生的有機分子衍生物所需特性。
43.一種獲得能催化所需有機分子衍生物合成的酶的方法，其特徵在於，該方法包括使有機分子與重組衍生性酶文庫的成員和其它必需反應物接觸，形成有機分子衍生物文庫；在有機分子衍生物文庫中鑑定所需的有機分子衍生物；和鑑定能催化所需有機分子衍生物合成的重組衍生性酶文庫的成員。
44.如權利要求43所述的方法，其特徵在於，使重組衍生性酶文庫的成員分別與有機分子接觸。
45.如權利要求43所述的方法，其特徵在於，將重組衍生性酶文庫的成員在與有機分子接觸前細分成多個庫。
46.一種重組衍生性酶文庫，其特徵在於，當該重組衍生性酶與具有一個或多個官能團的有機分子接觸時，能催化選自以下的反應a)修飾一個或多個官能團；b)在一個或多個官能團上加上化學基團；和c)引入新的官能團。
47.如權利要求46所述的文庫，其特徵在於，重組衍生性酶各含有多個胺基酸組件，所述組件在天然存在的衍生性酶中是不鄰接的。
48.如權利要求47所述的文庫，其特徵在於，重組衍生性酶各含有多個胺基酸組件，所述組件起源於兩個或多個衍生性酶的同源物。
49.一種有機分子衍生物文庫，其特徵在於，該文庫是通過使具有一個或多官能團的有機分子與多個重組衍生性酶文庫的成員接觸而經生物催化合成的，所述重組衍生性酶文庫成員能催化選自以下的反應a)修飾一個或多個官能團；b)在一個或多個官能團上加上化學基團；和c)引入新的官能團。
50.如權利要求49所述的文庫，其特徵在於，所述重組衍生性酶是通過以下獲得的重組至少第一和第二種形式的編碼衍生性酶的核酸，其中第一和第二種形式彼此至少有兩個或多個核苷酸不同，來產生重組多核苷酸文庫；和表達所述重組多核苷酸文庫，獲得重組衍生性酶文庫。
全文摘要
本發明提供了重組衍生酶文庫,這些酶可用於生物催化合成有機分子的衍生物,包括藥用前導化合物。該重組衍生性酶能催化有機分子上官能團的修飾或置換等反應,或在已存在的官能團上加上化學基團。使用重組酶文庫能獲得催化有機分子衍生物形成的酶,這種衍生物僅用天然存在的酶是不能產生的。
文檔編號C12N15/52GK1378598SQ00811801
公開日2002年11月6日 申請日期2000年8月11日 優先權日1999年8月12日
發明者C·克雷布爾, S·C·戴維斯, S·德爾卡德雷, S·A·塞利馮弗, R·霍華德, 劉璐 申請人:麥克西根股份有限公司